王遠一飛,丁 武,宋瑩瑩,黃亞萍

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

殼聚糖黃原膠鼠李糖乳桿菌微膠囊的制備及其特性的研究

王遠一飛,丁 武*,宋瑩瑩,黃亞萍

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

本研究利用殼聚糖和黃原膠作為壁材,用乳化法包埋鼠李糖乳桿菌,以包埋率為指標,探究其最佳的制備工藝,發(fā)現(xiàn)當殼聚糖濃度為0.8%,黃原膠濃度為1.0%,轉(zhuǎn)速為900 r/min時效果最佳,最佳包埋率為88.9%。制備的微膠囊粒徑在300 μm左右,分布較為均勻。在模擬胃液和模擬膽液中靜置2 h后仍分別有3.56 lg CFU/mL和3.4 lg CFU/mL活菌體,表明其對菌體有較強的保護作用。

殼聚糖,黃原膠,鼠李糖乳桿菌,微膠囊,包埋

鼠李糖乳桿菌是由美國科學家在20世紀80年代從健康人的腸道中分離出的一種益生菌[1],屬于第三代益生菌,也是全球迄今為止研究最多的一種益生菌[2]。國內(nèi)外文獻報道表明,該菌種具有緩解乳糖不耐癥,平衡腸道菌群,抑制有害菌,降低膽固醇和血氨,提高機體的免疫力和抗癌作用等,對人體有極好的生理保健功能[3-4]。但要讓鼠李糖乳桿菌在人體真正發(fā)揮自身功效,就必須保證有一定數(shù)量的菌體經(jīng)過人體消化道,成功到達腸道[5]。雖然鼠李糖乳桿菌相對于其他益生菌更能耐受動物消化道的酸環(huán)境,在人或動物腸道內(nèi)定殖起到益生作用[6],但在經(jīng)過低pH的胃環(huán)境以及受到膽鹽毒害時依然會遭到嚴重破壞或其活性受到嚴重抑制,從而大大降低了鼠李糖乳桿菌的活性以及到達腸道中菌體的數(shù)量[7]。因此,如何在保證鼠李糖乳桿菌活性的情況下使其能夠更多地進入到腸道,成為了問題的關鍵。近幾年,隨著微膠囊技術在食品行業(yè)中的發(fā)展,利用微膠囊技術將益生菌包埋,則能夠大大提高菌體的耐受性,從而解決這一問題[8-11]。

目前,微膠囊制備方法有200多種,常見的有乳化交聯(lián)法、噴霧成型法和擠壓法[12]。趙洪磊等[13]利用壓力法制備了嗜酸乳桿菌微膠囊,但微膠囊粒徑過大,不便于應用于市場。相對于其他方法,乳化法制備得到的益生菌微膠囊具有粒徑小,表面致密,且易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的特點[14]。因此本實驗選用乳化法制備鼠李糖乳桿菌微膠囊,采用了對人體完全無害的殼聚糖和黃原膠作為壁材,利用其在水溶液中發(fā)生聚電解質(zhì)絡合作用形成共混凝膠的原理包埋益生菌[15],以包埋率為指標,探究了鼠李糖乳桿菌微膠囊的最佳制備工藝,并對其抵抗胃酸、膽汁的特性以及在腸道中的釋放情況作了探究,為鼠李糖乳桿菌微膠囊產(chǎn)品的開發(fā)和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌 本實驗室保藏;殼聚糖 阿拉丁試劑(上海)有限公司,脫乙酰度≥95;黃原膠 內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司,食品級;胰蛋白酶 Amresco公司,1∶250;胃蛋白酶 Amresco公司,1∶3000;牛膽鹽 北京奧博星生物技術有限責任公司,膽酸含量>60%;MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術股份有限公司;大豆油 中糧佳悅有限公司,一級;模擬腸液(解囊液) 0.68%的磷酸二氫鉀溶液調(diào)pH至6.8和1%的胰蛋白酶1∶1混合;模擬胃液 1%的胃蛋白酶溶液調(diào)pH至1.5;模擬膽液 1%的牛膽鹽溶液;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

85-2A恒溫測速磁力攪拌器 金壇市榮華儀器制造有限公司;SZX7變焦距實體顯微鏡 奧林巴斯;Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡 Hitachi。

1.2 實驗方法

1.2.1 微膠囊的制備

1.2.1.1 菌種活化及菌懸液的制備 取甘油保存的鼠李糖乳桿菌平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取生長旺盛的菌落于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h。以3%的接種量傳代培養(yǎng)三次。取3%活化好的菌液于MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)15 h,完成活化。取10 mL充分活化的菌液8000 r/min離心10 min,棄去上清。用1 mL生理鹽水吹打均勻后備用。

1.2.1.2 乳化液的制備 稱取一定量的黃原膠,置于80 ℃的水浴鍋溶解30 min后冷卻至室溫。取一定量黃原膠與濃縮菌液混合均勻,用注射器吸取混合后的菌膠溶液,快速加入大豆油中,高速攪拌20 min,充分乳化。

1.2.1.3 微膠囊的制備 稱取一定量的殼聚糖,溶解于30%的0.5 mol/L醋酸溶液中,調(diào)pH至5.0,加蒸餾水定容。量取30 mL殼聚糖溶液并置于磁力攪拌器上勻速攪拌,用注射器吸取10 mL乳化液快速加入殼聚糖溶液中,攪拌1 h后,過夜靜置。

1.2.2 實驗設計

1.2.2.1 單因素實驗 根據(jù)預實驗,以微膠囊成囊性為依據(jù),選擇可以成囊且微粒較為均勻的條件制備,發(fā)現(xiàn)在乳化液體系為30 mL油膠比為3∶1時,乳化液整體呈乳白色,短時靜置不會分層,乳化效果良好;在膠囊液為40 mL體系乳化液與殼聚糖比為1∶3時膠囊成囊性較好,顆粒均勻,絮狀物少或無,膠囊密度較高,故選作固定條件。其他條件為:固定黃原膠濃度為1.2%,轉(zhuǎn)速為1300 r/min,考察不同殼聚糖濃度(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)對包埋率的影響;固定殼聚糖濃度為1%,轉(zhuǎn)速為1300 r/min,考察不同黃原膠濃度(0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)對包埋率的影響;固定殼聚糖濃度為1%,黃原膠濃度為1.2%,考察不同轉(zhuǎn)速(900、1100、1300、1500 r/min)對包埋率的影響。

1.2.2.2 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇L9(34)正交表,具體因素水平如表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.3 包埋率的測定 將過夜靜置的膠囊液全部裝入離心管內(nèi),6000 r/min離心10 min,棄去上清液,用生理鹽水沖洗1次,再5000 r/min離心10 min,取下層膠囊,用20 mL解囊液吹打懸浮各管內(nèi)的膠囊,置于37 ℃環(huán)境下180 r/min解囊2 h,再將解囊液稀釋涂布,37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

包埋率(%)=(解囊液菌落數(shù)/制備微膠囊的原菌液菌落數(shù))×100

1.2.4 微膠囊的外觀形態(tài)觀察 變焦距實體顯微鏡觀察:用膠頭滴管吸取少量微膠囊,均勻滴在載玻片上,置于變焦距實體顯微鏡上觀察記錄。

掃描電鏡觀察:用膠頭滴管吸取少量微膠囊,均勻滴在圓形蓋玻片上,自然干燥完全后,噴金觀察記錄。

1.2.5 耐胃酸實驗 稱取2 g鼠李糖乳桿菌微膠囊放入盛有20 mL人工胃液的離心管,將離心管放在37 ℃、180 r/min的恒溫搖床中,在0、0.5、1.0、1.5和2.0 h時5000 r/min離心5 min收集下層膠囊,之后置于裝有20 mL解囊液的離心管中37 ℃解囊2 h,待菌體完全釋放后涂布計數(shù)。另外,取2 g空膠囊和游離菌體作對照實驗。

1.2.6 耐膽鹽實驗 稱取2 g鼠李糖乳桿菌微膠囊放入盛有20 mL人工膽液的離心管,將離心管放在37 ℃、180 r/min的恒溫搖床中,在0、0.5、1.0、1.5和2.0 h時5000 r/min離心5 min收集下層膠囊,之后置于裝有20 mL解囊液的離心管中37 ℃解囊2 h,待菌體完全釋放后涂布計數(shù)。另外,取2 g空膠囊和游離菌體作對照實驗。

1.2.7 腸溶性實驗 稱取2 g鼠李糖乳桿菌微膠囊放入盛有20 mL人工腸液的離心管,對照組用生理鹽水代替人工腸液解囊,將離心管放在37 ℃、180 r/min的恒溫搖床中,分別在0.5、1.0、1.5、2.0 h時置于光學顯微鏡下觀察微膠囊形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel作圖,用Minitab 16.2.3處理數(shù)據(jù)分析其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊的制備工藝的優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗

2.1.1.1 殼聚糖濃度對包埋率的影響 由圖1可知,包埋率隨著殼聚糖濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在0.8%時達到最大值,隨后迅速下降。分析其原因,可能是由于殼聚糖濃度較低時,微膠囊表面膜層不容易形成,且形成的膜所需時間較長,受到磁力攪拌器的機械傷害較大,微膠囊容易在攪拌過程中破損,導致包埋率較低;當殼聚糖濃度較高時,形成的微膠囊表面膜層較厚且較致密,在解囊液中不容易釋放菌體,故包埋率較低。所以,殼聚糖濃度應該控制在0.6%～1.0%之間包埋率較高。

圖1 殼聚糖濃度對包埋率的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on the rate of encapsulation

2.1.1.2 黃原膠濃度對包埋率的影響 由圖2可知,包埋率隨著黃原膠濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在達到1%時包埋率達到最大值,隨后迅速下降。分析其原因,可能是由于黃原膠濃度過低,微膠囊表面膜層不容易形成,且形成的膜層較薄較疏松,受到磁力攪拌器機械傷害較大,微膠囊容易在攪拌、收集過程中破損,導致包埋率較低;黃原膠的濃度較高時,類似于殼聚糖濃度較高時的模型,微膠囊的表面膜層較厚且較致密,在解囊液中不容易釋放菌體,故包埋率較低。所以,黃原膠濃度應控制在0.8%～1.2%之間包埋率較高。

圖2 黃原膠濃度對包埋率的影響Fig.2 Effect of xanthan gum concentration on the rate of encapsulation

2.1.1.3 轉(zhuǎn)速對包埋率的影響 由圖3可知,隨著轉(zhuǎn)速增加,包埋率呈下降趨勢,在900 r/min時包埋率最高,然后隨即下降。分析其原因,可能是由于轉(zhuǎn)速越快,微膠囊外形粒徑越小(此結(jié)論在預實驗中已得知),數(shù)量越多,但微膠囊間碰撞越頻繁,在微膠囊表面附著或包埋在微膠囊表層的益生菌容易被甩出或由碰撞擠出,導致包埋率過低;而轉(zhuǎn)速越慢,微膠囊粒徑越大,在實際應用中有較大局限性。所以,考慮到微膠囊的實際使用價值和包埋率應較高的原則,轉(zhuǎn)速應選擇在900～1300 r/min時最佳。

圖3 轉(zhuǎn)速對包埋率的影響Fig.3 Effect of rotational speed concentration on the rate of encapsulation

2.1.2 正交實驗 正交實驗結(jié)果如表2所示。

表2 正交實驗設計及結(jié)果

根據(jù)表2可知,各因素的極差R從大到小的順序為C>A>B>D,D為空列,由此可知影響鼠李糖乳桿菌微膠囊制備的因素按主次順序排列為C>A>B,即對鼠李糖乳桿菌微膠囊制備影響最大的是轉(zhuǎn)速,其次是殼聚糖濃度,黃原膠濃度的影響最小。最優(yōu)組合為A2B2C3,即殼聚糖濃度為0.8%,黃原膠濃度為1.0%,轉(zhuǎn)速為900 r/min,最佳包埋率為88.9%。再對實驗結(jié)果進行方差分析,具體結(jié)果如表5所示。

注:*差異顯著(p<0.05),**差異極顯著(p<0.01)。

由方差分析結(jié)果可以看出,因素C的p<0.01,則磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速對微膠囊制備的實驗指標的影響極顯著;因素A的0.010.05,則黃原膠濃度對微膠囊制備的實驗指標的影響不顯著。

2.2 微膠囊的外觀形態(tài)

微膠囊的粒徑和分布是微膠囊特性的一個重要指標,它不僅影響微膠囊的緩釋性能,也影響微膠囊的保護作用。由圖4～圖6可知,用該方法制得的微膠囊外形近球形,分布均勻,粒徑大小約300 μm,符合微膠囊粒徑基本要求[16]。

圖4 變焦距實體顯微鏡觀察結(jié)果(200×)Fig.4 Zoom stereo-microscope of microcapsules(200×)

圖5 微膠囊解剖照片(100×)Fig.5 Microcapsules anatomy photo(100×)

圖6 干燥后微膠囊的掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.6 Scanning electron micrographs of dried microcapsules

2.3 耐胃酸實驗

如圖7所示,未經(jīng)包埋的菌懸液和微膠囊的菌落數(shù)在0.5 h內(nèi)都在高速下降,原因可能是在前0.5 h內(nèi),微膠囊處于暴釋階段[17],在微膠囊表面吸附的菌體都在短時間內(nèi)分散到模擬胃液中,從而受到強酸環(huán)境的破壞。在1.5 h時菌懸液中僅存在少量活菌體。在2 h時,菌懸液中未檢測出活菌體,而微膠囊中還有3.56 lg CFU/mL數(shù)量活菌。這說明人工胃液的所造成的酸環(huán)境只能對裸露在其中的菌體造成較大破壞,對包埋在微膠囊內(nèi)的菌體破壞較小,微膠囊在一定程度上保護了菌體。

圖7 微膠囊在人工胃液中的耐受性Fig.7 Tolerance of microcapsules in artificial gastric juice

2.4 耐膽鹽實驗

膽鹽是一種陰離子型表面活性劑,能夠破壞細胞膜結(jié)構(gòu),產(chǎn)生氧化損傷,從而使得益生菌細胞致死,因此在人體胃腸道中,小腸上部的高膽鹽環(huán)境也是影響益生菌存活率的主要因素[18-19]。如圖8所示,未經(jīng)包埋的菌懸液的菌落數(shù)在模擬膽液中一直以較快速度下降,在1 h時就下降了6 lg CFU/mL,而微膠囊下降了不到5 lg CFU/mL。在2 h時菌懸液中未檢測出活菌體,而微膠囊中還存在3.4 lg CFU/mL數(shù)量活菌。這說明人工膽液主要對裸露的菌體造成較大破壞,對被微膠囊包埋的菌體破壞較小,微膠囊在一定程度上保護了菌體。

圖8 微膠囊在人工膽液中的耐受性Fig.8 Tolerance of microcapsules in artificial bile

2.5 腸溶性實驗

微膠囊對益生菌的包埋效果不僅僅是指微膠囊對其在模擬胃液中的進行保護,還體現(xiàn)在微膠囊在進入腸道之后逐步發(fā)生降解,將其包埋的活菌在大腸中進行靶向釋放,才能起到將活菌載運并定殖于大腸處的作用[20-21]。如圖9所示,殼聚糖黃原膠微膠囊在人工腸液中0.5 h時表面明顯變薄,部分膠囊出現(xiàn)凹洞,表明其已經(jīng)開始解囊,1.0 h時解囊效果良好,部分膠囊已經(jīng)成碎片狀,2.0 h時幾乎全部解囊,肉眼看不見球狀微膠囊,說明該微膠囊腸溶性良好。對照組中微膠囊無明顯變化。

圖9 微膠囊腸溶性照片(100×)Fig.9 Microcapsules enteric photo(100×)注:(a)微膠囊在人工腸液中0.5 h;(b)微膠囊在人工腸液中1.0 h;(c)微膠囊在人工腸液中2.0 h。

3 結(jié)論

本研究得到最佳制備條件為殼聚糖濃度0.8%,黃原膠濃度1.0%,轉(zhuǎn)速900 r/min,最佳包埋率可高達88.9%。用此法制備的微膠囊粒徑為300 μm左右,外形近球形,分布均勻。微膠囊在胃酸中2 h,還有3.56 lg CFU/mL數(shù)量活菌,在膽液中2 h,還有3.4 lg CFU/mL數(shù)量活菌,表明其有較好的抵抗胃酸和膽鹽的能力,可以起到保護芯材益生菌的效果,且其在模擬腸液中腸溶性良好,2 h左右即可全部解囊釋放。用該方法制得的微膠囊能滿足一定的市場要求,為進一步開發(fā)益生菌微膠囊產(chǎn)品在食品中的應用打下了基礎。

[1]馬鵬飛,陳有亮,金鳥君. 鼠李糖乳桿菌功能特性的研究進展[J]. 科技通報,2009(2):202-206.

[2]賀璟,聶乾忠,鄧潔紅. 鼠李糖乳桿菌功能特性的研究進展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學刊,2012(3):117-120.

[3]Zubillaga M,Weill R,Postaire E,et al. Effect of probiotics and functional foods and their use in different diseases[J]. Nutrition Research,2001,21(3):569-579.

[4]劉謙典,李長虹,劉鷺,等. 微生態(tài)制劑的作用機理與臨床應用[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志,1998(6):40-41.

[5]劉茜,張娟,陳堅,等. 噴霧冷凝法制備高性能乳酸菌微膠囊[J]. 應用與環(huán)境生物學報,2012(5):824-830.

[6]雷艷琴. 益生菌的特性及其在成人奶粉中的應用[J]. 中國乳業(yè),2008(10):54-55.

[7]陳衛(wèi),譚惠子,胡斌,等. 益生菌對消化道胃酸和膽鹽脅迫的應激機理[J]. 中國食品學報,2010(6):1-6.

[8]Sultana K,Godward G,Reynolds N,et al. Encapsulation of probiotic bacteria with alginate-starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt[J]. International Journal of Food Microbiology,2000,62(1-2):47-55.

[9]Anal A K,Singh H. Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery[J]. Trends in Food Science & Technology,2007,18(5):240-251.

[10]Mortazavian A,Razavi S H,Ehsani M R,et al. Principle's and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms[J]. Iranian Journal of Biotechnology,2007,5(1):1-18.

[11]Hunkeler D. Polymers for bioartificial organs[J]. Trends in Polymer Science,1997,5(9):286-293.

[12]朱守創(chuàng).益生菌LGG微膠囊化及對提高其存活性的機制研究[D].鄭州:鄭州大學,2013.

[13]趙紅磊,田豐偉,陳衛(wèi),等. 壓力噴霧法制備嗜酸乳桿菌微膠囊的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2010(6):196-198.

[14]鄒強,梁華忠,龔春雪,等. 海藻酸鈉和乳清蛋白作為益生菌包埋壁材的比較[J]. 食品科學,2014(15):207-211.

[15]何東保,石毅,馮峰,等. 殼聚糖/黃原膠凝膠化性能的研究[J]. 武漢大學學報：理學版,2001(6):717-720.

[16]劉劍萍,陸大年. 殼聚糖微膠囊制備過程的研究[J]. 浙江化工,2003(7):10-12.

[17]鄒強.雙歧桿菌微膠囊的研究[D].無錫:江南大學,2012.

[18]Radmacher E,Vaitsikova A,Burger U,et al. Linking central metabolism with increased pathway flux:L-valine accumulation by Corynebacterium glutamicum[J]. Applied and Environmental Microbiology,2002,68(5):2246-2250.

[19]Cheow W S,Kiew T Y,Hadinoto K. Controlled release of Lactobacillus rhamnosus biofilm probiotics from alginate-locust bean gum microcapsules[J]. Carbohydrate Polymers,2014,103:587-595.

[20]Acarturk F,Takka S. Calcium alginate microparticles for oral administration:II effect of formulation factors on drug release and drug entrapment efficiency[J]. Journal of Microencapsulation,1999,16(3):291-301.

[21]Tonnesen H H,Karlsen J. Alginate in drug delivery systems[J]. Drug Development and Industrial Pharmacy,2002,28(6):621-630.

The preparation and properties of chitosan xanthan gumLactobacillusrhamnosusmicrocapsules

WANG Yuan-yi-fei,DING Wu*,SONG Ying-ying,HUANG Ya-ping

(College of Food Science and Engineering,Northwest A & F University,Yangling 712100,China)

Using chitosan and xanthan gum as wall materials,the experiment embeddedLactobacillusrhamnosuswith emulsion method to explore its best preparation technology with embedding rate as the indicators. The study revealed that when chitosan's concentration was 0.8%,the xanthan gum concentration was 1.0%,and the best rotational speed was 900 r/min,the optimal embedding rate was 88.9%. The diameters of microcapsules were about 300 μm,relatively evenly distributed. There were 3.56 lg CFU/mL and 3.4 lg CFU/mL live bacteria still in the simulated gastric juice and the simulated bile fluid after 2 h. It showed that it had a strong protective effect on the cell.

chitosan;xanthan gum;Lactobacillusrhamnosus;microcapsules;embedding

2016-08-16

王遠一飛(1994-)，男，大學本科，研究方向：畜產(chǎn)食品深加工與安全控制，E-mail：Wangyyf163@163.com。

*通訊作者:丁武(1971-)，男，博士，教授，研究方向：畜產(chǎn)食品深加工與安全控制，E-mail：dingwu10142000@hotmail.com。

國家自然基金項目(31172236)；陜西省自然科學基金項目(K33202096)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)06-0229-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.035