李 麗,李 羚,劉孟江,蘇 鵬

(保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院,云南保山 678000)

響應(yīng)面法優(yōu)化云南永仁野生黃牛肝菌多糖微波輔助提取工藝及其抗氧化活性研究

李 麗,李 羚,劉孟江,蘇 鵬

(保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院,云南保山 678000)

以云南永仁野生黃牛肝菌為原料,采用響應(yīng)面法對微波輔助提取野生菌多糖的工藝進行研究。在單因素實驗基礎(chǔ)上,選擇料液比、水浴溫度、水浴時間進行3因素3水平中心組合設(shè)計實驗,再利用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化黃牛肝菌多糖的提取工藝,并測定了黃牛肝菌多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羥自由基(OH·)的清除作用。結(jié)果表明:黃牛肝菌多糖的最佳提取工藝:水浴溫度78 ℃,液料比52∶1(mL/g),水浴時間2.60 h,微波時間70 s,微波功率350 W,在此條件下多糖平均得率為14.74%,與預(yù)測值(14.77%)相比,相對誤差較小,為0.35%。黃牛肝菌多糖對DPPH自由基及OH·均有一定的清除作用,且隨其隨濃度的增大而增大。

黃牛肝菌,多糖,微波輔助,響應(yīng)面法,抗氧化活性

牛肝菌是名貴稀有的野生食用菌,為“四大菌王”之一,主要有白、黃、黑三種,其中,云南的野生牛肝菌資源較為豐富。因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富,牛肝菌一直深受相關(guān)研究者的青睞,目前,有關(guān)牛肝菌資源的研究多見于營養(yǎng)成分提取、分析及其活性測試方面,研究表明:牛肝菌具有高優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、低脂肪、低熱量等特點,富含鉀、鐵、鋅等礦物質(zhì)元素以及多糖、黃酮、多酚、維生素B2和揮發(fā)性物質(zhì)等[1-4],既是良好的天然食品,又是較好的藥用資源。

作為牛肝菌中的一種,黃牛肝菌(BoletusauripesPk.),別名黃賴頭、老虎頭,新鮮野生黃牛肝菌肉肥厚,為世界性著名的優(yōu)質(zhì)食用菌,含有豐富的有益于人體健康的化學(xué)成分,具有清熱除煩、養(yǎng)血、追風(fēng)散熱、補虛提神等藥效。目前,有關(guān)黃牛肝菌的研究主要見對其揮發(fā)性成分及部分化學(xué)成分研究[3,5],而對其多糖的提取及活性分析還較為少見。云南永仁縣位于楚雄州西北部,四川省南部,全縣森林綜合覆蓋率達81.95%,孕育了豐富的野生食用菌資源,其中,黃牛肝菌是產(chǎn)量及品質(zhì)較高的食用菌之一,但是,由于缺乏對地方資源的研究基礎(chǔ)及開發(fā)應(yīng)用意識,當(dāng)?shù)刎S富的野生菌資源并沒有給百姓的經(jīng)濟帶來貢獻和改變,因此,對永仁黃牛肝菌資源的研究,具有重要的現(xiàn)實意義。

目前有關(guān)黃牛肝菌多糖的提取方法主要有水提醇沉法、酸堿浸提法、酶法、超聲波輔助法、微波法等,其中微波輔助法以操作簡單、節(jié)能環(huán)保提取高效等特點深受研究者青睞,如:王偉平[6]等采用微波前處理-熱水浸提美味牛肝菌菌體胞內(nèi)多糖,與熱水直接浸提法相比,微波前處理-熱水浸提能顯著縮短提取時間,提高提取率。謝美華[7]等采用熱水法、超聲波法、微波法提取了紫紅牛肝菌粗多糖,結(jié)果表明:微波法提取效果最佳。響應(yīng)面法是一種較為合理的實驗設(shè)計方案,它通過建立多元二次回歸數(shù)學(xué)模型,達到優(yōu)化工藝參數(shù)并預(yù)測響應(yīng)值的目的[8]。

本研究以云南永仁縣野生黃牛肝菌為研究對象,微波輔助法提取多糖,在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面實驗法對黃牛肝菌多糖進行優(yōu)化,以期為地方黃牛肝菌資源的重視及進一步開發(fā)利用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黃牛肝菌 7月份采自云南永仁雜叢林中,洗凈,切片、置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干,粉碎過80目,得黃牛肝菌樣品粉,密封干燥保存?zhèn)溆?苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇、95%乙醇、丙酮、VC、DPPH、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫等試劑 均為分析純。

DFT-200手提式高速萬能粉碎機 溫林市林大機械制造廠;MW20-M605微波爐 廣東歐派集團有限公司;N-1001D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化;800離心機 中外合資深圳天南海北有限公司;HH-S26S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠;721可見分光光度計 上海菁華科技有限公司;CP214電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司；EPED-10TH實驗室超純水器 南京易普易達科技發(fā)展有限公司;DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃牛肝菌多糖的提取 黃牛肝菌樣品粉→微波浸提→熱水浸提→冷卻至室溫后離心分離→上層清液定容測定樣品液多糖含量→上層清液于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/4體積→加入95%乙醇,4 ℃沉淀過夜→沉淀依次用85%乙醇溶液、丙酮洗滌3次→60 ℃干燥至恒重→黃牛肝菌多糖,密封保存,備用。

1.2.2 單因素實驗 經(jīng)查閱大量相關(guān)文獻,選擇對黃牛肝菌多糖得率有影響的5個因素:微波時間、微波功率、液料比、水浴溫度、水浴時間進行單因素實驗。設(shè)定液料比40∶1 mL/g、微波功率350 W、水浴溫度90 ℃、水浴時間2 h,選擇微波時間(30、60、70、80、90、120 s)。設(shè)定液料比為40∶1 mL/g、微波時間為70 s、水浴溫度90 ℃、水浴時間2 h,選擇微波功率為70、210、350、490、700 W。設(shè)定微波功率350 W、微波時間70 s、水浴溫度90 ℃、水浴時間2 h、選擇液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g。設(shè)定液料比40∶1 mL/g、微波功率350 W、微波時間為70 s、水浴時間2 h,選擇水浴溫度60、70、80、90 ℃。設(shè)定液料比40∶1 mL/g、微波功率350 W、微波時間為70 s、水浴溫度90 ℃,選擇水浴時間1、1.5、2、2.5、3 h。每組實驗做三次平行,取其平均值。

1.2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,結(jié)合實際實驗條件,采用Design-Expert軟件中的Box-Behnken組合設(shè)計法[9-10],選取顯著性較高的三個因素(p<0.05):液料比(A)、水浴溫度(B)和水浴時間(C),進行3因素3水平分析實驗,優(yōu)化黃牛肝菌多糖提取工藝,其因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及多糖含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用硫酸-苯酚法,參照文獻[11],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn),在490 nm測定吸光度,以葡萄糖濃度c為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為A=6.125c+0.0064(R2=0.9996)。

精確量取0.8 mL黃牛肝菌多糖樣品液,按上述方法測定吸光度,代入回歸方程得多糖濃度,按下式計算多糖得率。

多糖得率(%)=(提取液中多糖質(zhì)量/樣品質(zhì)量)×100

1.2.5 牛肝菌多糖抗氧化能力測定 分別準(zhǔn)確稱取黃牛肝菌多糖及VC各25 mg,配制成1000 μg/mL溶液,并按二倍稀釋法分別稀釋至500、250、125、62.5 μg/mL。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 參照王之珺[12]等報道的方法稍作修改,在5支10 mL具塞比色管中分別加入1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液2.0 mL,各加入不同濃度的黃牛肝菌多糖水溶液0.5 mL,然后再加入1.5 mL水充分混勻,在避光處靜置30 min后,加水稀釋至10 mL。以水代替DPPH溶液為對照組,以水代替樣品溶液作空白組離心分離,取上層清液在520 nm處測其吸光度。以同濃度VC作陽性對照。

其中,A1為加入多糖樣品所測吸光度,A2為用同體積無水乙醇代替DPPH乙醇溶液所測吸光度,A0為用同體積蒸餾水代替多糖樣品溶液的空白對照組的吸光度。

1.2.5.2OH·清除能力 參照文獻[13-14]方法稍作修改,在5支10mL具塞比色管中分別加入9mmol/L硫酸亞鐵水溶液,9mmol/L水楊酸無水乙醇溶液,3%過氧化氫水溶液和不同質(zhì)量濃度的多糖樣品各1.0mL,于37 ℃水浴中反應(yīng)30min,冷卻至室溫后,加水稀釋到10mL后,在510nm處測定其吸光度。以同濃度的VC為陽性對照。

其中,A1為加入多糖樣品液所測吸光度,A2為用同體積蒸餾水代替過氧化氫溶液所測吸光度,A0為用同體積蒸餾水代替多糖樣品溶液的空白對照組的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素及抗氧化實驗采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行分析,采用Design-expert.v8.0.6.1進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 微波時間對多糖得率的影響 由圖1可知,隨著微波時間的增加,多糖得率顯著增大,當(dāng)微波時間為70 s時,得率最高,達13.58%。此后,增加微波時間,多糖得率反而減少。這可能是因為適當(dāng)?shù)奈⒉苁裹S牛肝菌細(xì)胞內(nèi)部溫度升高、壓力增大,細(xì)胞有效破裂,多糖快速溶出;但當(dāng)加熱時間過長時,會導(dǎo)致系統(tǒng)溫度過高,部分多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞而造成損失。因此,實驗中微波時間不宜過長,70 s為宜。

圖1 微波時間對多糖得率的影響Fig.1 Effect of microwave times on polysaccharides extraction rate

2.1.2 微波功率對多糖得率的影響 由圖2可知:微波功率對多糖得率的影響呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,當(dāng)功率為350 W時,得率最大,達13.30%。原因可能是微波功率較小時,系統(tǒng)接受的微波能較少,分子運動速度慢,不利于多糖溶出;當(dāng)微波功率過大時,一方面會破壞多糖的結(jié)構(gòu),另一方面會導(dǎo)致溶劑揮發(fā),都不利于多糖的有效提取。因此,最佳微波功率為350 W。

圖2 微波功率對糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharides extraction rate

2.1.3 液料比對多糖得率的影響 由圖3可知:當(dāng)液料從30∶1～50∶1(mL/g)時,多糖得率逐漸上升,但當(dāng)液料比從50∶1到70∶1(mL/g)時,得率逐步下降。原因可能是當(dāng)液料比過高時,溶劑將消耗大量微波能而不利于黃牛肝菌細(xì)胞破裂。因此,選最佳液料比為50∶1(mL/g),此時,黃牛肝菌多糖得率達14.00%。

圖3 料液比對多糖得率的影響Fig.3 Effect of the ratio between solvent and material on polysaccharides extraction rate

2.1.4 水浴溫度對多糖提取率的影響 由4可知:在60～80 ℃區(qū)間內(nèi),隨溫度升高多糖得率也增大。當(dāng)溫度達80 ℃時,得率最大,達14.30%。其后,升高溫度多糖得率下降。因此,選最佳水浴溫度為80 ℃。

圖4 水浴溫度多糖提取率的影響 Fig.4 Effect of the temperature of the water bath on polysaccharides extraction rate

圖5 水浴時間對多糖提取得率的影響Fig.5 Effect of the times of the water bath on polysaccharides extraction rate

2.1.5 水浴時間對多糖得率的影響 由圖5可知:隨著水浴時間的增長,多糖得率不斷升高,而后又下降,在2.5 h得率達最大值,為13.80%?？赡苁怯捎谒r間過短多糖溶解不充分,不能被有效提取,但是當(dāng)水浴時間過長時,一方面會使多糖部分水解,另一方面可能會溶出部分雜質(zhì),反而不利于多糖提取。因此,選最佳水浴時間為2.5 h。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken組合設(shè)計法設(shè)計,實驗共有17組,12個析因點及5個區(qū)域的中心點,以多糖得率為響應(yīng)值[15]。實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

注:p<0.001表示有極顯著的影響,用**表示;p<0.05表示有顯著的影響,用*表示。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 利用Design-Expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元二次響應(yīng)面回歸方程擬合,得多元二次回歸模型:Y=14.65+0.34A-0.043B+0.75C-0.56AB+0.68AC-0.26BC-1.68A2-0.67B2-1.80C2,對回歸模型進行方差分析,結(jié)果見表3。

2.2.3 響應(yīng)面分析圖 可根據(jù)響應(yīng)面的陡峭程度來說明隨著各因素的變化多糖得率的變化情況,從等高線的形狀可以判斷出交互作用的強弱及影響作用的大小,橢圓表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反[16-18]。

由圖6可知,料液比、水浴溫度、水浴時間兩兩之間的交互作用對黃牛肝菌多糖的提取影響都非常顯著,該結(jié)果與回歸分析保持一致。從圖6(a)可以看出,響應(yīng)曲面圖開口向下,響應(yīng)面陡峭,隨著料液比或水浴溫度的增加,多糖的得率都先增加,達極大值后減小,這與單因素結(jié)果保持一致。從圖6(b)可知,水浴時間曲線比液料比的曲線較陡,表明水浴時間對實驗結(jié)果的影響大于液料比的顯著性。由圖6(c)可知,當(dāng)水浴時間一定時,多糖得率隨水浴溫度的增加而增加,表面水浴溫度對多糖提取率呈正相關(guān)性。對三組圖比較可知,水浴時間對黃牛肝菌多糖提取率的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡,液料比的影響較為顯著,而水浴溫度的影響不顯著,表現(xiàn)為曲線較為平滑。

圖6 各兩因素交互作用對黃牛肝菌多糖得率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of extraction rate

2.2.4 響應(yīng)面分析檢驗 根據(jù)上述響應(yīng)面優(yōu)化得到黃牛肝菌多糖的最佳提取條件為:微波功率350 W,微波時間70 s,51.62∶1(mL/g),水浴溫度78.43 ℃,水浴時間2.60 h,多糖得率的預(yù)測值為14.77%?？紤]實際操作條件,將最佳提取工藝條件修正為:微波功率350 W,微波時間70 s,液料比52∶1(mL/g),水浴溫度78 ℃,水浴時間2.60 h。進行3次平行驗證實驗,在此條件下,黃牛肝菌多糖的平均得率為14.74%,與預(yù)測值的相對誤差為0.35%。充分說明了采用響應(yīng)面優(yōu)化提取多糖的條件準(zhǔn)確可靠,具有一定的生產(chǎn)指導(dǎo)作用,可用于黃牛肝菌多糖的提取。

2.3 黃牛肝菌多糖抗氧化測定結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除活性 由圖7可知,隨多糖及VC濃度增大,清除率也增大,多糖對DPPH自由基的清除能力與濃度成正比關(guān)系,當(dāng)濃度大1000 μg/mL時,清除率達21.5%,而VC的清除率達77.5%,相比較而言,VC對DPPH自由基的清除能力強于黃牛肝菌多糖,原因可能是黃牛肝菌粗糖雜質(zhì)含量較多,對DPPH自由基的清除不利。

圖7 多糖和VC對DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharides and VC on DPPH·

2.3.2 OH·清除活性 由圖8可知，當(dāng)濃度從62.5～1000 mg/mL時,多糖和VC對OH·清除率均隨著質(zhì)量濃度增大而升高。當(dāng)多糖濃度達到1000 mg/mL時,多糖對羥基自由基的清除率為26.5%,而VC清除率達90.1%,可見黃牛肝菌多糖對OH·的清除能力明顯低于VC。

圖8 多糖和VC對·OH的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polysaccharides and VC on·OH

3 結(jié)論與討論

采用微波輔助法,在單因素的基礎(chǔ)上,應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了黃牛肝菌中多糖的提取工藝,當(dāng)微波功率為350 W,微波時間為70 s,液料比52∶1(mL/g),水浴溫度為78 ℃,水浴時間2.60 h時提取工藝最佳。在此條件下,測得黃牛肝菌多糖的平均得率為14.74%。與預(yù)測值的相對誤差為0.35%,說明采用響應(yīng)面優(yōu)化法具有可行性和實用價值,該方法是一種提取黃牛肝菌多糖的有效方法。與文獻[7,19-20]報道的大多數(shù)牛肝菌得率相比,本研究所提取的黃牛肝菌多糖得率相對較高,但低于王心詩[21]等所報道的野生銅色牛肝菌多糖得率(14.92%)。原因可能是由于不同的菌屬及不同的自然環(huán)境會對野生菌多糖的含量產(chǎn)生影響,同時,不同的提取方法對多糖的提取效果也有一定影響。黃牛肝菌多糖對OH·和DPPH自由基都有一定的清除作用,且具有量效關(guān)系。本研究進行為云南地方黃牛肝菌資源的進一步重視和開發(fā)提供了一定實驗指導(dǎo)。

[1]楊立紅,劉林德,鐘旭生,等.野生牛肝菌多糖的分離鑒定及其抗氧化性研究[J].食品科學(xué),2008,29(8):335-338.

[2]劉佳,高敏.野生牛肝菌營養(yǎng)成分分析及對小鼠免疫功能的影響[J].微量元與健康研究,2007,24(1):32-35.

[3]李文,谷鎮(zhèn),楊焱,等.黃牛肝菌中揮發(fā)性成分的GC-MS分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2012,38(8):871-878.

[4]周玲仙,殷建忠.云南野生食用牛肝菌營養(yǎng)成分分析及評價[J].食用菌,2008,4:61-62.

[5]鮑小敏,盧幫敏,鮑錦庫.黃牛肝菌凝集素的分離純化及部分性質(zhì)[J].四川大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2015,25(2):409-415.

[6]王偉平,陳維,韓鳳云,等. 微波前處理-熱水浸提美味牛肝菌胞內(nèi)多糖工藝的研究[J].食品科技,2012(6):232-234.

[7]謝美華,羅中澤,李霖,等.云南野生紫紅牛肝菌粗多糖提取方法及活性測定[J].食品科技,2014,39(6):199-202.

[8]吳雪艷,羅鵬,葉建方,等.響應(yīng)面法優(yōu)化竹蓀菌托多糖的提取工藝[J].南方農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,46(3):480-485.

[9]王雪冰,趙天瑞,樊建.響應(yīng)曲面法優(yōu)化虎掌菌多糖提取工藝研究[J].西南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,33(7):146-151.

[10]吳有煒.實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理[M].蘇州:蘇州大學(xué)出版社,2002:115-154.

[11]王婭玲,李維峰,郭芬,等.微波輔助提取菱紅菇多糖及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2015,36(7):251-254.

[12]王之珺,張柳婧,鐘瑩霞,等.青錢柳多糖的乙?；揎椉翱寡趸钚訹J].食品科學(xué),2015,36(21):6-9.

[13]鄭宇翔,肖鳳霞,林勵,等.青蒿渣中總多糖提取工藝及其抗氧化活性[J].中國實驗方劑學(xué)雜志索,2015,21(14):8-11.

[14]李穎,李慶典.桑葚多糖抗氧化作用的研究[J].中國釀造,2010(4):59-61.

[15]王靜,王澤鋒,吳娜,等.曲面法優(yōu)化云南野生青頭菌多糖的提取工藝[J].工藝技術(shù),2015,36(2):181-184.

[16]李莉,張賽,何強,等.響應(yīng)面法在實驗設(shè)計與優(yōu)化中的應(yīng)用[J].實驗室研究與探索,2015,34(8):41-45.

[17]李悅,薛橋麗,李世俊,等.響應(yīng)面法優(yōu)化小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵工藝[J].食品科學(xué),2014,35(17):137-145.

[18]了素風(fēng),陳建雄,黃志偉,等.響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化葡萄籽原花青素提取工藝的研究[J].熱帶作物學(xué)報,2011,32(3):554-559.

[19]杜敏華,張英君,劉明星,等.野生牛肝菌多糖提取工藝的優(yōu)化及其對自由基的清除作用[J].食品工業(yè)科技,2012,33(22):292-295.

[20]謝娟平,楊娥.正交設(shè)計優(yōu)化野生牛肝菌多糖提取及含量測定[J].食品工業(yè),2011(4):68-70.

[21]王心詩,邰麗梅,吳素蕊,等.響應(yīng)面法優(yōu)化水提銅色牛肝菌多糖工藝[J].中國食用菌,2015,34(1):60-64.

A research based on response-surface method for optimization of microwave-assisted extraction of polysaccharides fromBoletusauripesPk. and its antioxidation

LI Li,LI Ling,LIU Meng-jiang,SU Peng

(Department of Resource and Environment,Baoshan College,Baoshan 678000,China)

In this research,microwave-assisted method was used to extract polysaccharides fromBoletusauripesPk. of Yongren area in Yunnan and this technology was optimized by response surface method. Based on single-factor experiment,three-factor and three-level central composite design was conducted with certain liquid-solid ratio,water bath temperature and time. Meanwhile,its scavenging effect on DPPH free radical and OH· was investigated. The optimal extraction processes as follows:1iquid-solid ratio at 52∶1(mL/g),water bath temperature of 78 ℃,water bath time for 2.60 h,microwave time in 70 s and microwave power at 350 W. It was found that polysaccharide yielded was up to 14.74% compared with theoretical value(14.77%),the relative error was at 0.35%. Furthermore,it had certain scavenging effect on DPPH free radical and OH·,which became larger with the increase of its concentration.

BoletusauripesPk.;polysaccharide;microwave-assisted;response surface method;antioxidation

2016-07-25

李麗(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物提取，E-mail:lili19820607@126.com。

2015年地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510686002)；保山科技局2016年市級科技計劃項目(2016bs101)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)06-0293-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.047