胡劍剛，董洪亮，付立霞，左佳坤，吳小卡，米榮升，黃燕，陸珂，陳兆國，韓先干，胡世君

1 西南大學動物科學學院，重慶 402460

2 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

3 揚州大學 動物科學與技術學院 江蘇省人畜共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009

細菌菌蛻是應用噬菌體 PhiX174的裂解基因E在革蘭氏陰性菌中表達后形成不含細胞質及細胞器的細菌空殼，通常是通過對裂解基因E的嚴格溫度調控實現(xiàn)[1-3]。裂解基因E編碼一種含91個氨基酸的膜蛋白，該蛋白能夠融合在革蘭氏陰性菌的內外膜并使菌膜形成 1個直徑40?200 nm的特異性跨膜通道[4-5]。在滲透壓的作用下，使菌體內容物排出，但內外膜結構和成分基本不變，細菌菌蛻作為一種優(yōu)良的新型疫苗及佐劑正受到越來越多的關注[6-7]。

細胞穿透肽 (Cell penetrating peptides，CPPs) 是一些能穿透細胞膜的小分子肽，它們一般不超過30個氨基酸，總體多帶正電荷，具有兩極性[8]。CPPs可以充當藥物分子的運載工具，并且有些本身就具有一定的生物學功能[9-10]。發(fā)現(xiàn)最早的細胞穿透肽是人免疫缺陷病毒的反式轉錄激活 (Trans-activator of transcription，Tat)蛋白，隨后又在自然界發(fā)現(xiàn)和人工合成了各種細胞穿透肽，這些細胞穿透肽不受細胞類型的限制，共價或非共價結合一些核酸、蛋白或顆粒性物質穿過細胞膜進入細胞[11]。細胞穿透肽的研究多集中于對真核細胞的作用，對細菌等原核細胞研究較少。有研究表明，由于原核生物不存在膜修復機制，一些具有抗微生物作用的細胞穿透肽作用于細菌后，能產生類似菌蛻的結構；模型兩親肽 (Model amphipathic peptide，MAP)是一個大小為18個氨基酸的細胞穿透肽[12]。為了驗證 MAP是否能裂解禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichia coli，APEC) 形成菌蛻，本研究通過利用噬菌體 PhiX174的裂解基因E構建的溶菌質粒pBV220-E、合成細胞穿透肽MAP以及構建表達MAP的pBV220-MAP，分別作用于APEC分離株DE17制備菌蛻，分析比較它們的差異，為進一步研究菌蛻疫苗、提高菌蛻疫苗的安全性研究提供參考。

1　材料與方法

1.1　菌株、載體及試劑

APEC DE17株分離于大腸桿菌感染鴨，由本實驗室保存[13]；大腸桿菌 DH5ɑ感受態(tài)、質粒抽提試劑盒購買自天根 (Tiangen) 公司；pBV220溫度敏感型載體由本實驗室保存[14]，PhiX174 DNA、DNA marker、Ligation mix試劑盒、PCR mix、限制性內切酶EcoR Ⅰ和PstⅠ均購自TaKaRa公司；DNA純化回收試劑盒購自Thermo Fisher公司。所用引物 (表1) 均由上海華津生物科技有限公司合成。

1.2　溶菌質粒pBV220-E的構建

根據(jù)GenBank上的噬菌體PhiX174的裂解基因E序列 (Accession No. 9626372)，設計1對引物 E-F、E-R擴增E基因的 ORF，跨幅為276 bp。在引物 5′端分別引入限制性酶切位點EcoR Ⅰ和PstⅠ，用于構建表達質粒。

PCR擴增條件為：94 ℃4 min ；94 ℃ 40 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，PCR擴增產物用DNA純化試劑盒回收。

對pBV220和E基因進行EcoR Ⅰ和PstⅠ雙酶切，用 Ligation mix連接酶連接，轉化DH5α，鑒定陽性克隆，將鑒定正確的質粒命名為pBV220-E。

1.3　運用溶菌質粒pBV220-E制備DE17菌蛻

分別將質粒pBV220和溶菌質粒pBV220-E與100 μL DE17電轉化感受態(tài)混合，加入到1 mm的電轉杯中，用BIO-RAD電轉儀進行電轉，電轉電壓2.2 kV，電轉后立即加SOC，28 ℃搖菌1 h，涂布于LB (100 μg/mL氨芐青霉素) 平板28 ℃培養(yǎng)。挑取單菌落進行鑒定，篩選陽性克隆。

將含有質粒pBV220或溶菌質粒pBV220-E的陽性克隆DE17接種于LB (100 μg/mL氨芐青霉素) 液體培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值為 1，分別接種于 2份 100 mL LB(100 μg/mL氨芐青霉素) 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值約為0.4。迅速將溫度升高至42 ℃進行誘導，每30 min取一次樣，利用分光光度計測其OD600值，繪制溶菌曲線。

表1　本研究中所用引物序列Table 1 Primers sequence used in this study

分別取上述42 ℃誘導0 h和4 h后的菌液100 μL，用無菌PBS溶液進行梯度稀釋后，取20 μL接種到LB固體培養(yǎng)基上。37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜后進行活菌計數(shù)，統(tǒng)計各梯度活菌數(shù) (CFU)，每個稀釋度3個重復；通過適當梯度CFU計算溶菌效率。計算細菌溶菌效率，計算公式為：溶菌率=(1?誘導后CFU/誘導前CFU)×100%。

1.4　細胞穿透肽MAP制備DE17菌蛻

參照文獻[15]，經上海吉爾多肽有限公司合成細胞穿透肽MAP，其氨基酸序列 (從N端→C端) 為KLALKLALKALKAALKLA，分子式為C90H170N24O18，分子量大小1876.51，純度≥90.60%。

用過濾除菌的10 mmol/L的Na2HPO4溶解合成的細胞穿透肽MAP，配制成10 μmol/L的MAP溶液備用。接種DE17于液體LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，用無菌PBS清洗3遍后，分別用10 μmol/L的MAP溶液稀釋DE17菌體至OD600值為0.1和0.2，用10 mmol/L的 Na2HPO4溶液稀釋 DE17菌體至OD600值為0.1和0.2，作為對照組。將上述菌液接種于96孔板 (每孔 200 μL，3 個重復)，21 ℃作用 1 h。

將96孔板中作用1 h后的菌液取出100 μL，作梯度稀釋后，接種到LB固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。統(tǒng)計各組活菌數(shù) (CFU)，計算MAP的溶菌效率。

1.5　pBV220-MAP質粒的構建及DE17菌蛻的制備

根據(jù)細胞穿透肽MAP的氨基酸序列，經優(yōu)化后，獲得編碼MAP的核苷酸序列，設計引物MAP-F和 MAP-R，在引物 MAP-F的 5′和 3′端分別引入限制性酶切位點EcoRⅠ和PstⅠ，擴增MAP的核苷酸序列，引物序列見表1。

用STE緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA) 分別溶解引物MAP-F與MAP-R，然后將溶解后的MAP-F與MAP-R等體積混合后于94 ℃水浴5 min，冷卻至室溫。變性退火后的引物形成可與EcoRⅠ/PstⅠ酶切產物互補的粘性末端，用連接酶將其連入經EcoRⅠ/PstⅠ酶切后的pBV220載體中，得到重組質粒pBV220-MAP。

構建的 pBV220-MAP質粒送到上海華津生物科技有限公司測序。參照 1.3中用質粒 pBV220-E制備菌蛻的方法，用質粒pBV220-MAP作用于DE17制備菌蛻。

1.6　掃描電鏡觀察

將正常培養(yǎng)的 DE17、溶菌質粒 pBV220-E誘導后的 DE17及細胞穿透肽 MAP作用后的DE17菌體分別收集起來，2.5%戊二醛4 ℃固定過夜，用PBS (pH 7.2) 洗滌3次后，然后用四氧化鋨4 ℃固定1.5 h。乙醇逐級脫水，乙酸戊二酯置換，干燥后噴金，在掃描電鏡下觀察 (美國FEI公司，Tecnai G2 F30 S-TWIN)。

2　結果

2.1　溶菌質粒pBV220-E及pBV220-MAP的構建

用E基因特異性引物，以PhiX174 DNA為模板，擴增出一條約276 bp的條帶，與預期結果相符。電泳檢測結果表明，溶菌質粒pBV220-E經EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切獲得了與預期大小相同的目的片段。同時溶菌質粒 pBV220-E測序結果表明，E基因已被克隆至溫控載體pBV220中，且閱讀框架正確，證明已成功構建溶菌質粒 pBV220-E (圖 1)。

測序結果表明，成功構建溶菌質粒pBV220-MAP (圖 2)。

2.2　溶菌質粒制備DE17菌蛻及其裂解效率

將含有溶菌質粒pBV220-E的DE17菌株，28 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4，溫度迅速升至42 ℃開始誘導，前30 min，OD600值上升至0.9，然后開始下降，60 min后其OD600值基本無變化。而含有質粒pBV220或pBV220-MAP的DE17菌株其OD600值持續(xù)上升，未見明顯下降 (圖3)。

溶菌質粒pBV220-E對DE17的裂解效率檢測表明，溶菌前菌液的CFU為2.63×107，而溶菌后的CFU為2.5×104，溶菌效率達到99.9%；而pBV220-MAP對DE17誘導前和誘導后的菌液進行計數(shù)，計算溶菌效果，結果發(fā)現(xiàn)無溶菌效果。

圖1　PCR擴增E基因和溶菌表達載體酶切鑒定結果Fig. 1 PCR amplification of E gene and endonuclease digestion identification of the lysis vector pBV220-E.M: DNA marker (DL5000); 1: PCR product of the E gene; 2: double endonuclease digestion of pBV220-E;3: negative control.

圖2　pBV220-MAP測序結果Fig. 2 The sequence result of pBV220-MAP.

圖3　分別含有pBV220、pBV220-E或pBV220-MAP的DE17溶菌與生長曲線Fig. 3 Growth and lysis curves of DE17 harboring the plasmid pBV220, pBV220-E or pBV220-MAP, respectively.

2.3　細胞穿透肽MAP作用DE17產生菌蛻

DE17菌體用10 μmol/L的細胞穿透肽MAP溶液稀釋成OD600為0.1和0.2，作用1 h后，CFU統(tǒng)計如表2所示。

細胞穿透肽 MAP對 DE17的裂解作用表明，10 μmol/L的細胞穿透肽 MAP溶液作用OD600=0.1的 DE17菌液后，其溶菌效率達到100%，對OD600=0.2的DE17菌液也具有一定滅活作用。而對照組10 mmol/L的Na2HPO4溶液對OD600為0.1和0.2的DE17作用1 h后不發(fā)生溶菌作用。

表2　細胞穿透肽MAP滅活效果Table 2 The inactivation efficiency of MAP

2.4　掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀測結果如圖4所示，正常培養(yǎng)的DE17對照呈現(xiàn)完整的細胞表面結構。運用溶菌質粒pBV220-E制備的DE17菌蛻，兩端或中部形成可見的跨膜孔道 (箭頭所示)，裂解細菌保存了基本完好的外膜結構，呈現(xiàn)典型的菌蛻結構。細胞穿透肽 MAP作用后的 DE17并未看到明顯的穿孔，但表面膜形態(tài)結構形成一定的溝壑狀 (圖4)。

3　討論

圖4　DE17及其菌蛻掃描電鏡圖 (放大倍數(shù)為40000倍)Fig. 4 Scanning electron micrograph of DE17 and DE17 bacterial ghosts (40000×). (A) DE17. (B) DE17 bacterial ghosts induced by the lysis plasmid pBV220-E. (C) DE17 bacterial ghosts induced by the cell penetrating peptide MAP.

細菌菌蛻作為一種優(yōu)良的新型疫苗及佐劑正受到越來越多的關注，菌蛻作為疫苗與傳統(tǒng)的疫苗相比，不存在毒力返強等問題，保留了良好的免疫原性，可刺激機體產生更強的免疫反應，因此較常規(guī)疫苗具有更好的免疫保護效果，同時還具有天然免疫佐劑效應和靶向性載體的作用[16-19]。制備細菌菌蛻通常通過噬菌體PhiX174裂解基因E的可控性表達實現(xiàn)，但一些細菌尤其是大腸桿菌不能實現(xiàn)完全滅活，為了更好地提高溶菌效率，往往共表達金黃色葡萄球菌核酸酶基因 (SNA基因)，但仍難以達到100%的裂解效率[20-23]。細胞穿透肽是近十幾年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的一些具有穿透細胞膜的小分子肽，根據(jù)結構特點可以將CPPs分為陽離子型、兩親性型和疏水型。由于它們不受細胞類型的限制，且能夠結合攜帶一些難以進入細胞的物質穿過細胞膜發(fā)揮其作用，所以其作為一種新型的載體也受到越來越多的重視。關于細胞穿透肽的研究主要集中于對真核細胞的作用，對細菌等原核生物的研究較少，有國外學者發(fā)現(xiàn)一些細胞穿透肽具有抗微生物的作用，并能夠快速作用大腸桿菌產生菌蛻結構。然而，現(xiàn)在關于CPPs的穿膜機制仍然不是很清楚，自從有細胞穿透肽報道以來，轉導機制就一直是研究熱點，但是確切的機制目前仍不明確，國外學者提出了一些假說，多數(shù)學者贊同內吞介導的穿膜機制[24-25]，但仍然存在諸多爭議。本研究通過構建溫控敏感型溶菌質粒pBV220-E、合成細胞穿透肽MAP和構建表達MAP的 pBV220-MAP質粒，開展了對APEC分離株DE17菌蛻制備研究。通過實驗結果可以看出，溶菌質粒構建費時，需要多個步驟導入DE17，作用于DE17產生菌蛻需要較長時間，且無法達到 100%的溶菌效率；與之相比，細胞穿透肽MAP作用于DE17產生菌蛻過程方法簡便，只需要一定濃度的 MAP與DE17共培養(yǎng)，且能快速產生菌蛻，對低濃度的菌量 (OD600=0.1) 可以達到 100%的溶菌效率，但是由于多肽合成成本較高，因此受到一定的限制。而構建的pBV220-MAP溶菌質粒無法在胞內發(fā)揮類似于裂解基因E的溶菌作用，推測可能的原因如下：1) 有可能是在胞內不能正常表達或是表達的量不足，而不能起到溶菌作用；2) 也有可能是 MAP只能在胞外發(fā)揮作用，而在胞內表達的MAP不具有穿膜能力，不能有效分泌到胞外發(fā)揮作用，具體機制仍有待進一步研究。此外，研究表明，顯示細胞穿透肽進入細胞可能有多個通路，具體哪一種通路占主導方式可能與細胞穿透肽本身、穿透肽濃度、其攜帶的載物及靶組織有關[24,26-27]。

對不同方法制備的 APEC的菌蛻形態(tài)研究表明，溫控溶菌質粒產生的菌蛻能形成典型的跨膜孔道，該膜蛋白能融合在革蘭氏陰性菌的內外膜從而形成1個直徑在40–200 nm的特異性跨膜通道[4]。而細胞穿透肽 MAP作用產生的菌蛻形成一定的溝壑狀，研究表明，細胞穿透肽的穿膜機制主要有直接轉運、細胞內吞和通過形成某種跨膜結構發(fā)生轉導的方式進行[28]，可能正是由于E基因與細胞穿透肽對細菌的作用機制不同，從而導致兩者產生菌蛻的形態(tài)有明顯差異，裂解效率也存在一定差距，但是兩種方法產生的細菌菌蛻均保持了基本完整的外膜結構。

本研究通過研究不同的 APEC菌蛻制備方式，分析比較其差異，為進一步研究菌蛻疫苗、提高菌蛻疫苗的安全性提供參考。

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