包玎，李偉，石樂明，李全貞

1 溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院與生命科學學院，浙江 溫州 325035

2 復旦大學 生命科學學院，上海 200433

N-甲基-D-天冬氨酸受體1 (NMDAR1) 是谷氨酸受體NMDAR的1型亞基。NMDAR由不同的亞基構(gòu)成異四聚體，亞基組成主要包括 NR1(NDMAR1)、NR2和 NR3。NMDAR1是 NMDAR受體必不可少的組成亞基，可結(jié)合甘氨酸，為該受體的功能單位[1-4]。

人 NMDAR1基因定位于染色體的 9q34.3，由938個氨基酸組成，分子量為105.5 kDa，總長度為4213 bp，開放閱讀框為2814 bp。1991年Moriyoshi用蟾蜍卵母細胞表達系統(tǒng)結(jié)合電生理學的方法首次成功克隆出大鼠NMDAR1基因[5]，人與大鼠NMDAR1的氨基酸序列具有99%的同源性。NMDAR1細胞外區(qū)域有兩個突出部分，N末端位于細胞外，C末端位于細胞內(nèi)，中間有3個跨膜片段 (Transmenbrane segments, TM)，細胞外區(qū)域包括N末端和激動劑結(jié)合區(qū)[6]。NMADR1主要包括 3個結(jié)構(gòu)域，分別為氨基末端結(jié)構(gòu)域(Animoacid terminal domain, ATD)、激動劑結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (Ligand binding domain, LBD) 和跨膜結(jié)構(gòu)域 (Transmembrane domain, TMD)[3]。

NMDAR是一種興奮性神經(jīng)突觸受體，是谷氨酸受體的重要亞型，主要存在于哺乳動物神經(jīng)細胞。它不僅參與正常生理過程如神經(jīng)元的增殖、遷移和塑造，并在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如中風、癲癇和神經(jīng)性退變等過程中發(fā)揮重要作用[7-13]?？筃MDAR抗體首先發(fā)現(xiàn)于腦炎伴卵巢畸胎瘤年輕女性患者的血清和腦脊液中，隨后在無潛在腫瘤的腦炎患者中亦證實該抗體的存在[14-20]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NMDAR也參與一些免疫性疾病，如神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(NPSLE)。NPSLE是SLE疾病中最難診斷和高風險的疾病亞型。其最顯著的檢測指標是患者血清或腦脊液中存在抗NR2或NR1的自身抗體[21-28]。另外，抗NMDAR腦炎作為一種新型腦炎亞類受到廣泛關注，是一種NMDAR抗體相關自身免疫性腦炎。鑒于NMDAR1自身抗體與包括神經(jīng)精神性狼瘡在內(nèi)的多種疾病癥狀密切相關，因此檢測病人血和腦脊液中的NMDAR1蛋白和抗體對疾病的診斷和鑒別診斷具有重要意義。然而目前市場上尚無具有明確免疫反應性的NMDAR1重組蛋白可用于疾病標志物的研究，因此，體外表達 NMDAR重組蛋白并對其免疫反應性進行鑒定，對研究該蛋白在相關疾病發(fā)病機制中的作用及進行疾病的早期診斷和鑒別診斷，具有重要的應用價值。NMDAR1作為NMDAR組成的必要亞基，膜外部分包含了蛋白主要抗原結(jié)構(gòu)域。對NMDAR1蛋白的膜外部分進行表達和純化，有助于研究該蛋白膜外結(jié)構(gòu)域的功能和免疫反應性，同時探索其用于自身免疫病患者體內(nèi)NMDAR1自身抗體檢測的可行性。

1　材料與方法

1.1　試劑與材料

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3) 感受態(tài)細胞、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；pCold-SUMO質(zhì)粒為溫州醫(yī)科大學李偉課題組惠贈；限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB；無縫克隆酶購自諾唯贊生物有限公司；異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 購自上海生物化工有限公司；ULP蛋白酶來源于復旦大學麻錦彪課題組；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物公司；抗體購自Abcam和CST公司；引物合成委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

1.2　序列的選擇

將人和鼠的NR1蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)具有99%的相似性，說明 NR1蛋白序列高度保守。根據(jù)文獻[3]報道的鼠 NMDAR1三級預測結(jié)構(gòu)(PDB 4pe5)，利用phyre2軟件預測人NMDAR1蛋白結(jié)構(gòu)。根據(jù)預測蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)陌被嵝蛄?，選取對應膜外片段。N-末端的“19–393 aa”序列屬于氨基末端結(jié)構(gòu)域，“394–544 aa”和“663–800 aa”氨基酸序列屬于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖 1)。NR1-M1 (編碼 19–393 aa)、NR1-S1 (編碼394–544 aa) 和 NR1-S2 (編碼 663–800 aa) 為選取的3個膜外截短蛋白片段。其中NR1-S1和NR1-S2片段之間以G (甘氨酸) T (蘇氨酸) 作為接頭連接成為復合片段NR1-S1-GT-S2。

1.3　設計引物并合成

設計可擴增NR1-M1基因片段的PCR上下游引物，并分別在引物的前端加上pCold-SUMOb載體的同源序列 (M1-F和 M1-R見表 1)。設計NR1-S1基因片段的上游引物和 NR1-S2基因片段的下游引物，并分別在引物的前端加上pCold-SUMOb載體的同源序列 (分別為S1-F和S2-R，見表 1)。設計 NR1-S1基因片段的下游引物和NR1-S2基因片段的下游引物，并在兩個引物之間引入編碼 GT氨基酸對應核苷酸序列和 S1S2的同源序列，以便用于Overlap-PCR將S1和S2兩個基因片段連接成復合片段 (分別為 S1-R和S2-F，見表1)。引物設計完成并送生物公司進行合成。

1.4　目的基因擴增及重組表達載體的構(gòu)建

RT-PCR擴增獲得 NR1-M1核酸片段。Overlap-PCR方法擴增獲得NR1-S1-GT-S2復合片段，過程示意圖見圖2。用NdeⅠ限制性內(nèi)切酶切割pCold-SUMO載體成線性化載體。運用無縫克隆技術(shù)分別將 M1及 S1-GT-S2核酸片段與pCold-SUMOb線性化載體進行重組，重組體分別命名為 pCold-SUMOb-M1及 pCold-SUMOb-S1-GT-S2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR鑒定，陽性單克隆進行測序驗證。

圖1　人NR1的三級預測結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域?qū)ね獍被嵝蛄心Ｊ綀DFig. 1 The tertiary structure of human NR1 and the amino acid sequences corresponding to the domain. The N-terminal “19–393 aa” sequences belong to amino-terminal domain; The N-terminal “394–544 aa” and “663–800 aa”sequences belong to ligand binding domain.

表1　引物序列Table 1 The sequences of primers

圖2　Over-lap PCR擴增S1-GT-S2核酸片段原理過程示意圖Fig. 2 The schematic diagram of the over-lap PCR amplification of S1-GT-S2 fragment.

1.5　蛋白的誘導表達

構(gòu)建成功的 pCold-SUMOb-M1及 pCold-SUMOb-S1-GT-S2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21(DE3) 細胞，涂 LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，菌落PCR鑒定，鑒定成功的單菌落轉(zhuǎn)接至10 mL的LB培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)，至培養(yǎng)基渾濁，轉(zhuǎn)接至1 L的LB培養(yǎng)基。首先，在37 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)，待細菌生長至對數(shù)生長期 (A600=0.6–0.8) 時，加入終濃度為0.2 mmol/ L的IPTG，18 ℃繼續(xù)培養(yǎng)15–18 h，4 ℃離心收集細菌。按照體積比，菌液沉淀和buffer1(20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 500 mmol/L NaCl,25 mmol/L 咪唑) 1∶5–1∶7 重懸混勻，利用高壓破菌機4 ℃進行破菌。裂解菌液17000 r/min 離心1 h，收集上清進行下一步蛋白的純化。

1.6　蛋白的純化

菌液上清過 Ni-NTA柱，融合蛋白結(jié)合于鎳柱上，之后將鎳柱接入到AKTA purifier 系統(tǒng)裝置上，進行洗脫和收集。ULP1蛋白酶加入收集的洗脫液中，并在透析液 (透析液成分 20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0, 500 mmol/L NaCl) 中透析 4 h。酶切過后的收集液過Ni-NTA柱，融合標簽結(jié)合于鎳柱上，收集流穿液體。收集的流穿液體運用凝膠過濾層析進一步純化，AKTA purifier 進行洗脫和收集。最后用超濾管將收集的純化蛋白進行濃縮。

1.7　Western blotting進行重組蛋白免疫反應原性鑒定

Western blotting實驗檢測純化蛋白的免疫反應性。首先用SDS-PAGE分離純化蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)封閉液 (5% BSA, 0.1% TBST) 封閉1 h，加入對應的小鼠抗人NMDAR1抗體 (抗人NR1-M1抗體，Ab134308，美國Abcam公司)和兔抗人NMDAR1多肽 (GluN1) 抗體(GluN1 Rabbit mAb，CST 5704S，美國 Cell Signaling公司) 4 ℃孵育過夜。陰性對照分別采用無關抗體 (小鼠 IgG和兔 IgG)。TBST洗滌3次，10 min/次，加入對應二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL化學發(fā)光顯影。

2　結(jié)果

2.1　目的基因擴增及重組體的鑒定

RT-PCR擴增目的核酸片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示在對應大小的位置有目的條帶存在，NR1-M1核酸片段大小為1125 bp (圖3，泳道1)，NR1-S1-GT-S2核酸片段大小為873 bp (圖3，泳道2)。膠回收NR1-M1和NR1-S1-GT-S2核酸片段，和pCold-SUMOb載體重組獲得重組體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α細胞，挑取單克隆菌落進行菌落PCR (載體通用引物) 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示載體有對應大小的核酸片段插入，pCold-SUMOb-M1大小為1500 bp左右 (圖4，泳道 1–6)，pCold-SUMOb-S1-GT-S2大小為1200 bp左右 (圖4，泳道8–13)。陽性單克隆菌落進行Sanger測序，測序結(jié)果進行Blast比對發(fā)現(xiàn)序列完全正確，重組體構(gòu)建成功。

圖3　M1和S1-GT-S2的PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of the amplified M1 and S1-GT-S2 by PCR. M: DL2000 DNA marker; 1: M1(1125 bp); 2: S1-GT-S2 (873 bp).

圖4　菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒pCold-SUMOb-M1及pCold-SUMOb-S1-GT-S2Fig. 4 Identification of recombinant plasmids pCold-SUMOb-M1 and pCold-SUMOb-S1-GT-S2 by colony PCR. M:DL5000 DNA marker; 1–6: the monoclonal colonies of pCold-SUMOb-M1; 7: pCold-SUMOb vector; 8–13: the monoclonal colonies of pCold-SUMOb-S1-GT-S2.

2.2　蛋白的誘導表達和純化

重組質(zhì)粒pCold-SUMO-M1和pCold-SUMOS1-GT-S2轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，IPTG誘導目的蛋白表達。收集菌液經(jīng)高壓破菌之后，SDS-PAGE顯示在相應分子量位置有明顯的重組蛋白表達條帶 (圖5，泳道1和圖6，泳道1)，而含載體的對照菌株則無蛋白表達條帶 (圖 5，泳道2和圖6，泳道2)。對破菌后的沉淀和上清進行蛋白電泳分析，發(fā)現(xiàn)重組蛋白雖然在沉淀部分有少量表達，但主要存在于上清部分 (圖 5，泳道3、4和圖6，泳道3、4)，說明重組蛋白主要以可溶性蛋白的形式表達。蛋白經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，由AKTA purifier洗脫，得到了純度較高的融合蛋白 6 His-SUMO-NR1-M1 (分子量約 57 kDa) (圖 5，泳道 7、8) 和 6 His-SUMONR1-S1-GT-S2 (分子量約47 kDa) (圖6，泳道7、8)。純化的融合蛋白經(jīng)ULP1蛋白酶切割，去除標簽6 His-SUMO融合標簽。去除標簽的目的蛋白通過凝膠過濾層析進行進一步純化，得到高純度的目的蛋白NR1-M1 (分子量約42 kDa) (圖5，泳道9、10) 和NR1-S1-GT-S2 (分子量約32 kDa)(圖 6，泳道 9、10)。

2.3　純化目的蛋白的Western blotting鑒定

取NR1-M1純化蛋白，NR1-S1-GT-S2純化蛋白，空載體pCold-SUMO轉(zhuǎn)化DH5α并經(jīng)IPTG誘導的菌液進行Western blotting鑒定。結(jié)果顯示重組蛋白 NR1-M1 (分子量約 42 kDa) 和NR1-S1-GT-S2 (分子量約 32 kDa) 均可以和對應抗體發(fā)生特異性免疫反應 (圖 7，M1-1和S1-GT-S2-1)，而空載體對照與相應抗體無反應(圖 7，M1-2和 S1-GT-S2-2)。另外，重組蛋白NR1-M1和 NR1-S1-GT-S2與無關抗體 (小鼠IgG 和兔 IgG) 無免疫反應 (圖 7，M1-3和S1-GT-S2-3)。說明我們表達的重組NR1-M1和NR1-S1-GT-S2為具有免疫反應性的可溶性蛋白。

圖5　SDS-PAGE鑒定NR1-M1蛋白表達及純化結(jié)果Fig. 5 Identification of the expression and purification of NR1-M1 protein by SDS-PAGE. 1: the whole bacterial 　of 　BL21 　cells 　transformed 　by pCold-SUMO-M1; 2: the whole bacterial of BL21 cells transformed by pCold-SUMO vector; 3: the precipitation of induced bacteria after lysis; 4: the supernatant of induced bacteria after lysis; 5: the eluate from Ni-NTA purification of supernatant; M: protein marker; 7–8:purified protein; 9–10: purified protein (no SUMO tag) .

圖6　SDS-PAGE鑒定S1-GT-S2蛋白表達及純化結(jié)果Fig. 6 Identification of the expression and purification of S1-GT-S2 protein by SDS-PAGE. 1: the whole BL21 bacterial transformed by pCold-SUMO-S1-GT-S2; 2: the whole bacterial of BL21 cells transformed by pCold-SUMO vector; 3: the precipitation of induced bacteria after lysis; 4：the supernatant of induced bacteria after lysis; 5: the eluate after Ni-NTA purification of supernatant; M: Protein marker;7–8: purified protein; 9–10: purified protein (no SUMO tag).

圖7　純化蛋白的Western blotting分析Fig. 7 Analysis of the purified protein by Western blotting. M1-1: 0.5 μg NR1-M1 purified protein, incubated with mouse anti-NMDAR1 monoclonal antibody; M1-2: pCold-SUMO vector control, incubated with mouse anti-NMDAR1 monoclonal antibody; M1-3: 0.5 μg NR1-M1 purified protein incubated with mouse IgG; S1-GT-S2-1: 0.5 μg NR1-S1-GT-S2 purified protein, incubated with rabbit anti-NMDAR mAb; S1-GT-S2-2: pCold-SUMO vector control,incubated with rabbit anti-NMDAR mAB; S1-GT-S2-3: 0.5 μg S1-GT-S2 purified protein incubated with rabbit IgG; M:protein marker.

3　討論

NMDAR受體是由多個亞基緊密結(jié)合形成的復合體，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞的重要介質(zhì)。其中 NMDAR1是NMDAR復合體的主要組成成分。NMDAR1是一種膜蛋白，含有多次跨膜結(jié)構(gòu)。其膜外部分可能是自身抗體作用的主要靶標，但目前有關該蛋白膜外結(jié)構(gòu)域抗原決定簇及其免疫反應性尚無可靠的研究證據(jù)。因為NMDAR1是一種膜蛋白，其分子量較大，且結(jié)構(gòu)復雜，因此體外表達具有一定難度。目前市場上僅有一種 Abcam公司的NMDAR1重組蛋白可用于科研，但該蛋白僅包含 NMDAR1蛋白的部分胞內(nèi)片段 (1–122位氨基酸)，且免疫反應性較弱，難以滿足科研需要，因此急需開發(fā)一種含有NMDAR1全長或主要抗原決定簇 (尤其是胞外部分) 的重組蛋白。本研究首先根據(jù)曾經(jīng)報導的鼠NMDAR1三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，利用Pymol軟件對人NMDAR1膜外結(jié)構(gòu)進行分析并預測其抗原結(jié)構(gòu)域。然后用 PCR對抗原結(jié)構(gòu)域進行分段擴增并利用原核表達系統(tǒng)快速純化出 NMDAR1的可溶性膜外蛋白片段，是NMDAR1抗原表達的一種新的嘗試。

由于NMDAR1蛋白結(jié)構(gòu)復雜且含有多次跨膜結(jié)構(gòu)，因此對該蛋白的表達和純化有較大的難度。Karakas等利用昆蟲表達系統(tǒng)表達鼠源蛋白用于晶體結(jié)構(gòu)的分析[3]，但此表達系統(tǒng)成本高、表達周期長且表達量低，難以用于規(guī)模生產(chǎn)。雖然利用固相合成技術(shù)可以合成NMDAR1多肽片段[24](20個氨基酸左右)，但合成的多肽受到氨基酸長度的限制，不一定包含NMDAR1蛋白中功能性的抗原結(jié)構(gòu)域。以前也有利用原核表達系統(tǒng)獲得NMDAR1截短蛋白的報道[29]，但所表達的蛋白為不溶性的包涵體。因包涵體內(nèi)的蛋白質(zhì)是處于非折疊狀態(tài)的聚集體，因此其免疫活性較低。本研究根據(jù)NMDAR1蛋白結(jié)構(gòu)特征，選擇性地表達其膜外結(jié)構(gòu)域中含重要抗原決定簇的蛋白。根據(jù)結(jié)構(gòu)預測結(jié)果，本研究表達的蛋白片段M1、S1和S2幾乎包含了NMDAR1蛋白所有的膜外部分。另外，我們利用pCold-SUMOb表達載體，該表達系統(tǒng)含有CSPA啟動子，在低溫下可以啟動蛋白的表達，使細菌生長緩慢，蛋白合成速度緩慢，從而最大限度地保證了蛋白正確折疊的幾率，提高了蛋白可溶性，增強了活性蛋白的幾率。該載體的另一個重要特征是同時具有SUMO-tag和His-tag。SUMO-tag可以顯著提高小分子蛋白的表達量和可溶性，而 His-tag則用于蛋白的鎳親和層析純化。載體上的“SUMO”蛋白酶切除位點可用于標簽的切除，從而保證目的蛋白的純度。細菌表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析、標簽切除及凝膠過濾層析，得到了較純的可溶性蛋白。經(jīng)Western blotting證實純化的目的蛋白能與相應抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應。

本研究為制備NMDAR1重組蛋白并進行活性鑒定的初步研究，所獲得的 NR-M1和NR-S1-GT-S2重組蛋白因包含了NMDAR1蛋白主要的抗原結(jié)構(gòu)域，可望用于自身免疫病患者體內(nèi)NMDAR1自身抗體的檢測。NMDAR自身抗體是神經(jīng)精神性狼瘡 (NPSLE) 重要的標志性抗體[21-28]，另外最近發(fā)現(xiàn)在腦炎患者和腦炎伴卵巢畸胎瘤年輕女性患者的血清和腦脊液中也有NMDAR自身抗體存在[14-20]。下一步我們將利用NR-M1和NR-S1-GT-S2重組蛋白檢測患者血清和腦脊液中的NMDAR自身抗體，探索該重組蛋白片段在疾病診斷中的應用價值。

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