張蔡喆，楊套偉，周俊平，鄭俊賢，徐美娟，張顯，饒志明

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 江蘇 無(wú)錫 214122

L-2-氨基丁酸 (L-ABA) 是一種非天然氨基酸，可以作為重要的前體物質(zhì)合成多種手性藥物，包括用于結(jié)核病治療的乙胺丁醇和布瓦西坦，以及抗癲癇藥物左乙拉西坦[1]。目前已開(kāi)發(fā)出諸多L-ABA的生物合成途徑[2-4]，主要通過(guò)脫氫酶或者轉(zhuǎn)氨酶來(lái)催化制備，但不對(duì)稱還原反應(yīng)需要等當(dāng)量的輔酶參與，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (即還原型輔酶Ⅰ，NADH)是氧化還原反應(yīng)中重要的輔酶[5]，作為電子供體，1分子NADH可以提供2個(gè)電子用于羰基等基團(tuán)的還原，由于輔酶價(jià)格昂貴，限制了其在工業(yè)水平的應(yīng)用，所以需要另一種底物和酶偶聯(lián)對(duì)輔酶進(jìn)行再生循環(huán)，以解決輔酶限制[6-7]。常用的酶偶聯(lián)法NAD(P)H輔酶循環(huán)體系有兩種[8]。一種是甲酸/FDH再生NADH體系。甲酸脫氫酶 (Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH) 是一種廣泛存在于甲醇利用型的細(xì)菌及酵母中的酶，也是目前還原 NAD+的脫氫酶中國(guó)內(nèi)外研究最多的酶之一[9]。FDH可以使甲酸氧化生成 CO2，同時(shí)將氧化態(tài)的輔酶 NAD+還原為 NADH。另一種是葡萄糖/GDH再生 NAD(P)H體系，葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，GDH) 是一種氧化還原酶，催化D-葡萄糖得到D-葡萄糖酸，同時(shí)將氧化態(tài)的輔酶NAD+或NADP+還原為NADH或NADPH。在某些情況下，NAD+作為輔酶時(shí)，GDH的酶促效率相比NADPH作為輔酶時(shí)要低[10]。多數(shù)研究采用基因工程技術(shù)對(duì) GDH進(jìn)行克隆和在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)來(lái)解決野生菌中酶活水平不高的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)氧化還原酶輔酶循環(huán)再生[11]。

例如Galkin等以2-酮丁酸為底物，通過(guò)偶聯(lián)亮氨酸脫氫酶 (LDH) 和輔酶 (NADH) 循環(huán)再用酶生甲酸脫氫酶 (FDH)，最終獲得36 g/L的L-ABA，產(chǎn)物得率為88%[12]；Tao等以L-蘇氨酸為底物，利用L-蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶一鍋法轉(zhuǎn)化L-蘇氨酸產(chǎn)L-2-氨基丁酸，在50 L規(guī)模上30 mol L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為 29.2 mol L-ABA，實(shí)現(xiàn)了97.3%的得率，產(chǎn)率達(dá)到了6.37 g/(L·h)，此方法在工業(yè)化生產(chǎn)L-ABA有較大潛力[13]。多數(shù)報(bào)道均以酶法轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，需要細(xì)胞破碎等繁瑣步驟，并且需要外源添加一定數(shù)量的輔酶 (NAD+等)。本文構(gòu)建了包括輔酶原位再生的偶聯(lián)酶反應(yīng)的途徑，以L-蘇氨酸為底物，D-葡萄糖為輔底物，以LTD和LDH一起構(gòu)建包括輔酶NADH循環(huán)再生的多酶催化體系，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn) L-ABA和 D-葡萄糖酸 (圖 1)。其中的偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物D-葡萄糖酸及其系列衍生物 (如葡萄糖酸鹽、葡萄糖酸 δ-內(nèi)酯) 是一類多用途的重要有機(jī)產(chǎn)品，在食品工業(yè)中被廣泛用作酸味劑、發(fā)酵劑、防腐劑、營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑、色調(diào)保持劑、蛋白質(zhì)凝固劑等[14]。

1　材料與方法

1.1　菌株和質(zhì)粒

pMD18-T克隆載體購(gòu)自 TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；pET28a(+) 表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3) 購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2　主要試劑和儀器

分子生物學(xué)工具酶、DNA markers購(gòu)自TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司。L-蘇氨酸、L-ABA、D-葡萄糖酸標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自Sigma公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；引物合成與核酸序列測(cè)定由上海生工生物工程公司完成；其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

圖1　全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成途徑[13]Fig. 1 Scheme of the reaction catalyzed by the whole-cell catalyst[13].

高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自HITACHI公司；高效液相色譜、氨基酸柱、有機(jī)酸柱購(gòu)自Agilent公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；超聲破碎儀購(gòu)自SONICS公司；PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司；5 L發(fā)酵罐購(gòu)自上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3　重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)已報(bào)道的 L-蘇氨酸脫氨酶基因ltd序列[15](GenBank登錄號(hào)：948287) 設(shè)計(jì)引物T1和T2 (文中所用引物見(jiàn)表1)，上游引物T1的5′端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物T2的5′端引入Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)。

根據(jù)已報(bào)道的蠟樣芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶基因ldh序列[16](GenBank登錄號(hào)：1206507) 設(shè)計(jì)引物F1和F2，上游引物F1的5′端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物F2的5′端引入SacⅠ酶切位點(diǎn)。

根據(jù)已報(bào)道的枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因gdh序列[17](GenBank登錄號(hào)：938261) 設(shè)計(jì)引物R1和R2，上游引物R1的5′端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物R2的5′端引入Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)。

分別以大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)試劑盒純化后，分別按酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，回收片段，連接到克隆載體pMD18-T，隨后再連接到表達(dá)載體pET28a(+)，轉(zhuǎn)化入菌株E. coliBL21(DE3)，利用卡那霉素篩選重組質(zhì)粒 pET28a(+)-ltd、pET28a(+)-ldh、pET28a(+)-gdh，然后再設(shè)計(jì)串聯(lián)引物G1和G2，上游引物G1的5′端引入酶切位點(diǎn)SphⅠ，下游引物G2的5′端引入酶切位點(diǎn)BglⅡ。

表1　本研究所用PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PCR amplication used in this study

以重組質(zhì)粒pET28a(+)-gdh為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，回收片段，與雙酶切重組質(zhì)粒pET28a(+)-ldh連接，轉(zhuǎn)化入菌株E. coliBL21(DE3)中，利用卡那霉素篩選重組質(zhì)粒pET28a(+)-ltd/gdh。

將上述重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，且通過(guò)上海生工生物完成測(cè)序，驗(yàn)證正確后表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.4　培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L，酵母提取物8 g/L，K3PO44 g/L，NaCl 3 g/L，一水合檸檬酸2.1 g/L，檸檬酸鐵銨0.3 g/L，甘油10 g/L，(NH4)2SO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

種子液培養(yǎng)：甘油菌以1%比例接種于5 mL種子培養(yǎng)基，卡那霉素終濃度100 μg/L，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)10 h。

發(fā)酵罐二級(jí)種子培養(yǎng)：將種子液按1%比例接種到150 mL LB培養(yǎng)基中，卡那霉素終濃度100 μg/L，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)6 h。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：二級(jí)種子液以5%比例接種于2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基中。初始溫度為37 ℃，pH為7.0，轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量1vvm，發(fā)酵過(guò)程中pH調(diào)控采用50%氨水自動(dòng)流加。當(dāng)溶氧下降時(shí)上調(diào)轉(zhuǎn)速，保持溶氧在20%以上。3 h后轉(zhuǎn)速逐漸升至600 r/min，溶氧停止下降，此時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，補(bǔ)料培養(yǎng)基為甘油400 g/L，胰蛋白胨25 g/L，酵母提取物50 g/L，通過(guò)補(bǔ)料使溶氧控制在 10%以上。當(dāng)OD600大于 18時(shí)，加入0.2 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，溫度降低至28 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)15 h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)低溫離心 (8000 r/min，15 min)，然后–20 ℃保存。

1.5　酶活性的測(cè)定

離心后的菌體用無(wú)菌水洗滌兩次后，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液重新懸浮，然后在4 ℃下用勻漿儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心取上清得到粗酶液。LTD、LDH、GDH的酶活性測(cè)定分別參考Umbarger和Brown[18]、Ansorge和 Kula[19]、Fujita[20]等的報(bào)道。

1.6　全細(xì)胞催化條件

在搖瓶中進(jìn)行全細(xì)胞催化條件優(yōu)化，轉(zhuǎn)速為180 r/min，溫度為30 ℃，pH控制在7.5，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，曲拉通x-100濃度0.3% (V/V)，濕菌體量為40 g/L，工程菌BL21-LDH與BL21-LDH/GDH配比為1：5，底物L(fēng)-蘇氨酸與D-葡萄糖添加比例為1：1 (mol/mol)，即 L-蘇氨酸 15 g/L，D-葡萄糖 22.7 g/L，反應(yīng)體積為50 mL。

2　結(jié)果與分析

2.1　重組菌的構(gòu)建與表達(dá)

按前述方法構(gòu)建得到了重組菌株 BL21-LTD和BL21-LDH/GDH，分別攜帶重組質(zhì)粒pET28a(+)-ltd，pET28a(+)-ldh/gdh，測(cè)序驗(yàn)證正確后表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。BL21-LTD和BL21-LDH/GDH的蛋白電泳圖譜如圖2A、B所示，LTD、LDH、GDH蛋白分子量分別為56.2、39.9、28.1 kDa。

2.2　全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)L-ABA和D-葡萄糖酸條件優(yōu)化

2.2.1　溫度與pH對(duì)催化效率的影響

首先考察了溫度對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響。溫度是影響酶反應(yīng)的重要因素，同時(shí)高溫也會(huì)對(duì)酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響[21]。如圖3A所示，考察了25–50 ℃下的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)條件為pH 7.5，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，曲拉通x-100濃度0.3% (V/V)，濕菌體量為40 g/L，工程菌BL21-LTD與BL21-LDH/GDH配比為1：5，底物L(fēng)-蘇氨酸與D-葡萄糖添加比例為1：1 (mol/mol)，即 L-蘇氨酸 15 g/L，D-葡萄糖 22.7 g/L，反應(yīng)體積為50 mL。發(fā)現(xiàn)最優(yōu)反應(yīng)溫度為30 ℃，80 min時(shí)底物完全轉(zhuǎn)化。

眾所周知，每一種酶在單獨(dú)作為生物催化劑時(shí)都有一個(gè)最佳催化效果的pH值，但是在多酶催化的體系中，每一種酶的最優(yōu)pH值不同，所以需要綜合考慮pH對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為衡量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行考察。如圖3B所示，考察了pH 6.5–8.0下的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其他反應(yīng)條件同上?？梢钥闯?，最優(yōu)反應(yīng)pH為7.5。

圖2　蛋白電泳圖 (A: BL21-LTD; B: BL21-LDH/GDH)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of BL21-LTD (A) and BL21-LDH/ GDH (B). M: marker; C: control; 1: LTD purified by IMAC; 2: soluble fraction of LTD; 3: co-expressing of LDH and GDH.

圖3　溫度 (A) 和pH (B) 對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature (A) and buffer pH (B) on the whole-cell catalyst. (B) Effect of buffer pH on whole-cell catalyst.

2.2.2　細(xì)胞通透劑對(duì)轉(zhuǎn)化速率的影響

此反應(yīng)為兩種工程菌混合進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，底物L(fēng)-蘇氨酸先由BL21-LTD轉(zhuǎn)化為2-酮丁酸，2-酮丁酸再進(jìn)入BL21-LDH/GDH轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-ABA，故細(xì)胞通透性的改變可能會(huì)影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的效率。為了克服由于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜存在而形成的滲透壁障，可以通過(guò)物理、化學(xué)等方法改變細(xì)胞壁、膜的通透性。通過(guò)處理后的細(xì)胞通常仍保持其形態(tài)上的完整性，但由于其細(xì)胞壁、膜受到了一定的破壞，其對(duì)低分子量物質(zhì)的滲透障礙被部分或完全解除。改變細(xì)胞通透性的方法很多，其中去污劑是一種較常用的方法[22]。由于去污劑分子可穿透活性細(xì)胞細(xì)胞膜，可作為細(xì)胞膜的通透劑，所以選取曲拉通 x-100、CTAB、吐溫-80進(jìn)行研究。首先在不同濃度下測(cè)試這3種通透劑的效果，可以看出曲拉通x-100作為細(xì)胞通透劑效果最好，吐溫-80和CTAB在0.2%濃度下催化效率最高，但都不如曲拉通x-100 (圖4A)。然后考察了0–0.6% (V/V) 曲拉通x-100濃度的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。可以看出曲拉通 x-100的最優(yōu)濃度為0.3% (圖4B)，不添加細(xì)胞通透劑會(huì)影響細(xì)胞間物質(zhì)交換，導(dǎo)致轉(zhuǎn)換率過(guò)低；同時(shí)過(guò)高的濃度會(huì)使膜蛋白從細(xì)胞膜裂解，破壞細(xì)胞導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性下降。

2.2.3　菌體量配比及不同菌體量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

由于是混菌轉(zhuǎn)化，所以要對(duì)兩種重組菌BL21/pET28a-ltd與BL21/pET28a-ldh/gdh的菌體量進(jìn)行合適的配比，以便達(dá)到合適的酶活比例，提高生產(chǎn)效率。通過(guò)測(cè)量一定菌體量下對(duì)L-蘇氨酸/2-酮丁酸的轉(zhuǎn)化速率來(lái)確定，兩種工程菌分別進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，菌體量為30 g/L (濕重)。轉(zhuǎn)化效率如圖5A所示，工程菌BL21-LTD對(duì)L-蘇氨酸的每小時(shí)轉(zhuǎn)化效率約為25 g/L，BL21-LDH/GDH轉(zhuǎn)化2-酮丁酸為L(zhǎng)-ABA的每小時(shí)效率約為5 g/L，故菌體量配比定為 1：5 (LTD、LDH、GDH三種酶的酶活比為12：10：25)。

單位體積內(nèi)酶活與菌體濃度成正比，但轉(zhuǎn)化效率并不會(huì)隨菌體濃度的增加而一直增加，為了體現(xiàn)高效經(jīng)濟(jì)性，需要得知在達(dá)到最高轉(zhuǎn)化效率時(shí)的菌體量?？疾炝?–60 g/L的濕細(xì)胞濃度的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其他反應(yīng)條件同上。如圖5B所示，濕菌體濃度為40 g/L (酶量為分別為4800、4000、10000 U/L)時(shí)，可以達(dá)到最高轉(zhuǎn)化效率。隨著細(xì)胞濃度的繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化效率也不再提高。

圖4　不同細(xì)胞通透劑 (A) 和不同濃度曲拉通x-100 (B) 對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 4 Effect of different permeabilization medium (A) and different concentration of triton x-100 (B) on whole-cell catalyst.

圖5　BL21-LTD和BL21-LDH/GDH的轉(zhuǎn)化效率 (A) 和菌體量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響 (B)Fig. 5 The catalytic efficiency of LTD and LDH/GDH (A) and effect of wet cells amount on the reaction (B).

2.3　在 5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)L-ABA與D-葡萄糖酸

經(jīng)過(guò)上述條件優(yōu)化，最終反應(yīng)條件為溫度30 ℃，pH 7.5，曲拉通x-100濃度0.3% (V/V)，濕菌體量為40 g/L，工程菌BL21-LTD與BL21-LDH/GDH配比為1：5，在0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)，反應(yīng)體積為2 L，轉(zhuǎn)速為200 r/min，采取分批補(bǔ)料，每小時(shí)添加L-蘇氨酸15 g/L，D-葡萄糖23 g/L (8 h后逐漸減少補(bǔ)料量)。反應(yīng)20 h后，反應(yīng)體系中L-ABA濃度達(dá)141.6 g/L，D-葡萄糖酸濃度達(dá)269.7 g/L，底物轉(zhuǎn)化率>99% (圖6)。

生物法合成L-ABA的同類工作見(jiàn)表2，其中Tao等[13]同樣利用LTD、LDH和GDH，以L-蘇氨酸、D-葡萄糖為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化并完成輔酶循環(huán)，也獲得了較高的產(chǎn)量 (124.8 g/L)，但其用細(xì)胞破碎液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并添加20 mg/L的NAD+，本研究使用全細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，省去了細(xì)胞破碎工藝；另外，在一般生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌胞內(nèi)NAD+和NADH的濃度大約為 0.4 mmol/L[23-24]，在此濃度下不需額外添加輔酶NAD+，并且獲得更高的產(chǎn)量和得率。

由表3可知，Tao等采用FDH以甲酸為底物進(jìn)行輔因子循環(huán)生產(chǎn)L-ABA，其副產(chǎn)物是二氧化碳，其優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物分離方便；但是甲酸一般對(duì)酶具有較強(qiáng)的毒害作用，造成酶失活速率較快，從而造成生產(chǎn)延續(xù)性較差，L-ABA最大產(chǎn)量只有100 g/L，生產(chǎn)效率為6.9 g/(L·h)，該結(jié)果顯著低于本研究獲得的結(jié)果 (141.6 g/L，7.08 g/(L·h))；另外，在工業(yè)化生產(chǎn)方面，以甲酸為原料需要建設(shè)防爆車間，可能會(huì)存在安全隱患和增加生產(chǎn)成本，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用 GDH和葡萄糖進(jìn)行輔因子循環(huán)生產(chǎn)L-ABA，同時(shí)獲得共產(chǎn)物葡萄糖酸，雖然在分離提取方面會(huì)造成一定的困難，但是所添加底物葡萄糖對(duì)酶基本沒(méi)有毒害作用，有利于生產(chǎn)的持續(xù)性，這也是本研究結(jié)果較為理想的重要原因，另外，葡萄糖酸本身是一種重要的原料，廣泛利用于食品及醫(yī)藥行業(yè)，同時(shí)沒(méi)有二氧化碳的產(chǎn)生，減少了工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)溫室效益的危害。

3　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了一種基于脫氫酶的生物轉(zhuǎn)化途徑，并在大腸桿菌中偶聯(lián)了NADH再生系統(tǒng)，共表達(dá)LDH與GDH，首次報(bào)道實(shí)現(xiàn)了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-蘇氨酸、D-葡萄糖聯(lián)產(chǎn)L-ABA與D-葡萄糖酸。通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，采用分批補(bǔ)料策略，164 g/L的L-蘇氨酸和248 g/L的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸，時(shí)空得率分別達(dá)到 7.1 g/(L·h)和 13.5 g/(L·h)，得率超過(guò) 99%。

盡管全細(xì)胞轉(zhuǎn)化和酶法轉(zhuǎn)化一樣，都存在長(zhǎng)時(shí)間使用下酶活性下降的問(wèn)題，但在相同的條件下全細(xì)胞內(nèi)的催化系統(tǒng)依舊比酶法更加穩(wěn)定[24]。不僅如此，相比酶法轉(zhuǎn)化需要額外添加昂貴的輔因子(NAD+、NADP+等)，無(wú)需輔因子的全細(xì)胞系統(tǒng)在高產(chǎn)的同時(shí)更具價(jià)格吸引力[25]，所以本研究構(gòu)建的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

圖6　5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)L-ABA與D-葡萄糖酸Fig. 6 Whole-cell catalyst production of L-ABA and D-gluconic acid on 5 L fermenter.

表2　生物合成L-ABA同類工作對(duì)比Table 2 Comparison between this work and other reported biosynthesis of L-ABA

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