欽偉云，甘麗娜，魏宗友，葉 蘭，包文斌，吳圣龍*

（1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省太倉(cāng)市畜牧獸醫(yī)站，江蘇太倉(cāng) 215400）

CD14基因在不同發(fā)育階段梅山豬各組織中的表達(dá)趨勢(shì)和差異分析

欽偉云1，甘麗娜1，魏宗友2，葉 蘭2，包文斌1，吳圣龍1*

（1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省太倉(cāng)市畜牧獸醫(yī)站，江蘇太倉(cāng) 215400）

為分析CD14基因在豬各組織中的發(fā)育表達(dá)差異情況，進(jìn)一步探討該基因的免疫調(diào)控機(jī)制，實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較分析CD14基因在7個(gè)不同發(fā)育階段梅山豬的12個(gè)組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明：CD14基因在不同發(fā)育階段梅山豬的12個(gè)組織中均有表達(dá)，且在不同階段呈現(xiàn)相對(duì)一致的表達(dá)規(guī)律，在肝中呈現(xiàn)極高的表達(dá)水平，在脾、肺、腸系膜淋巴結(jié)等組織中呈現(xiàn)中等的表達(dá)水平，在其他組織中呈現(xiàn)較低的表達(dá)水平。發(fā)育性表達(dá)分析顯示，CD14基因在肝臟中從初生到成年一直保持較高的表達(dá)水平；在免疫組織（脾、肺、腎和胸腺）、腸道組織（十二指腸、空腸和回腸）和胃組織中，CD14基因的表達(dá)水平從初生起呈上升趨勢(shì)，14或21日齡表達(dá)水平最高，之后呈下降趨勢(shì)并一直保持較低的表達(dá)水平，在腸系膜淋巴結(jié)中，初生仔豬CD14基因的表達(dá)水平最高，之后顯著下降并維持較低的表達(dá)水平。由此推測(cè)，CD14基因的表達(dá)水平變化趨勢(shì)與仔豬自身免疫發(fā)育具有相對(duì)的一致性，且與仔豬抵抗開(kāi)食期和斷奶期的應(yīng)激有著密切的聯(lián)系。

CD14基因；豬；組織表達(dá)譜；發(fā)育性表達(dá)

白細(xì)胞分化抗原14（Cluster of Differentiation Antigen 14，CD14）是存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原之一，同時(shí)作為脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的細(xì)胞受體參與對(duì)革蘭氏陰性菌的吞噬和消化。當(dāng)革蘭氏陰性菌進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)后，LPS從活菌體上緩慢釋放或在菌體破碎后大量釋放通過(guò)CD14的途徑激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞，引起炎癥介質(zhì)以及細(xì)胞因子的合成及釋放，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)從而起到抗感染作用；但炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放又是發(fā)生感染性休克及多臟器功能不全的主要因素[1]。CD14作為一種分化抗原以及細(xì)胞受體，其在機(jī)體的免疫反應(yīng)過(guò)程中尤其是革蘭氏陰性菌引起的疾病中起著重要的調(diào)控作用。目前關(guān)于CD14基因mRNA水平上的研究多集中于人和鼠上[2-3]，本課題組前期研究表明TLR信號(hào)通路，特別是CD14基因在中國(guó)地方豬種抵抗E. coli F18感染的過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)以不同發(fā)育階段（初生、7、14、21、28、35、134日齡）的梅山豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用熒光定量PCR檢測(cè)CD14基因在梅山豬12個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而分析各個(gè)組織中該基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)差異，探討CD14基因在梅山豬中的時(shí)空表達(dá)譜，為進(jìn)一步探討CD14基因在豬免疫調(diào)控中的作用及其分子機(jī)制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)豬全部取自江蘇省太倉(cāng)市梅山豬保種場(chǎng)，分別在7個(gè)不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段（初生、7、14、21、28、35、134日齡）在相同環(huán)境條件下飼養(yǎng)的5個(gè)家系中篩選出體重和體形等性狀基本一致的個(gè)體各1頭，即每個(gè)發(fā)育時(shí)期選取5頭。每個(gè)樣本屠宰取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、腸系膜淋巴結(jié)、十二指腸、空腸和回腸等12個(gè)豬組織樣，現(xiàn)場(chǎng)液氮保存，然后轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，液氮罐備用；Trizol裂解液購(gòu)自Invitrogen（美國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司（中國(guó)，南京）。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中CD14基因序列（GenBank登錄號(hào)：AB267810.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，以GAPDH和ACTB基因作為內(nèi)參基因，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列和預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。

1.3 提取各組織總RNA 按照Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)的要求提取12個(gè)組織中的總RNA，提取步驟嚴(yán)格按照Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)操作，并以1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整程度，使用ND-1000核酸/蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定濃度及純度，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訰NA為模板進(jìn)行cDNA合成，cDNA合成反應(yīng)體系（10 μL）：5×qRT SuperMix II 2 μL，組織RNA 500 ng，RNase free ddH2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件：25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min，最后4℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：模板 cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），2× SYBR Premix ExTapTMII 10 μL，50× ROX Reference Dye II 0.4 μL，RNase free ddH2O補(bǔ)足至總體積20 μL，PCR 擴(kuò)增程序：95℃30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；為了分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，在PCR擴(kuò)增結(jié)束后采集多個(gè)信息點(diǎn)，進(jìn)行熔解曲線(xiàn)的分析，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 相對(duì)定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理[5]，并利用SPSS17.0軟件一般線(xiàn)性模型（GLM）的Multivariate統(tǒng)計(jì)方法分析梅山豬不同生長(zhǎng)發(fā)育階段各組織的表達(dá)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的純度與完整性 提取后的各個(gè)組織總RNA經(jīng)1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，顯現(xiàn)28S、18S、5S共3條帶，無(wú)DNA污染條帶及明顯降解，且樣本的A260/A280在1.8～1.9，表明提取的RNA完整性和純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)與熔解曲線(xiàn) CD14基因PCR擴(kuò)增和熔解曲線(xiàn)表明，CD14基因的熒光定量PCR產(chǎn)物只有1個(gè)特異峰，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物形成，可用于進(jìn)一步的熒光定量檢測(cè)分析。

2.3 不同發(fā)育階段梅山豬12個(gè)組織中CD14基因的相對(duì)表達(dá)量 通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了不同發(fā)育階段梅山豬12個(gè)組織中CD14基因的表達(dá)水平，以GAPDH和ACTB基因?yàn)閮?nèi)參基因?qū)Ρ磉_(dá)結(jié)果進(jìn)行均一化處理，并以35日齡梅山豬肌肉中CD14基因的平均表達(dá)量為1，計(jì)算得到該基因在不同發(fā)育階段梅山豬各組織中的相對(duì)表達(dá)量。由圖1可以發(fā)現(xiàn)，CD14基因在不同發(fā)育階段梅山豬的12個(gè)組織中均有表達(dá)，并且在各個(gè)不同發(fā)育階段都呈現(xiàn)相對(duì)一致的組織表達(dá)規(guī)律，其中在心臟和肌肉組織中表達(dá)水平極低，在肝、脾、肺、腸系膜淋巴結(jié)等組織中呈現(xiàn)很高的表達(dá)水平，在腎、胃、胸腺、十二指腸、空腸、回腸等組織中呈現(xiàn)中度或較低的表達(dá)水平。

2.4 CD14基因在梅山豬12個(gè)組織中的發(fā)育性表達(dá)趨勢(shì)及差異分析 通過(guò)比較分析CD14基因在梅山豬10個(gè)組織（除心和肌肉組織）中的發(fā)育性表達(dá)趨勢(shì)及差異可以發(fā)現(xiàn)（圖2），該基因在各組織中的表達(dá)水平隨生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)程呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。CD14基因在肝臟中從初生到成年一直保持較高的表達(dá)水平；在脾、肺、腎、胃和胸腺組織中，CD14基因的表達(dá)水平從初生到14日齡呈上升趨勢(shì)，14～21日齡表達(dá)水平最高，之后呈下降趨勢(shì)；在腸道（十二指腸、空腸和回腸組織）中，CD14基因的表達(dá)水平從初生到21日齡呈上升趨勢(shì)，21日齡表達(dá)水平最高，之后呈下降趨勢(shì)并一直保持較低的表達(dá)水平；在腸系膜淋巴結(jié)中，初生仔豬CD14基因的表達(dá)水平最高，之后顯著下降并維持較低的表達(dá)水平。

表1 基因熒光定量引物

圖1 梅山豬不同發(fā)育時(shí)期不同組織CD14基因表達(dá)譜

3 討 論

CD14根據(jù)其在體內(nèi)的存在形式和分布可分成兩類(lèi)：一類(lèi)是位于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞等細(xì)胞細(xì)胞膜上的膜結(jié)合型CD14（Membrane-Bound Form CD14, mCD14）；另一類(lèi)是主要存在于血漿（清）中的可溶性CD14（Soluble CD14，sCD14）。mCD14和sCD14的生物學(xué)活性相似，都可以和LPS/LBP復(fù)合物結(jié)合并產(chǎn)生相應(yīng)的病理生理反應(yīng)。當(dāng)革蘭氏陰性菌進(jìn)入血液后，LPS會(huì)和脂多糖結(jié)合蛋白（Lps Binding Protein，LBP）結(jié)合形成LPS/LBP復(fù)合物，隨即被單核/巨噬細(xì)胞上的mCD14識(shí)別并結(jié)合，刺激單核細(xì)胞等分泌TNF、IL-1等細(xì)胞因子從而介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)，同時(shí)mCD14還介導(dǎo)單核細(xì)胞等對(duì)LPS /LBP復(fù)合物的吞噬作用，清除被LBP調(diào)理后的革蘭陰性細(xì)菌和LPS[6]。內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞表面不存在mCD14，此時(shí)由sCD14起到對(duì)LPS以及LPS /LBP復(fù)合物的介導(dǎo)反應(yīng)[7]，sCD14可與LPS /LBP復(fù)合物結(jié)合或者直接與LPS 結(jié)合，形成復(fù)合物再將信息傳遞給內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞[8]。由此可見(jiàn)，CD14基因在調(diào)控革蘭氏陰性菌引起的疾病中可能存在重要的作用。

圖2 梅山豬同一組織不同發(fā)育階段CD14基因的表達(dá)變化規(guī)律

3.1 梅山豬CD14基因的組織表達(dá)分析 本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同發(fā)育階段梅山豬12個(gè)組織中的CD14基因表達(dá)譜進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，CD14基因的表達(dá)具有廣泛性，不存在明顯組織特異性，并且該基因在梅山豬的不同發(fā)育階段呈現(xiàn)相對(duì)一致的表達(dá)規(guī)律，其中在肝中呈現(xiàn)極高的表達(dá)水平，在脾、肺、腸系膜淋巴結(jié)等組織中呈現(xiàn)中等的表達(dá)水平，在心、腎、胃、肌肉、胸腺、十二指腸、空腸、回腸等組織中呈現(xiàn)較低的表達(dá)水平，這與夏日煒[9]和Qiu等[10]在其他品種中的研究結(jié)果一致。肝臟是機(jī)體中最大的清除外來(lái)有毒物質(zhì)的器官，在機(jī)體的代謝過(guò)程中產(chǎn)生的廢物、內(nèi)毒素等隨門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟后被解毒，但當(dāng)動(dòng)物發(fā)生內(nèi)毒素血癥時(shí)，肝臟會(huì)受到嚴(yán)重的損傷[11]。由此可見(jiàn)，肝臟是最易受LPS傷害的主要靶器官之一，這可能也是CD14基因在肝臟中高表達(dá)的原因。單核/巨噬細(xì)胞均起源于骨髓干細(xì)胞，在骨髓中經(jīng)前單核細(xì)胞分化發(fā)育為單核細(xì)胞，進(jìn)入血液后隨血液流到全身各種組織，一部分進(jìn)入組織的巨噬細(xì)胞隨即發(fā)生形態(tài)變化，如肝臟中的庫(kù)普弗細(xì)胞、肺臟中的肺泡巨噬細(xì)胞、結(jié)締組織中的組織細(xì)胞以及脾和淋巴結(jié)中的固定和游走巨噬細(xì)胞等[12]。脾是機(jī)體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，淋巴同樣是機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要器官之一。肺是機(jī)體重要的呼吸器官，能和外界直接進(jìn)行物質(zhì)交流和接觸。因此，肺更易受到外界有害物質(zhì)和病原菌的侵害，肺巨噬細(xì)胞作為呼吸系統(tǒng)防御體系中重要的組成部分，在外界有害物質(zhì)侵入時(shí)發(fā)揮著重要作用。脾、肺和腸系膜淋巴結(jié)中都存在大量的巨噬細(xì)胞，而mCD14主要存在于巨噬細(xì)胞上，這可能是CD14基因在脾、肺和腸系膜淋巴結(jié)中呈現(xiàn)中等水平表達(dá)的原因。

3.2 CD14基因在梅山豬不同發(fā)育階段的表達(dá)差異分析 7、21日齡時(shí)CD14基因在各組織中的表達(dá)變化較為明顯。5～7日齡是仔豬的開(kāi)食期，開(kāi)食喂料過(guò)多或過(guò)少都會(huì)影響仔豬正常的生長(zhǎng)發(fā)育，產(chǎn)生應(yīng)激；21日齡是梅山豬的斷奶期，斷奶對(duì)仔豬來(lái)說(shuō)是一個(gè)很大的應(yīng)激，飼料、生活環(huán)境的改變可能繼發(fā)由大腸桿菌等引起的病原性腹瀉，而大腸桿菌是革蘭氏陰性菌的一種，大腸桿菌在腸道中的黏附會(huì)導(dǎo)致腸道LPS的濃度升高，CD14介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的作用受到LPS濃度的影響[13]。因此，7日齡和21日齡時(shí)CD14基因在各組織中的表達(dá)變化可能與仔豬在開(kāi)食、斷奶2個(gè)階段的應(yīng)激相關(guān)，是仔豬適應(yīng)腸道內(nèi)環(huán)境及LPS濃度產(chǎn)生的應(yīng)激機(jī)制。此外，CD14基因在肝中持續(xù)高表達(dá)可能與肝作為機(jī)體的解毒器官一直在發(fā)揮清除代謝廢物和內(nèi)毒素的作用有關(guān)，同時(shí)也表明肝臟的解毒功能與CD14基因具有密切的相關(guān)性。初生仔豬的免疫保護(hù)主要來(lái)自于從母乳中獲得的被動(dòng)免疫，以及仔豬自身免疫系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育而形成的主動(dòng)免疫，仔豬的被動(dòng)免疫在7日齡達(dá)到高峰之后下降，自身免疫系統(tǒng)在4～5周開(kāi)始發(fā)揮作用[14]，Toll樣受體在先天性免疫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，CD14作為T(mén)LR4的共受體在仔豬自身免疫系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育的過(guò)程中可能具有重要的作用，這可能是梅山豬免疫組織（脾、肺、腎和胸腺組織）和腸道組織（十二指腸、空腸和回腸組織）中CD14基因的相對(duì)表達(dá)量從初生一直呈上升趨勢(shì)，直到21日齡左右達(dá)到最高值的原因，第4周后仔豬自身免疫系統(tǒng)開(kāi)始發(fā)揮作用，因此CD14基因的表達(dá)量顯著下降并維持在較低的水平?；诒緦?shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合夏日煒等[9]在大白豬F18大腸桿菌病耐受型和敏感型個(gè)體間CD14基因的差異表達(dá)分析，以及前期運(yùn)用Agilent雙標(biāo)記表達(dá)譜芯片，對(duì)蘇太豬資源群體內(nèi)F18大腸桿菌抗性型和敏感型全同胞個(gè)體十二指腸組織內(nèi)差異表達(dá)基因及調(diào)控通路進(jìn)行了分析，篩選出對(duì)蘇太豬斷奶仔豬抗F18大腸桿菌可能具有重要調(diào)控作用的鞘糖脂生物合成—球系列通路以及包含CD14基因在內(nèi)的Toll-like信號(hào)炎癥免疫通路[15]，可以說(shuō)明CD14基因的表達(dá)水平變化可能與斷奶仔豬抗F18大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的侵害存在一定的相關(guān)性，今后有必要通過(guò)在細(xì)胞水平上的干擾和過(guò)表達(dá)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證分析CD14基因和仔豬抗F18大腸桿菌的具體相關(guān)性及其可能的分子調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié) 論

CD14基因的表達(dá)不存在明顯組織特異性，且在肝中呈現(xiàn)極高的表達(dá)水平，脾、肺、腸系膜淋巴結(jié)等組織呈現(xiàn)中等表達(dá)水平，在其他組織中呈現(xiàn)較低的表達(dá)水平；CD14基因在肝臟中從初生到成年一直保持較高的表達(dá)水平，在免疫組織（脾、肺、腎和胸腺）、腸道組織（十二指腸、空腸和回腸）和胃組織中，CD14基因的表達(dá)水平從初生起呈上升趨勢(shì)，14或21日齡表達(dá)水平最高，之后呈下降趨勢(shì)。CD14基因的表達(dá)水平變化趨勢(shì)與斷奶仔豬抗F18大腸桿菌具有密切的聯(lián)系。

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Tissue Expression Trend and Dif f erentiation of CD14 Gene in Dif f erent Development Stages of Meishan Pigs

QIN Wei-yun1, GAN Li-na1, WEI Zong-you2, YE Lan2, BAO Wen-bin1, WU Sheng-long1*
(1. Key Laboratory for Animal Genetics, Breeding, Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province, Yangzhou University, Jiangsu Yangzhou 225009, China; 2.Taicang Animal Husbandry and Veterinary Station of Jiangsu Province, Jiangsu Taicang 215400, China)

This study aims to analyze developmental expression dif f erences of CD14 gene in porcine tissues, and further explore it’s immune regulation mechanism. CD14 gene expressions in 12 tissues from 7 development stages of Meishan pigs were determined by real-time quantitative PCR. The results showed that the CD14 gene was broadly expressed in all tissues, and the expression pattern was relatively consistent in dif f erent stages. In the liver, CD14 gene had a higher expression level, the moderate in spleen, lung and mesenteric lymph nodes, and other tissues were lower. Meanwhile, expression level of CD14 gene remained high from newborn to adult in the liver; In immune tissues (spleen, lung, kidney and thymus), intestinal tissues (duodenum, jejunum and ileum) and stomach, the expression levels of CD14 gene was increased since newborn, and reached the highest level at 14 or 21 days of age, then declined and maintained a low level; In mesenteric lymph nodes, CD14 gene expression level was the highest when the newborn, then declined signif i cantly and maintained a low level. Thus we speculate that the expression trend and dif f erentiation of CD14 gene is consistent with autoimmune development of piglet, and has a close correlation with stress of resistance to starting feed period and weaning period.

CD14 gene; Pig; Tissue expression prof i le; Developmental expression

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-038

2016-11-27；

2016-12-04

江蘇省科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（BE2014357）；蘇州市科技局攻關(guān)項(xiàng)目（SNG201628）

欽偉云（1992-），男，浙江湖州人，碩士，研究方向?yàn)樨i抗病育種，E-mail：qinwy24@163.com

* 通訊作者：吳圣龍（1963-），男，江蘇泰州人，博士，研究員，研究方向?yàn)樨i抗病育種，E-mail: pigbreeding@163.com