［KH－*3D］邢小龍，常紀(jì)蘋，付忠軍，胡德升，胡彥民*

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002;2．重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶401329)

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因在玉米中的轉(zhuǎn)化與篩選

［KH－*3D］邢小龍1，常紀(jì)蘋1，付忠軍2，胡德升1，胡彥民1*

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002;2．重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶401329)

為獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米，將［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因?qū)胗衩?，并進(jìn)行鑒定和篩選。在［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因的兩端分別添加Nco I和Bam H I酶切位點(diǎn)，并進(jìn)行人工合成。將EβF合成酶基因與植物表達(dá)載體pFGC5941連接，經(jīng)雙酶切和測序鑒定。結(jié)果表明:重組表達(dá)載體pFGC5941-EβF構(gòu)建成功;載體pFGC5941-EβF轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后用玉米芽尖侵染法將EβF合成酶基因?qū)胗衩鬃越幌掂?8中，對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行除草劑抗性篩選以及EβF合成酶基因和bar基因的PCR鑒定后，共得到18株轉(zhuǎn)基因陽性植株。

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因;玉米;表達(dá)載體構(gòu)建;轉(zhuǎn)基因植株

［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因是植物體內(nèi)催化法尼基焦磷酸(FPP)合成EβF的關(guān)鍵酶基因。EβF作為大多數(shù)蚜蟲報(bào)警信息素的主要甚至唯一成分，是一種重要的倍半萜烯類化合物［1－3］，當(dāng)蚜蟲受到天攻擊時(shí)，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生EβF，以使其他蚜蟲逃離，從而停止對作物的危害。EβF對蚜蟲有強(qiáng)烈的驅(qū)避作用，并能吸引蚜蟲天敵，從而有較好的抗蚜效果。Beale等［4］將歐洲薄荷EβF合成酶基因轉(zhuǎn)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株對蚜蟲產(chǎn)生警戒反應(yīng)并吸引蚜蟲寄生性天敵蚜繭蜂。Foster等［5］研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生抗藥性的蚜蟲對EβF反應(yīng)變得遲鈍，故利用EβF充分吸引蚜蟲天敵可有效控制抗藥性蚜蟲。

目前該基因已先后從歐洲薄荷，香橙，花旗松，黃花蒿中得到分離和鑒定［6－9］。近年來研究人員又將EβF合成酶基因成功導(dǎo)入擬南芥，煙草，水稻［10－12］等作物中，培育了多種轉(zhuǎn)基因抗蟲植株。筆者借鑒前人經(jīng)驗(yàn)，以EβF合成酶基因構(gòu)建重組表達(dá)載體pFGC5941-EβF并轉(zhuǎn)入玉米自交系鄭58，得到轉(zhuǎn)化植株，然后進(jìn)行鑒定和篩選，為獲得抗蟲玉米材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 供試材料

受體材料:鄭58，玉米優(yōu)良自交系;菌株:大腸桿菌DH5α，根癌農(nóng)桿菌EHA105，由本實(shí)驗(yàn)室保存;［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成;基因測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1．2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

在［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因(1653 bp)兩端分別引入Nco I和Bam H I酶切位點(diǎn)，委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成，得到兩端帶酶切位點(diǎn)的目的基因，并用Nco I和Bam H I對其進(jìn)行雙酶切。將植物表達(dá)載體pFGC5941用Nco I和Bam H I雙酶切后回收載體骨架，表達(dá)載體骨架與目的基因按摩爾數(shù)之比1∶5的比例混合，然后加入2 μl 10×T4DNA Ligase buffer和1μl T4DNA連接酶，補(bǔ)足滅菌水至終反應(yīng)體積20 μl，22℃連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、雙酶切和測序鑒定，以確定成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pFGC5941-EβF。

1．3 轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)化

培養(yǎng)大腸桿菌陽性克隆子，提取陽性大腸桿菌的質(zhì)粒DNA，并用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后對其進(jìn)行菌落PCR鑒定，培養(yǎng)陽性農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化鄭58種子。

1．4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

取轉(zhuǎn)化后的玉米植株葉片，采用CTAB法提取玉米基因組DNA。根據(jù)［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因序列設(shè)計(jì)PCR引物。EβF合成酶基因的上下游引物為EβF-F1，ccatggctacaaacggcgtc;EβF-R1，ggatcctcaaaagactatggcatcaacaaag擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1661 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μl 2×PCR buffer，1 μl dNTPs，0．2 μl DNA模板，上下游引物各2 μl，1 μl DNA Polymerase，加滅菌水至50 μl，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)最后72℃徹底延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．5 轉(zhuǎn)基因植株的除草劑抗性檢測

將PCR檢測陽性的幼苗移栽至大田，自交授粉收獲種子。將收獲的玉米種子播種在營養(yǎng)缽內(nèi)，放置人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)基因幼苗長至3葉期時(shí)，噴灑0．2%的PPT溶液進(jìn)行除草劑篩選，每天1次，連續(xù)噴灑2，5 d后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2．1 重組表達(dá)載體pFGC5941-EβF的構(gòu)建

用Nco I和Bam H I對質(zhì)粒pFGC5941進(jìn)行雙酶切，切去的片段大小為1388 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)生2條帶，大小與預(yù)期一致。切膠回收長度為10 017 bp的載體骨架。將目的基因與切膠回收得到的載體骨架用T4連接酶進(jìn)行連接(圖1)。

2．2 重組表達(dá)載體鑒定

2．2．1 雙酶切鑒定重組表達(dá)載體pFGC5941-EβF經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生10 017 bp的大片段和1661 bp的目的小片段。

雙酶切鑒定結(jié)果表明，目的基因EβF合成酶基因已成功連接到pFGC5941載體上，構(gòu)建的表達(dá)載體pFGC5941-EβF正確(圖2)。

2．2．2 測序鑒定重組表達(dá)載體構(gòu)建后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，再對目的基因進(jìn)行測序，經(jīng)與目的基因進(jìn)行比對，序列完全一致，測序結(jié)果見圖3。

2．3 轉(zhuǎn)基因植株獲得

經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化后植株的PCR檢測，共得到22株擬轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。

2．4 轉(zhuǎn)化植株除草劑抗性分析

圖1 Nco I和BamH I雙酶切電泳圖Fig．1Electrophoretogram of products digested by double enzymes

圖2 重組表達(dá)載體pFGC5941-EβF的雙酶切鑒定Fig．2Identification of the recombinant expression vector pFGC5941-EβF by double enzyme digestion

22株擬轉(zhuǎn)基因植株自交授粉結(jié)實(shí)后，對其后代分別進(jìn)行除草劑抗性篩選，幼苗長至3葉期時(shí)，噴灑0．2%的PPT溶液，每天1次，連續(xù)噴灑2 d，5 d后觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，22株轉(zhuǎn)化玉米植株中18株表現(xiàn)出除草劑抗性，可初步確定這18株為轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖5)。

圖3 EβF合成酶基因的測序Fig．3Sequence of EβF synthase gene

圖4 EβF合成酶基因PCR檢測Fig．4EβF synthase gene PCR detection of putative transformant

圖5 T1代植株除草劑篩選Fig．5T1 plantlets herbicide-resistant test

2．5 轉(zhuǎn)基因陽性植株P(guān)CR檢測

根據(jù)Bar基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物為Bar-F1;gcaccatcgtcaaccactacat下游引物為Bar-R1，tgtgcctccagggacttca擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為286 bp。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，陽性對照及除草劑抗性植株均能擴(kuò)增出目的基因片段，而陰性對照不能擴(kuò)增出目的條帶。Bar引物擴(kuò)增片段與預(yù)期大小286 bp相符。PCR檢測進(jìn)一步確定了除草劑抗性的18株植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株，表明抗蟲基因EβF合成酶基因已整合到玉米基因組中(圖6)。

圖6 Bar基因PCR檢測Fig．6Bar gene PCR detection of putative transformant

3 結(jié)論與討論

本研究將［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因與植物表達(dá)載體pFGC5941連接，成功構(gòu)建pFGC5941-EβF重組表達(dá)載體，采用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，然后用農(nóng)桿菌侵染玉米芽尖將EβF合成酶基因轉(zhuǎn)入玉米自交系鄭58，并對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測和除草劑抗性篩選，共獲得18株轉(zhuǎn)基因陽性植株。

英國洛桑研究所2005年從歐洲薄荷中克隆到［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因，該基因有1653個(gè)核苷酸組成，編碼550個(gè)氨基酸［6］。由于［反］-β-法尼烯(EβF)合成酶基因?qū)ρ料x有明顯的驅(qū)避作用［4，10，13］，該基因越來越多地被應(yīng)用到基因工程中。本研究選用的35S啟動(dòng)子是一種強(qiáng)啟動(dòng)子，可提高轉(zhuǎn)基因玉米［反］-β-法尼烯(EβF)的表達(dá)水平，提高其抗蟲性，被廣泛應(yīng)用于植物基因轉(zhuǎn)化中。為了得到更加純合的轉(zhuǎn)基因植株，需要對轉(zhuǎn)基因植株的后代進(jìn)行進(jìn)一步的分子檢測如Southern blotting和Western blotting等，經(jīng)過連續(xù)多代自交篩選，可得到純合的轉(zhuǎn)基因植株。另外，EβF合成酶基因還可以與Bt基因或其他抗蟲基因構(gòu)建雙價(jià)或多價(jià)抗蟲植物表達(dá)載體，拓寬抗蟲譜，培育出具有高效廣譜抗蟲性的轉(zhuǎn)基因玉米。

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(責(zé)任編輯 陳虹)

Transformation of(E)-β-farnesene Synthase Gene into Maize and Preliminary Screening

XING Xiao-long1，CHANG Ji-ping1，F(xiàn)U Zhong-jun2，HU De-sheng1，HU Yan-min1*
(1．College of Agronomy，Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops，Henan Zhengzhou 450002，China;2．Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 401329，China)

To obtain insect-resistant transgenic maize，(E)-β-farnesene synthase gene was transferred into maize，which was identified and screened．The Nco I and Bam H I enzyme cutting sites were separately added at both ends of the(E)-β-farnesene synthase gene．This sequence was artificially synthesized．The desired gene was ligated into vector pFGC5941 by double enzyme digestion and DNA ligase to construct ecombinant expression vector pFGC5941-EβF，which were sequenced and identified by double enzyme digestion．The result showed that the vector pFGC5941-EβF was successfully constructed．Then pFGC5941-EβF was transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 that infected shoot apical growing point of maize Zheng58．The transgenic maize plants were identified by herbicide-resistant and PCR amplification for bar and EβF synthase genes，and a total of 18 positive transgenic maize plants were obtained．

(E)-β-farnesene synthase gene;Maize;Construction of expression vector;Transgenic plants

S513．038

A

1001－4829(2017)1－0001－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．001

2016－01－10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071431)

邢小龍(1989－)，男，河南舞陽人，從事玉米生物技術(shù)育種研究，E-mail:xingxiaolong2013@163．com，*為通訊作者:胡彥民，E-mail:huyanmin007@163．com。