［KH－*3D］付小康，常紀(jì)蘋，宋蕊芳，邢小龍，胡德升，胡彥民*，鐘立華

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002;2．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南昆明650201)

長期繼代下玉米愈傷組織差異蛋白的雙向電泳分析

［KH－*3D］付小康1，常紀(jì)蘋1，宋蕊芳2，邢小龍1，胡德升1，胡彥民1*，鐘立華1

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002;2．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南昆明650201)

實(shí)驗(yàn)以玉米自交系齊319幼胚進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)，提取繼代5次和10次的胚性愈傷組織中可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳。運(yùn)用2-D凝膠圖像分析軟件PDQuest進(jìn)行分析，探究玉米胚性愈傷組織長期繼代培養(yǎng)的分子調(diào)控機(jī)理。結(jié)果表明，長期繼代10次相比5次共有20個(gè)有明顯差異的蛋白點(diǎn)，其中14個(gè)表達(dá)下調(diào)，6個(gè)表達(dá)上調(diào)。通過質(zhì)譜分析及搜索數(shù)據(jù)庫鑒定出14-3-3-like protein GF14-12和ferritin-1，chloroplastic 2個(gè)蛋白，可能是愈傷組織長期繼代后細(xì)胞生長代謝途徑受到影響的結(jié)果。

玉米;愈傷組織;繼代培養(yǎng);雙向電泳;質(zhì)譜分析

建立良好的玉米組織培養(yǎng)體系對(duì)玉米轉(zhuǎn)基因及細(xì)胞遺傳學(xué)的研究十分重要［1－4］。自1975年GREEN等［5］用玉米幼胚作為外植體獲得再生植株以來，玉米組織培養(yǎng)體系得到不斷完善，使得以此為基礎(chǔ)的突變體篩選、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)也節(jié)省了大量供體材料和人力。但大量研究［6－10］表明，在長期繼代培養(yǎng)的過程中，隨著胚性愈傷組織繼代次數(shù)的增加生長會(huì)受到抑制，例如生長量降低、再生率差等，成為制約玉米組織培養(yǎng)研究的關(guān)鍵因素。關(guān)于玉米愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響因素已有很多研究，但在蛋白質(zhì)水平上還鮮有報(bào)道。因此，研究胚性愈傷組織長期繼代過程中的蛋白質(zhì)分子表達(dá)機(jī)理，對(duì)探索玉米組織培養(yǎng)體系的研究具有很重要意義。玉米齊319是進(jìn)行愈傷組織繼代培養(yǎng)廣泛應(yīng)用的良好材料。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，探究玉米愈傷組織齊319在不同繼代次數(shù)的蛋白差異，為愈傷組織長期繼代機(jī)理的研究在分子水平上提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 供試材料

玉米自交系齊319。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 材料準(zhǔn)備挑選籽粒飽滿且生活力強(qiáng)的齊319種子種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭州科教園區(qū)，取12d左右的幼穗(取幼胚大小為1～2 mm)，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡10 min進(jìn)行表面消毒，用高溫滅菌的手術(shù)刀片取出幼胚，并使其盾片朝上，放置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在26℃的組織培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)，待形成為胚性愈傷后，轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中。幼胚愈傷組織每培養(yǎng)15 d為一個(gè)繼代周期，篩選胚性愈傷組織，繼代到新培養(yǎng)基中。所有培養(yǎng)條件均為26℃暗培養(yǎng)。在繼代5和10次時(shí)，用滅菌鑷子隨機(jī)、均勻取培養(yǎng)基中的胚性愈傷組織，冷藏于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 蛋白樣品的制備取2 g玉米愈傷組織樣品，研缽中充分研磨，①加入20 mL預(yù)冷的酚抽提提取液［1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0．1 M pH 8．8 Tris-HCl，10 mM二硫蘇糖醇(DTT)］;②15 000 r/ min、4℃離心10 min，取上清;③加入等體積平衡酚，搖勻30 min;④12 000 r/min離心5 min，取酚層，按1∶5的體積加0．1 M乙酸銨/甲醇，混勻，－20℃、30 min;⑤15 000 r/min、4℃離心5 min，得沉淀;⑥加入預(yù)冷的80%丙酮(0．07%β-巰基乙醇)，混勻，－20℃1 h，16 000 r/min、4℃離心15 min，得沉淀;⑦重復(fù)步驟⑥并過夜，最后以純丙酮代替80%丙酮;最后所得沉淀進(jìn)行冷凍干燥;⑧取適量干燥的樣品粉末，按20 μl/mg的比例加入裂解液［8M尿素(urea)、2 M硫脲(thiourea)、4%兩性電解質(zhì)(CHAPS)、2．5 μl Bio-lyte、40 mM二硫蘇糖醇(DTT)］，28℃水浴鍋中水浴溶解(不高于30℃)，并震蕩;⑨16 000 r/min、25℃離心40 min，取上清;⑩參照Bradford法［11］，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測定蛋白濃度。

1．2．3 雙向電泳玉米愈傷組織可溶性蛋白質(zhì)的雙向電泳參照O’Farrell等［12］的方法，采用24 cm p H4～7的膠條進(jìn)行水化，上樣體積450 μl，蛋白量800 μg。第一向等電聚焦36 h。S1水化，50 V→12 h;S2除鹽，200 V→1 h;S3除鹽，500 V→1 h;S4升壓，1000 V→0．5 h;S5升壓，5000 V→0．5 h;S6升壓，10 000 V→1 h;S7聚焦，10 000 V→10 h;S8保存，500 V→12 h。經(jīng)2次平衡后，轉(zhuǎn)第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用12%的分離膠及含溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖作封膠液。凝膠使用改良考馬斯亮藍(lán)染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色［固定液(40%乙醇，10%乙酸)，固定1 h，染色液(0．12%CBB G250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%乙醇)，染色l d。洗脫液為10%乙酸，經(jīng)3～4次換水至背景清晰即可進(jìn)行圖像掃描。

1．2．4 凝膠掃描與圖像分析染色后的凝膠使用alpha凝膠成像系統(tǒng)掃描獲取圖像，用PDQuest分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行背景消減，蛋白點(diǎn)的檢測及匹配等，并手動(dòng)刪除假點(diǎn)及不理想的點(diǎn)。以vol%為標(biāo)準(zhǔn)，將差異顯著點(diǎn)認(rèn)為是大于1．5倍以上的點(diǎn)。

1．2．5 差異蛋白質(zhì)MALDI-TOF-MS鑒定及數(shù)據(jù)庫對(duì)比將檢測到的差異蛋白點(diǎn)切下并分裝于1．5 mL離心管中，記錄對(duì)應(yīng)的序列編號(hào);送中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心進(jìn)行蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF-MS鑒定，并在NCBInr玉米數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 蛋白雙向電泳改進(jìn)

本實(shí)驗(yàn)參照金德善等［13］對(duì)雪蓮愈傷蛋白質(zhì)的酚法提取的基礎(chǔ)上，使80%冷丙酮沉淀蛋白過夜并高速離心，并在加入Tris飽和酚后增加室溫的震蕩時(shí)間到30 min，使蛋白質(zhì)與酚充分融合，更大程度去除蛋白樣品中雜質(zhì)、融于酚內(nèi)，提高蛋白提取效率。保持其他參數(shù)不變，對(duì)提取后的蛋白進(jìn)行600和800 μg 2種上樣量的蛋白2-D膠圖(圖1)進(jìn)行比較。通過對(duì)2-D膠圖分析比較可以看發(fā)現(xiàn)，800 μg的圖像(圖1-b)背景清晰，條紋數(shù)量減少，蛋白點(diǎn)清而明顯。600 μg(圖1-a)背景較模糊蛋白點(diǎn)不易分開。

圖1 600、800μg 2種上樣量的2-DE圖譜比較Fig．1Comparison of 2-DE maps of 600 and 800 μg sample amounts

2．2 不同繼代次數(shù)處理的雙向電泳分析

使用PDQuest分析軟件對(duì)玉米自交系齊319繼代5次(圖2-a)和10次(圖2-b)的愈傷組織進(jìn)行雙向電泳2-D膠圖分析，以差異大于1．5倍的蛋白點(diǎn)為顯著差異點(diǎn)，共識(shí)別20個(gè)酸性差異蛋白。隨著繼代時(shí)間變長，有14個(gè)表達(dá)下調(diào)，6個(gè)表達(dá)上調(diào)。

2．3 差異蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF-MS鑒定

選取10個(gè)豐度較高的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定出2個(gè)陽性結(jié)果，分別為14-3-3-like protein GF14-12和ferritin-1，chloroplastic 2個(gè)蛋白(表1)。

圖2 玉米愈傷組織蛋白雙向電泳圖Fig．2Two-dimensional gel electrophoresis of maize callus proteins

表1 繼代不同次數(shù)下玉米愈傷組織差異蛋白質(zhì)譜鑒定Table 1Identificationof differentially expressed proteins of maize callus by MALDI-TOF-MS under callus subculture

3 結(jié)論與討論

3．1 雙向電泳方法的改進(jìn)

雙向電泳中樣品制備是影響蛋白差異組學(xué)分析的關(guān)鍵因素之一，由于玉米愈傷組織在培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)，積累的酚，糖及次生代謝物較多，直接影響蛋白樣品的提取質(zhì)量。根據(jù)金德善等［13］對(duì)雪蓮愈傷蛋白提取方法的研究，酚法較其他2種TCA-丙酮法和尿素法更好，本實(shí)驗(yàn)采用酚法提取愈傷蛋白。雷震等［14］認(rèn)為80%冷丙酮過夜沉淀過夜并高速離心可以更好地去除鹽類，因此蛋白在提取時(shí)由5500 r/min提高到15 000 r/min，并增加Tris飽和酚室溫的震蕩時(shí)間。上樣量的大小一直是雙向電泳分析中一直探索的問題［15－16］，本實(shí)驗(yàn)采用600和800 μg 2種上樣量，結(jié)果表明上樣量為800 μg時(shí)2-D圖像更加清晰，適用于玉米愈傷蛋白進(jìn)行雙向電泳分析，能夠更好的滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3．2 長期繼代下蛋白的差異表達(dá)

鄧士政等［17］研究證實(shí)，玉米愈傷組織長期培育的的過程中存在愈傷組織質(zhì)量變劣，再生能力下降等問題，愈傷組織生長量、胚性愈傷組織比率和愈傷組織幼苗再生率等隨著繼代次數(shù)的增加呈下降趨勢(shì)。已有研究表明［18－19］，玉米愈傷組織在長期的培養(yǎng)過程中與氮代謝有很大關(guān)系，隨著繼代時(shí)間的延長，愈傷組織細(xì)胞內(nèi)的氮代謝發(fā)生變化，積累大量含氮的有害化合物，是影響愈傷組織培養(yǎng)的重要因素。長期繼代產(chǎn)生的有害化合物，抑制細(xì)胞生長代謝，細(xì)胞生長量及再生率降低。有研究表明［19－20］，14-3-3蛋白在植物激素調(diào)控、生長發(fā)育及營養(yǎng)代謝調(diào)控等過程中有很重要的作用，并指出其在氮代謝途徑中起到關(guān)鍵作用。Lambek等［21］研究擬南芥不同Ca2+依賴型蛋白激酶(CPKS)中發(fā)現(xiàn)，在CPK-17作用下硝酸還原酶(NP)Ser534磷酸化，14-3-3蛋白結(jié)合磷酸化后的硝酸還原酶(NR)而失去活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞體內(nèi)含氮化合物的含量，以維持正常生長代謝。

本研究中鑒定的14-3-3-like protein GF14-12與14-3-3蛋白通過同源BLAST具有相同的保守結(jié)構(gòu)域(覆蓋率為100%，相似度為99%)，認(rèn)為14-3-3-like protein GF14-12表達(dá)下調(diào)可能與愈傷組織長期繼代后氮代謝途徑失衡有直接關(guān)系。長期繼代培養(yǎng)，體內(nèi)含氮有害化合物的積累造成正常的細(xì)胞氮代謝失去平衡，影響正常生長代謝，愈傷組織生長量降低，愈傷組織細(xì)胞可溶性蛋白呈下降的表達(dá)趨勢(shì)。ferritin-1，chloroplastic蛋白在葉綠素的合成，愈傷組織再生中有很重要的作用，愈傷組織再生率下降可能也是由于長期繼代導(dǎo)致氮代謝途徑受阻該蛋白表達(dá)量下調(diào)的結(jié)果，這與Asuka Nishimura等［22］在水稻中研究的愈傷組織再生與氮代謝途徑有關(guān)相吻合。玉米愈傷組織在長期繼代過程中可能也伴隨有應(yīng)激性蛋白和其他抗性蛋白的差異表達(dá)，這也是要進(jìn)行下一步研究的要點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯 陳虹)

Analysis of Soluble Maize Callus Proteins under Long-term Subculture by Two-dimensional Electrophoresis

FU Xiao-kang1，CHANG Ji-ping1，SONG Rui-fang2，XING Xiao-long1，HU De-sheng1，HU Yan-min1*，ZHONG Li-hua1
(1．College of Agronomy，Henan Agricultural University，Henan Zhengzhou 450002，China;2．College of Resources and Environmental Sciences，Yunnan Agricultural University，Yunnan Kunming 650201，China)

In this experiment，the tissue ofmaize(Zea mays L．)inbred lines Qi319 immature embryos wasinducted and subcultured to extracted embryonic callus soluble proteins five times and ten timesin two-dimensional electrophoresis，and its molecular regulation mechanism by Software PDQuest was analyzed．The result showed that under long-term subculture，there were 20 significant difference proteins in soluble maize callus protein，of which 14 was up-expressed spot and 6 down-expressed spots．MALDI-TOF-MS analysis indicated that there were 14-3-3-like protein GF14-12and ferritin-1，chloroplastic protein，which were considered as the results of the influence of the cell growth and metabolism pathway after long-term subculture of callus．

Maize;Tissue;Subculture;Two-dimensional gel electrophoresis;MALDI-TOF-MS

S513

A

1001－4829(2017)1－0011－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．003

2016－01－25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071431)

付小康(1990－)，男，河南安陽人，碩士研究生，從事玉米生物技術(shù)育種研究，E-mail:xkang_2010@163．com，Tel: 13213181841，*為通訊作者:胡彥民(1963－)，男，河南封丘人，教授，博士，E-mail:huyanmin007@163．com。