［KH－*3D］陳誠，李強，李小林，熊川，金鑫，李萍，黃文麗*

(1．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所四川成都610066;2．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所四川成都610066)

四川藏區(qū)松櫟林下牛肝菌資源及其系統(tǒng)發(fā)育研究

［KH－*3D］陳誠1，李強1，李小林2，熊川1，金鑫1，李萍1，黃文麗1*

(1．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所四川成都610066;2．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所四川成都610066)

為了解四川藏區(qū)松櫟林下牛肝菌資源的系統(tǒng)發(fā)育地位，采用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析相結(jié)合的方法，對采集于7個地區(qū)的11株牛肝菌進行了系統(tǒng)地研究。結(jié)果表明，11株牛肝菌形態(tài)有所差異，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示它們屬于琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)、乳牛肝菌(Suillus bovinus)、褐環(huán)乳牛肝菌(Suillus luteus)、綠蓋粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)、金黃柄牛肝菌(Boletus auripes)、Boletus bainiugan和尚不能確定到屬的牛肝菌。研究結(jié)果表明，四川藏區(qū)松櫟林下牛肝菌資源豐富，對該區(qū)域的牛肝菌資源的探索具有廣闊的前景。

藏區(qū);松櫟林;牛肝菌

牛肝菌是對一類真菌的統(tǒng)稱，在我國，鄧叔群先生首先對牛肝菌進行研究，他在《中國的真菌》中記錄了國內(nèi)的35種牛肝菌［1］。我國的西南地區(qū)，包括四川、云南、西藏、貴州等地的牛肝菌資源最為豐富［2］。牛肝菌中大部分為可食用種類，含有豐富的微量元素和必需氨基酸，具有豐富的營養(yǎng)價值。以美味牛肝菌為例，它香濃味美，每百克干菇中含蛋白質(zhì)20g、脂肪4．0 g，含有全部20種氨基酸、多種微量元素和維生素［3］。目前牛肝菌的新種也不斷被發(fā)現(xiàn)［4－5］，牛肝菌研究前景廣闊。四川藏區(qū)牛肝菌資源豐富，松櫟林下多為松茸資源產(chǎn)地，生境特殊，也不乏豐富的牛肝菌資源。朱小強等［6］對松櫟林土壤表層、根際及土壤剖面上土壤的有機質(zhì)、全氮、速效氮進行研究發(fā)現(xiàn)，松櫟林有富積養(yǎng)分的效應(yīng)，能積累有機質(zhì)，有利于改善土壤肥力。張艷秋等［7］對西藏藏區(qū)和云南藏區(qū)牛肝菌資源進行系統(tǒng)發(fā)育研究，收集到29種牛肝菌資源，其中擬定新種2個。對于四川藏區(qū)特別是松櫟林牛肝菌資源的研究尚無系統(tǒng)的研究報道。

本研究牛肝菌的采集地主要分布于涼山州普格縣的3個鄉(xiāng)鎮(zhèn)、德昌縣、冕寧縣、阿壩州理縣的兩個鄉(xiāng)鎮(zhèn)松櫟林下，海拔跨度為1863～3021 m，該地區(qū)具有獨特的氣候和地貌條件，通過對該區(qū)域內(nèi)的牛肝菌資源進行系統(tǒng)發(fā)育研究，能夠了解該地區(qū)牛肝菌資源的分布特點，豐富牛肝菌資源庫，為牛肝菌的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 樣品采集

2014年7 月從四川藏區(qū)涼山州和阿壩州各縣的松櫟林下采集牛肝菌樣品，具體樣品編號和對應(yīng)的采集地點見表1。

表1 樣品及采樣地位置Table 1Plants sample and the locations of sampling sites

1．2 牛肝菌生境調(diào)查及形態(tài)學(xué)鑒定

首先對牛肝菌的生態(tài)因子進行調(diào)查，包括林地類型、坡向、海拔、土壤類型等。然后參照李小林等［8］方法對牛肝菌子實體鮮品進行形態(tài)特征描述。

1．3 子實體DNA的提取

將牛肝菌子實體用無菌蒸餾水洗凈后，再用75 %的乙醇清洗3次，然后用無菌蒸餾水清洗干凈，再采用OMEGA Fungal DNA提取試劑盒對牛肝菌子實體進行DNA提取。提取完成后用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格樣品置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 牛肝菌ITS擴增及測序

選用真菌通用引物ITS1和ITS4對牛肝菌子實體DNA進行擴增，其引物序列如下:ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')，ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'):反應(yīng)體系(30 μl):Mix緩沖液(天根生化，北京)15 μl，引物(10 μmol/L)各0．5 μl，模板DNA為1 μl，ddH2O補足至30 μl。PCR擴增條件為:94℃5 min;94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，30個循環(huán);72℃10 min;PCR完成后用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100 V，電泳時間為20 min。PCR產(chǎn)物檢測合格后，將目的條帶進行切膠純化，純化樣品送至上海生物工程有限公司進行測序。

1．5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將牛肝菌樣品的測序結(jié)果在美國生物技術(shù)研究中心(National Center for Biotechnology，NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，在GenBank中尋找同源性最大的序列，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［9］。

2 結(jié)果與分析

2．1 各牛肝菌生境及子實體形態(tài)

由圖1可看出，所有采集的牛肝菌樣品的大小、形狀、顏色等存在較大差異，其生境有所不同。

由表2可看出，各牛肝菌樣品生長的環(huán)境各不相同，有松樹林、櫟林，也有松櫟混交林，既存在于干燥的環(huán)境，也存在于濕潤的環(huán)境，土壤類型有粘土和砂土。牛肝菌的子實體形態(tài)也有較大區(qū)別，菌蓋顏色、菌蓋表面的特征、菌柄的顏色、菌肉的顏色有較大的區(qū)別。在相似的生境條件下的牛肝菌外形特征有一定的相似性，如SAAS18-35、SAAS18-39和SAAS18-40都處于櫟林下，環(huán)境干燥，土壤為砂土，它們的表面為角質(zhì)，和濕潤環(huán)境下的牛肝菌有較大區(qū)別。

2．2 系統(tǒng)發(fā)育分析

從圖2可以看出，所有牛肝菌分為2個大簇，簇Ⅰ包含SAAS18-18、SAAS18-3、SAAS18-6、SAAS18-15、SAAS16-23和SAAS16-25共6株牛肝菌。其中SAAS18-18、SAAS18-3和SAAS18-6的親緣關(guān)系較進，SAAS18-18和SAAS18-3和琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)聚在一起，SAAS18-6與它們有一定的差異;SAAS18-5與乳牛肝菌(Suillus bovinus)聚在一起，同源性高達100%;SAAS16-25與褐環(huán)乳牛肝菌(Suillus luteus)聚在一起，SAAS16-23和它們整體聚為一個分支，但同時與不可培養(yǎng)菌根菌(Uncultured mycorrhizal)相似性更大。

圖1 牛肝菌子實體Fig．1Fruiting bodies of boletes

表2 牛肝菌樣品生境及子實體形態(tài)Table 2Habitats and fruit bodies of boletes sample

簇Ⅱ中包含SAAS18-39、SAAS18-35、SAAS18-19、SAAS18-22和SAAS18-40共5株牛肝菌，其中SAAS18-39與綠蓋粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)聚在一起，同源性高達100%;SAAS18-35與牛肝菌科的一株參比菌株聚在一起，尚不能確定種類;SAAS18-19與金黃柄牛肝菌(Boletus auripes)聚在一起，同源性為99%;SAAS18-22和SAAS18-40與Boletus bainiugan聚在一起，其中SAAS18-40與參比序列的親緣性更大，SAAS18-22和它們有一定的差異。

從整個系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，四川藏區(qū)松櫟林下牛肝菌資源豐富，種類各異，大部分可確定所屬的種類，一部分種屬尚不明確，還需要進一步研究。

圖2 四川藏區(qū)松櫟林下牛肝菌ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．2Phylogentic tree constructed by boletes ITS in pine oak forest in Tibetan of Sichuan province

3 討論與結(jié)論

四川藏區(qū)松櫟林地勢遼闊，土壤條件和生態(tài)環(huán)境特殊，很多牛肝菌是具有經(jīng)濟價值的藥食兩用真菌，因此，開展對四川藏區(qū)松櫟林牛肝菌資源的調(diào)查具有重要的意義。

從牛肝菌子實體形態(tài)和生境的分析結(jié)果可以看出，在濕潤環(huán)境下的較多牛肝菌表面也濕潤;所有環(huán)境干燥，土壤為砂土的牛肝菌表面干燥且為角質(zhì)，這與濕潤環(huán)境下的牛肝菌有較大區(qū)別。魯永新［10］等對楚雄州的野生食用菌生境和氣候進行分析，總結(jié)出野生食用菌在子實體收獲盛期熱量和降水適中，且變幅小。說明牛肝菌品種與環(huán)境有較強的對應(yīng)關(guān)系，具體機制需進一步研究。

從牛肝菌系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果可看出，采集的牛肝菌樣品屬于琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)、乳牛肝菌(Suillus bovinus)、褐環(huán)乳牛肝菌(Suillus luteus)、綠蓋粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)、金黃柄牛肝菌(Boletus auripes)、(Boletus bainiugan)。有對于琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)的研究發(fā)現(xiàn)，從中提取的粘蓋牛肝菌素是人體肝癌HepG2細胞有效的細胞凋亡誘導(dǎo)劑，為新抗癌劑的選擇提供了參考［11］。乳牛肝菌(Suillus bovinus)是一種可食用的牛肝菌，有研究表明，它的提取物對木霉病原菌具有抗菌活性，可作為抗菌化合物的備用選則［12］。褐環(huán)乳牛肝菌(Suillus luteus)是一種食藥兼用的牛肝菌，有研究發(fā)現(xiàn)，它含有膽堿(choline)及腐胺(putrescine)等生物堿，具有抗癌作用［13］。綠蓋粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)是一種可食用的牛肝菌，有對該屬牛肝菌菌絲發(fā)酵液成分分析的研究表明，其含有對大多數(shù)需氧腐生植物病原菌具有顯著作用的小奧德蘑素，應(yīng)用前景廣闊［14］。黃柄牛肝菌也是一種可食用的牛肝菌，其子實體中等至較大，菌肉厚，是林區(qū)常見的牛肝菌品種［15］。從聚類結(jié)果可以看出，采自于德昌縣和冕寧縣的兩株牛肝菌與Boletus bainiugan和Boletus meiweiniuganjun，這兩株菌是Bryn T．M在超市中購買到的來自于中國的牛肝菌干品，Bryn T．M證實這兩株菌是未被發(fā)現(xiàn)的新種，進而進行鑒定和命名［16］。可見，四川藏區(qū)松櫟林下牛肝菌資源種類各異，應(yīng)用前景廣闊。

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(責(zé)任編輯 陳虹)

Resources of Boletes in Pine Oak Forest in Tibetan of Sichuan Province and Their Phylogenetic Relationship Construction

CHEN Cheng1，LI Qiang1，LI Xiao-lin1，XIONG Chuan1，JIN Xin1，LI Ping1，HUANG Wen-li1*
(1．Institute of Biological＆Nuclear Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2．Soil and Fertilizer Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China)

In order to understand the phylogenetic position of boletes in pine oak forest in Tibetan of Sichuan province，the morphological and ITS sequencing methods were used to systematically study the eleven strains of boletes from seven places．The results showed that the shapes of the eleven strains of boletes had differences，which were phylogenetically categorized into Suillus placidus，Suillus bovinus，Suillus luteus，Tylopilus virens，Boletus auripes，Boletus bainiugan and unknown boletes which could not be identified to genus level．It was conclude that the resources of boletes in pine oak forest in Tibetan of Sichuan province was rich．It is prospective for us to explore resources of boletes in this area．

Tibetan;Pine oak forest;Boletes

S567．3

A

1001－4829(2017)1－0183－05

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．031

2015－04－20

四川省科技支撐計劃項目(2013NZ0029＆2014FZ00 04)

陳誠(1991－)，男，四川宜賓人，碩士研究生，主要研究方向為植物微生物資源與利用，E-mail:598506100@qq．com，電話:18200353183，*為通訊作者。