段 楠 劉 怡 李海霞 焦莉莉

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

·基礎(chǔ)研究 ·

糖化白蛋白誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷與炎性反應(yīng)的表達(dá)

段 楠 劉 怡 李海霞*焦莉莉

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

目的 探討在糖化白蛋白(glycated albumin，GA)刺激下，人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞系)中腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)及炎性反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。方法 分別采用不同濃度的GA與白蛋白(albumin，Alb)刺激HK-2細(xì)胞12 h、24 h及48 h，通過(guò)real-time PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)分別檢測(cè)NGAL、KIM-1的mRNA表達(dá)與蛋白釋放水平，并運(yùn)用流式液相多重蛋白定量技術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)和可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1，sICAM-1)等細(xì)胞因子的濃度。結(jié)果 與對(duì)照組與Alb組比較，GA刺激HK-2細(xì)胞12 h、24 h和48 h均能顯著上調(diào)KIM-1和NGAL的mRNA表達(dá)(P<0.05)以及KIM-1和NGAL蛋白的釋放(P<0.05)；GA組sICAM-1、VEGF與IL-8水平在各時(shí)間點(diǎn)均高于Alb組和對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 GA能上調(diào)KIM-1和NGAL mRNA的表達(dá)與蛋白的釋放，并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌從而對(duì)腎小管造成損傷，提示GA可反映糖尿病腎臟受累情況。

糖化白蛋白；近端腎小管上皮細(xì)胞；腎損傷分子-1；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白；細(xì)胞因子

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最主要的微血管病變之一，為終末期腎病的主要病因之一。自2011年以來(lái)，我國(guó)糖尿病相關(guān)的慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)比例已超過(guò)腎小球腎炎導(dǎo)致的CKD[1]。2型DM導(dǎo)致的DKD中，腎小球的病理改變并不常見(jiàn)，主要病變是小管間質(zhì)炎性反應(yīng)或血管損傷[2]。晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)與DM血管合并癥如DKD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3]。糖化白蛋白(glycated albumin，GA)是AGEs的前體之一，主要應(yīng)用于監(jiān)測(cè)近期(2～3周)血糖的控制情況。有實(shí)驗(yàn)[4]證明GA能夠促進(jìn)近端腎小管上皮細(xì)胞中炎性反應(yīng)因子如可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1，sICAM-1)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的釋放，上調(diào)腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)的合成[5]，但腎小管損傷標(biāo)志物中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的表達(dá)如何尚不明確。本研究擬進(jìn)一步以不同濃度的GA刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞系)，并于不同時(shí)間點(diǎn)觀察腎小管損傷相關(guān)分子NGAL和KIM-1及炎性反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人GA、人白蛋白(albumin，Alb)(Sigma公司，美國(guó))，DMEM F-12培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))，青霉素、鏈霉素和兩性霉素B(Lonza公司，美國(guó))，胰蛋白酶消化液(Gibco公司，美國(guó))，Trizol試劑(Invitrogen公司，美國(guó))，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))，SYBR?GreenPCR熒光染料(Invitrogen公司，美國(guó))，人類KIM-1和NGAL Elisa試劑盒(R&D公司，美國(guó))，人類VEGF、TNF-α、IL-8和sICAM-1流式液相多重蛋白定量試劑盒(BD公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)使用人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞系，購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清體積比，1×10 000 U/L青霉素、10 000g/L鏈霉素及20g/L兩性霉素B的DMEM-F12培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)于37 ℃、 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2飽和濕度空氣培養(yǎng)箱。倒置顯微鏡下觀察形態(tài)，3d左右HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層細(xì)胞，呈典型的鋪路石狀鑲嵌排列。

1.2.2 細(xì)胞分組與刺激

取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞接種于6孔版，待細(xì)胞生長(zhǎng)至視野70%～80%匯合時(shí)，無(wú)血清DMEM-F12培養(yǎng)基同步化12 h，隨機(jī)分成對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組：(1)空白對(duì)照組：無(wú)刺激；(2)人Alb對(duì)照組：4個(gè)Alb濃度梯度亞組(0.5 g/L、1.0 g/L、5 g/L[5]、10 g/L)(3)人GA組：分為2個(gè)GA濃度梯度亞組(0.5 g/L[5]、1.0 g/L)。對(duì)以上各組細(xì)胞分別進(jìn)行12 h、24 h與48 h的刺激。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定細(xì)胞中KIM-1與NGAL mRNA含量

按照Trizol說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，以2 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在ABI 7500儀器(Life Tech, Applied Biosystems)進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)?？偡磻?yīng)體積20L，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s及退火60 ℃ 60 s(共40個(gè)循環(huán))。引物設(shè)計(jì)使用Primer Premier 6.0，由生工(上海)公司合成，稀釋為 10 μmol/L工作液，序列見(jiàn)表1。每次3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。目的基因mRNA Ct 值用GAPDH Ct值校正。根據(jù)所得Ct值，運(yùn)用2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算內(nèi)參、目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)測(cè)定培養(yǎng)上清液中KIM-1與NGAL濃度

各組細(xì)胞在相應(yīng)物質(zhì)不同濃度與不同時(shí)間刺激后，分別收集上清液。按照說(shuō)明書進(jìn)行ELISA反應(yīng)，各步驟結(jié)束后30 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處讀取每孔吸光度值，根據(jù)吸光度值與倍比稀釋濃度建立KIM-1和NGAL濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中KIM-1和NGAL濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取。

1.2.5 流式液相多重蛋白定量檢測(cè)培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子濃度

各組細(xì)胞在相應(yīng)物質(zhì)不同濃度與不同時(shí)間刺激后，分別收集上清液。按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作各步驟，使用CantoⅡ儀器(BD)應(yīng)用流式技術(shù)讀取上樣管中位熒光強(qiáng)度值，根據(jù)中位熒光強(qiáng)度值與倍比稀釋濃度分別建立VEGF、TNF-α、IL-8和sICAM-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中細(xì)胞因子濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GA與Alb對(duì)HK-2細(xì)胞KIM-1和NGAL mRNA表達(dá)的影響

HK-2細(xì)胞用不同濃度GA和Alb(0.5 g/L GA與等量0.5 g/L Alb和10倍量5 g/L Alb組；1.0 g/L GA與等量1.0 g/L Alb和10倍量10 g/L Alb組)刺激12 h、24 h和48 h后，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KIM-1和NGAL mRNA的表達(dá)。細(xì)胞在3組時(shí)間刺激下KIM-1和NGAL mRNA的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.070,P=0.150)，不同Alb濃度組KIM-1、NGAL mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白對(duì)照組和Alb對(duì)照組比較，GA刺激HK-2細(xì)胞12 h、24 h和48 h后，都顯著提高每個(gè)時(shí)間點(diǎn)KIM-1和NGAL mRNA的表達(dá)(P<0.05)。0.5 g/L GA組與1.0 g/L GA組相比，具有較高的KIM-1和NGAL mRNA的表達(dá)，其中24 h的KIM-1 mRNA和12 h的NGAL mRNA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2 GA與Alb對(duì)HK-2細(xì)胞KIM-1和NGAL釋放的影響

刺激24 h后細(xì)胞KIM-1的釋放顯著高于12 h (P<0.05)，但NGAL的釋放在12 h與24 h之間無(wú)顯著性改變(P=0.140)；刺激48 h后細(xì)胞KIM-1和NGAL的含量均顯著高于12 h與24 h(P<0.05)，達(dá)到最高水平。與空白對(duì)照組比較，GA刺激12 h時(shí)HK-2細(xì)胞KIM-1和NGAL均出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)，刺激24 h二者的變化均不明顯，刺激48 h時(shí)KIM-1含量顯著升高(P<0.05)，而NGAL濃度的改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Alb對(duì)照組比較，GA刺激12 h后0.5 g/L GA組中KIM-1釋放顯著高于0.5 g/L Alb組(P<0.05)，NGAL釋放改變不明顯。刺激24 h后，1.0 g/L GA組KIM-1顯著高于10 g/L Alb組(P<0.05)，0.5 g/L GA組NGAL的釋放顯著高于5 g/L Alb組(P<0.05)(圖2)。刺激48 h后，KIM-1和NGAL的釋放均在0.5 g/L GA組顯著高于 5 g/L Alb組，在1.0 g/L GA組顯著高于1.0 g/L Alb組(P<0.05)(圖2)。

圖1 不同濃度下各時(shí)間點(diǎn)GA與Alb對(duì)HK-2細(xì)胞KIM-1及NGAL mRNA水平的影響

圖2 不同濃度下各時(shí)間點(diǎn)GA與Alb對(duì)HK-2細(xì)胞釋放KIM-1及NGAL的影響

2.3 GA與Alb對(duì)HK-2細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響

各刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中均未檢測(cè)到TNF-α有效值。刺激HK-2細(xì)胞不同時(shí)間后，24 h下細(xì)胞sICAM-1、VEGF和IL-8的含量顯著高于12 h(P<0.05)；48 h下各組細(xì)胞上述因子的濃度顯著高于12 h與24 h(P<0.05)，達(dá)到最高水平。與對(duì)照組相比，GA組具有顯著較高的sICAM-1(圖3A)、VEGF(圖3B)和IL-8(圖3C)水平(P<0.05)；與Alb組相比，GA組也同樣具有較高的sICAM-1、VEGF和IL-8釋放。其中，GA刺激12 h后，sICAM-1、VEGF和IL-8含量均顯著高于相應(yīng)Alb組(P<0.05)；刺激24 h后，s-ICAM和VEGF的釋放顯著高于相應(yīng)Alb組(P<0.05)，IL-8含量改變不明顯；刺激48 h后，1.0 g/L GA組sICAM-1含量顯著高于相應(yīng)Alb組(P<0.05)，VEGF釋放改變不明顯，0.5 g/L GA組IL-8顯著高于5 g/L Alb組(P<0.05)。另外，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)1.0 g/L GA組sICAM-1的釋放顯著高于0.5 g/L GA組(P<0.05)(圖3A)。

3 討論

本研究利用GA刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)模擬糖尿病腎病腎小管損傷的細(xì)胞模型，觀察到GA能促進(jìn)KIM-1和NGAL等腎小管損傷相關(guān)分子的表達(dá)與釋放，并且誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子VEGF、sICAM-1與IL-8的產(chǎn)生，提示AGEs能夠以GA的形式造成腎小管細(xì)胞的損傷和炎性反應(yīng)。

糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制不明，許多因素參與其發(fā)病過(guò)程。其中，持續(xù)高血糖導(dǎo)致蛋白質(zhì)非酶促糖基化所形成的AGEs可能是造成糖尿病腎臟損傷的機(jī)制之一，高血糖與AGEs共同影響腎小管的功能[3]。已知白蛋白約占人血漿蛋白濃度的70%，糖基化會(huì)影響其正常生理功能，糖化白蛋白是臨床上監(jiān)測(cè)血糖的重要指標(biāo)之一。本研究模擬體外糖基化刺激腎損傷的細(xì)胞模型，將HK-2細(xì)胞置于人血清GA與Alb的環(huán)境中，觀察GA引起的腎小管損傷相關(guān)分子和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。在刺激濃度條件選擇中，考慮到人體環(huán)境下GA與Alb比例的正常范圍，將其設(shè)立為：0.5 g/L、GA[5]0.5 g/L Alb(等量)和5 g/L Alb[5](10倍量)組，并增設(shè)了大劑量GA處理組(1.0 g/L)以及相應(yīng)的1.0 g/L Alb(等量)和10 g/L Alb(10倍量)組，探討不同濃度GA處理是否與腎小管細(xì)胞損傷和炎性反應(yīng)程度存在量效關(guān)系。

近端腎小管上皮細(xì)胞是糖尿病腎病腎小管間質(zhì)損傷和腎功能下降的關(guān)鍵所在，Ⅰ型跨膜糖蛋白KIM-1表達(dá)于去分化近端腎小管上皮細(xì)胞，在腎損傷時(shí)釋放到尿液中并且與腎小管間質(zhì)的炎性反應(yīng)和纖維化相關(guān)，被認(rèn)為是早期腎損傷的標(biāo)志物。研究[5]顯示，短時(shí)間(4 h)單純高糖處理HK-2細(xì)胞無(wú)KIM-1釋放。本研究顯示，單純Alb(同濃度及高濃度)處理對(duì)HK-2細(xì)胞KIM-1的表達(dá)沒(méi)有影響；而經(jīng)GA刺激后，HK-2細(xì)胞KIM-1 mRNA的表達(dá)和培養(yǎng)液中的蛋白含量(于48 h達(dá)到最高值)均明顯升高，以低濃度GA(0.5 g/L)組尤為明顯。已知KIM-1在腎小管損傷中的表達(dá)積聚可誘導(dǎo)慢性小管間質(zhì)炎性反應(yīng)，促使腎臟纖維化而進(jìn)一步導(dǎo)致腎功能下降。本研究結(jié)果提示GA(而非高糖或Alb)會(huì)導(dǎo)致近端腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1的表達(dá)升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)上調(diào)并釋放，可能會(huì)進(jìn)一步對(duì)腎小管功能造成損傷。

圖3 不同濃度下各時(shí)間點(diǎn)GA與Alb對(duì)HK-2細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響

NGAL是一種小分子量分泌性蛋白，在腎臟受到損傷性刺激時(shí)由腎小管上皮細(xì)胞分泌至血液、尿液中，是診斷急性腎損傷最有效的生物學(xué)標(biāo)志之一。在低蛋白飲食控制的Ⅰ型糖尿病病人中，尿NGAL每年升高15%并與終末期腎病和死亡密切相關(guān)[6]。也有研究[7]發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人NGAL的出現(xiàn)早于腎小球損傷指標(biāo)微量白蛋白尿，能早期預(yù)警糖尿病腎病的發(fā)生。本研究表明，HK-2細(xì)胞經(jīng)GA處理后，各時(shí)間點(diǎn)NGAL的mRNA表達(dá)與蛋白釋放顯著高于對(duì)照組和Alb組，且蛋白釋放在48 h達(dá)到最高值。因此，NGAL可能在糖基化誘導(dǎo)近端腎小管上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用，且一定程度上能早期評(píng)估糖尿病病人的腎臟受累情況。

有研究[8-10]顯示糖尿病腎病屬于非炎性疾病，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)糖尿病病人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的腎臟中均有巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增加以及白細(xì)胞介素、細(xì)胞黏附分子的過(guò)量產(chǎn)生[11-12]。由內(nèi)皮分泌到細(xì)胞外基質(zhì)的VEGF能夠調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞的代謝過(guò)程并抑制其凋亡；慢性炎性反應(yīng)中所涉及的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子均表現(xiàn)出促炎活性，其中主要為IL-1的表達(dá)增加，并進(jìn)一步引起VEGF、ICAM-1、IL-6、IL-8和血管緊張素Ⅱ的升高[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞中sICAM-1、VEGF和IL-8的釋放隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升并于48 h達(dá)到最高值，并且各因子在GA組中的濃度均高于對(duì)照組及Alb組。目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[11]表明白細(xì)胞介素和細(xì)胞黏附分子參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，并有體外實(shí)驗(yàn)[4]證實(shí)GA能促進(jìn)近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)sICAM-1和IL-8。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這些研究基本一致，并發(fā)現(xiàn)不同濃度GA還能夠刺激sICAM-1表達(dá)上調(diào)，且濃度為1.0 g/L GA的刺激效果強(qiáng)于文獻(xiàn)[4]所報(bào)道的0.5 g/L。這些研究結(jié)果表明GA刺激腎小管細(xì)胞表達(dá)趨化因子與黏附分子等炎性細(xì)胞因子，使炎細(xì)胞在糖尿病腎小管病變期間遷移到間質(zhì)空間(interstitial space)，進(jìn)一步對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞造成損傷。

綜上所述，作為AGEs前體，GA能上調(diào)KIM-1和NGAL等腎損傷相關(guān)分子的表達(dá)與釋放，促進(jìn)炎性反應(yīng)中sICAM-1、VEGF和IL-8等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞造成損傷。因此，對(duì)糖尿病病人進(jìn)行GA、腎損傷相關(guān)分子和細(xì)胞因子的檢測(cè)，可提示與評(píng)估糖尿病病人腎臟受累情況，預(yù)測(cè)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，也對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)GA的藥物或分子以干預(yù)糖尿病腎病提供理論依據(jù)。

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編輯 慕 萌

Effects of glycated albumin on inducing injury and inflammation in human proximal tubular epithelial cells

Duan Nan，Liu Yi，Li Haixia*，Jiao Lili

(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China)

Objective To investigate the effects of glycated albumin (GA) on the expression of kidney injury molecule-1 (KIM-1), neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and inflammatory cytokines in human proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells). Methods The HK-2 cells were treated with the different concentrations of GA and albumin (Alb) for 12h, 24h and 48h. The mRNA expressions of KIM-1 and NGAL were detected by real-time PCR. The release of KIM-1 and NGAL in the supernatants were detected by ELISA. The concentrations of VEGF, TNF-α, IL-8 and sICAM-1 were detected by cytometric beads array method. Results Compared with control and Alb groups, the mRNA levels of KIM-1 and NGAL in HK-2 cells were significantly up-regulated at 12 h, 24 h and 48 h after GA treatment (P<0.05); the protein levels of KIM-1 and NGAL released in supernatants of GA-treated cells were significantly higher than those in control group and Alb groups at the same time points (P<0.05); GA groups also had significantly higher levels of sICAM-1, VEGF and IL-8 than control group at each time point (P<0.05). Conclusion GA can up-regulate the expression and release of KIM-1 and NGAL and promote the secretion of inflammatory cytokines which could cause damage to renal tubules, suggesting that GA may reflect the diabetic renal involvement.

glycated albumin; proximal tubular epithelial cell; kidney injury molecule-1; neutrophil gelatinase-associated lipocalin; cytokines

時(shí)間：2017-04-13 19∶52

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1952.026.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.024]

R692.6

2016-12-30)

*Corresponding author， E-mail：leehaixia@139.com