鄒飛，王爽，吳思，孫崢嶸

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫(kù)，沈陽(yáng)110004；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科，長(zhǎng)春130021）

人巨細(xì)胞病毒UL145相互作用蛋白的篩選和功能分析

鄒飛1，2，王爽1，吳思1，孫崢嶸1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫(kù)，沈陽(yáng)110004；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科，長(zhǎng)春130021）

目的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與人巨細(xì)胞病毒（HCMV）UL145編碼蛋白相互作用的來(lái)源于人胎腦cDNA文庫(kù)的組織蛋白。方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增HCMVUL145片段，酶切及純化擴(kuò)增的目的片段及酵母表達(dá)載體pGBKT7，連接HCMV UL145片段及載體pGBKT7，將連接后的重組誘餌表達(dá)載體pGBKT7?UL145轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109中，再將人胎腦文庫(kù)DNA也轉(zhuǎn)化到酵母AH109中，篩選與HCMV UL145編碼蛋白相互作用的蛋白，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果最終確認(rèn)多個(gè)克隆與HCMV UL145編碼蛋白相互作用，BLAST結(jié)果顯示3個(gè)與FOXG1高度同源。結(jié)論利用酵母雙雜交系統(tǒng)成功篩選出與HCMV UL145編碼蛋白相互作用的人胎腦cDNA文庫(kù)蛋白FOXG1，推測(cè)該目的蛋白在HCMV感染所致神經(jīng)系統(tǒng)損傷過(guò)程中起重要作用。

人巨細(xì)胞病毒；UL145蛋白；酵母雙雜交系統(tǒng)；人胎腦cDNA文庫(kù)

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬皰疹病毒科β亞科，基因組大小約230 000 bp，最大編碼數(shù)超過(guò)200多個(gè)病毒蛋白，是皰疹病毒科中最大的病毒［1］。約10%感染的新生兒出生后是有癥狀的，可以留有感音性神經(jīng)性耳聾、小頭畸形、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮、肌張力減低和亢進(jìn)等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)后遺癥［2］。但該病的致病機(jī)制仍缺少報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)位于HCMV UL/b’區(qū)的UL145基因編碼蛋白互作蛋白的篩選及分析其可能的生物學(xué)功能，為研究HCMV UL145編碼蛋白在胎兒腦發(fā)育中的作用及探討HCMV感染所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本為傳代次數(shù)<5次的HCMV臨床分離株H，取材自就診于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院的HCMV感染患兒?；純耗挲g5個(gè)月，臨床表現(xiàn)包括宮內(nèi)發(fā)育遲緩、直接膽紅素升高、轉(zhuǎn)氨酶升高、間質(zhì)性肺炎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)異常等。從已感染HCMV患兒的尿液中分離出臨床分離株H，UL145基因擴(kuò)增模板采用人胚肺細(xì)胞培養(yǎng)的HCMV DNA。

Clontech公司生產(chǎn)的酵母雙雜交系統(tǒng)Match?maker GAL Two?Hybrid System；肖庚富所長(zhǎng)（中科院武漢病毒所）惠贈(zèng)的人胎腦cDNA文庫(kù)（Matchermak?erTM cDNA Libraries）；BECKMAN Allegra系列臺(tái)式超高速低溫離心機(jī)；Perkin Elmer Cetus公司PCR循環(huán)儀；美國(guó)Bio?rad MicroPulser電穿孔儀；美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司完成引物合成及測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建誘餌表達(dá)載體pGBKT7?UL145：利用HC?MV臨床分離株H感染人胚肺細(xì)胞，從中提取DNA，用其為UL145基因擴(kuò)增的模板。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HC?MV UL145片段的上下游引物（設(shè)計(jì)軟件采用Oligo 6.0），含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，序列UL145U：CCGGAATTCTTGTCGACCTACGGCGTCCTGGCTCA TTAC，UL145D：CGCGGATCCGGTACCTCAGTTAT CACTTCCACCCATC。選取HCMV DNA為模板，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)擴(kuò)增UL145目的基因片段，將獲取到的UL145目的片段及載體PGBK?T7進(jìn)行雙酶切并切膠回收后純化，連接純化好的UL145片段與載體PGBK?T7。轉(zhuǎn)化連接后的pGBKT7?UL145到大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中，菌液進(jìn)行抗性篩選。采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)鑒定重組克隆，將陽(yáng)性克隆送至英杰生命技術(shù)有限公司，引物選取pGBKT7通用引物進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.2 篩選與HCMV UL145互作的胎腦文庫(kù)蛋白：（1）對(duì)人胎腦cDNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，采用堿裂解法提取文庫(kù)質(zhì)粒，文庫(kù)酵母表達(dá)載體為pACT2（含轉(zhuǎn)錄激活域）。（2）應(yīng)用小劑量醋酸鋰酵母轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化pGB?KT7?UL145誘餌表達(dá)載體到酵母細(xì)胞AH109中，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率后進(jìn)行篩選，將提取的文庫(kù)質(zhì)粒也轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中。（3）已轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒及文庫(kù)質(zhì)粒計(jì)算轉(zhuǎn)化效率并做顯色反應(yīng)篩選顯藍(lán)色的陽(yáng)性單克隆。（4）將陽(yáng)性單克隆擴(kuò)增后提取酵母質(zhì)粒，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，篩選出人胎腦cDNA文庫(kù)克隆。（5）提取文庫(kù)克隆質(zhì)粒并將其回轉(zhuǎn)到含有誘餌載體pGBKT7?UL145的酵母AH109中進(jìn)行驗(yàn)證，涂二缺平板后計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，涂四缺平板做顯色反應(yīng)。挑選與HCMV?UL145相互作用的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，利用GenBank的數(shù)據(jù)庫(kù)資源進(jìn)行比較，對(duì)結(jié)果進(jìn)行BLAST分析。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建誘餌表達(dá)載體pGBKT7?UL145并鑒定

成功擴(kuò)增出HCMVUL145基因片段，長(zhǎng)度大小為393 bp，瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶大小與預(yù)期一致且無(wú)非特異性條帶，將已成功連接HCMVUL145目的片段與pGBKT7的誘餌載體命名為pGBKT7?UL145。應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定（引物選取pGBKT7兩端及UL145片段的上下游引物）含pGBKT7?UL145質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆顯示結(jié)果正確。用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)提取的pGBKT7?UL145質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示可見(jiàn)大小約393 bp及7 500 bp 2條目的條帶，送測(cè)序分析顯示與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖1。

圖1 pGBKT7?UL145的成功克隆Fig.1 Cloning of pGBKT7?UL145

2.2 文庫(kù)的篩選及顯色反應(yīng)

轉(zhuǎn)化胎腦cDNA文庫(kù)質(zhì)粒到含有誘餌載體pGB?KT7?UL145的酵母細(xì)胞AH109中，菌液涂二缺平板后共長(zhǎng)出132個(gè)克隆，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率為4.6×103cfu/μg，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。在四缺培養(yǎng)基做顯色反應(yīng)有28個(gè)菌落呈藍(lán)色，挑取顯藍(lán)色的酵母菌落進(jìn)行擴(kuò)增，成功提取酵母質(zhì)粒。

2.3 篩選的酵母質(zhì)粒回轉(zhuǎn)含UL145基因的酵母菌中

采用電轉(zhuǎn)化法將成功提取的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，菌液涂含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基，鑒定轉(zhuǎn)化后的文庫(kù)信息，將選出的7個(gè)陽(yáng)性克隆質(zhì)?；剞D(zhuǎn)到含誘餌載體pGBKT7?UL145的酵母細(xì)胞AH109中，菌液涂布于二缺及四缺固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況。送測(cè)序提示與UL145編碼蛋白發(fā)生相互作用的陽(yáng)性克隆為7個(gè)，運(yùn)用BLAST分析顯示其中3個(gè)克隆與FOXG1高度同源，見(jiàn)表1，圖2。

3 討論

圖2 轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定Fig.2 Identification of transformed colonies by PCR

HCMV通過(guò)編碼蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主的致病性，同時(shí)也決定其毒力的強(qiáng)弱［3］。目前認(rèn)為HCMV臨床株含有19個(gè)新基因，位于長(zhǎng)獨(dú)特序列UL與反向重復(fù)序列b’區(qū)的交界區(qū)（UL/b’區(qū)），在病毒體內(nèi)復(fù)制、潛伏、免疫逃逸和對(duì)宿主的致病性方面起重要作用。而HCMVUL145正是這19個(gè)基因之一，具有高度保守性且為細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)因子直接與DNA相互作用，故UL145對(duì)病毒的復(fù)制和傳播可能起到重要作用［4］。文獻(xiàn)報(bào)道HCMVUL145基因含有兩種轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，它既可以與上游的UL144基因形成多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄，還可以在感染晚期做為單順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄［5］。臨床株HCMV UL145編碼蛋白似乎不是分泌型蛋白，它含有蛋白激酶C和酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，可以直接與核酸發(fā)生相互作用［6］。通過(guò)核轉(zhuǎn)染技術(shù)將UL129、UL145和UL148傳遞到ATM缺陷型細(xì)胞系胞核內(nèi)，觀察其對(duì)基因組入核的影響，結(jié)果顯示UL129和UL145基因產(chǎn)物的過(guò)表達(dá)可能對(duì)細(xì)胞具有毒性［7］。

表1 陽(yáng)性克隆與GeneBank同源序列比較Tab.1 Comparison of positive clones with samples available in GenBank and percent homology

本研究結(jié)果顯示HCMVUL145基因編碼產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄因子FOXG相互作用。FOXG1屬于Fork?head轉(zhuǎn)錄因子基因家族，進(jìn)化上高度保守，細(xì)胞內(nèi)定位受翻譯后控制，在胞質(zhì)和胞核交替出現(xiàn)，具有轉(zhuǎn)錄活化和轉(zhuǎn)錄抑制雙重作用。FOXG1基因定位于人類最大的染色體—14號(hào)染色體上，1條或者2條同源染色體的FOXG1基因發(fā)生易位、缺失、突變等情況均導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。FOXG1基因廣泛表達(dá)于大腦皮層，轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)FOXG1蛋白表達(dá)劑量不足［8］，可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，表現(xiàn)為人腦體積縮小及形態(tài)異常，引起癲癇及智力低下。研究［9］表明FOXG1單倍劑量不足導(dǎo)致小鼠和人視皮質(zhì)功能損傷。部分重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)現(xiàn)FOXG1基因存在突變或失常，包括存在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的瑞氏綜合征，其伴有早期癲癇和先天癥狀的多樣性和FOXG1基因的突變相關(guān)［10］。在孤獨(dú)癥譜系障礙疾病中，過(guò)多的GABA能神經(jīng)元造成了體內(nèi)谷氨酸/GABA神經(jīng)元比率的失衡，被認(rèn)為參與了孤獨(dú)癥譜系障礙疾病的發(fā)病過(guò)程中，而轉(zhuǎn)錄因子FOXG1過(guò)表達(dá)正是GABA能神經(jīng)元產(chǎn)量過(guò)多的原因［11］。FOXG1的亞細(xì)胞定位可能在細(xì)胞分化、復(fù)制和生物能量轉(zhuǎn)化中起到重要作用，并將線粒體功能與胚胎發(fā)育和病理狀態(tài)相聯(lián)系起來(lái)［12］。

本研究推測(cè)HCMV入侵人體后UL145編碼蛋白通過(guò)改變其自身細(xì)胞定位，對(duì)正常細(xì)胞分化、復(fù)制產(chǎn)生影響，提示FOXG1在巨細(xì)胞病毒感染引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷也可能與此相關(guān)，其具體機(jī)制有待更深層次的功能性研究。未來(lái)的研究計(jì)劃是采用免疫共沉淀及pull down技術(shù)闡明HCMV UL145編碼蛋白與FOXG1之間的關(guān)系，為解釋本病的致病機(jī)理奠定分子基礎(chǔ)。

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（編輯 于溪）

Screening and Analysis of Proteins Interacting with HCMV UL145 from a Human Fetal Brain cDNA Library

ZOU Fei1，2，WANG Shuang1，WU Si1，SUN Zhengrong1
（1.BioBank，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Pediatrics，The First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo screen a human fetal brain cDNA library for proteins that can interact with HCMV UL145 using a yeast two?hybrid sys?tem.MethodsA bait plasmid（pGBKT7?UL145）was constructed.Using HCMVUL145as bait，a human fetal brain cDNA library was screened and proteins interacting withUL145were identified using bioinformatic methods to sequence and analyze the positive clones.ResultsThree clones interacting with HCMV UL145 were found，and identified as FOXG1.ConclusionSeveral proteins interacting with HCMV UL145 in the human fetal brain cDNA library were identified as FOXG1，indicating that this protein may play an important role in the course of HCMV infection.

human cytomegalovirus；UL145 protein；yeast two?hybrid system；human fetus brain cDNA library

R373

A

0258-4646（2017）04-0309-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.04.006

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171581）

鄒飛（1983-），女，主治醫(yī)師，碩士.

孫崢嶸，E-mail：sunzr@sj?hospital.org

2016-10-12

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：