解世林，曲晶磊，范一博，車曉芳，侯科佐，曲秀娟，劉云鵬，王曉楠，康健，胡雪君

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.腫瘤內科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點實驗室；3.呼吸疾病研究所呼吸內科，沈陽110001）

·論著·

Akt和SRC在Exosomes促進同源肺癌細胞遷移中的作用

解世林1，曲晶磊2，范一博2，車曉芳2，侯科佐2，曲秀娟2，劉云鵬2，王曉楠1，康健3，胡雪君1

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.腫瘤內科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點實驗室；3.呼吸疾病研究所呼吸內科，沈陽110001）

目的研究肺癌細胞來源的Exosomes對其分泌細胞及同源腫瘤細胞遷移的影響，初步探討PI3K/Akt和SRC信號轉導通路在此過程中的作用。方法采用密度梯度離心法，從肺癌細胞A549的上清液中分離出肺癌細胞來源的Exosomes，利用透射電子顯微鏡觀察Exosomes的形態(tài)，用Western blotting實驗觀察蛋白的表達。Transwell實驗檢測細胞的遷移能力。結果透射電子顯微鏡下觀察肺癌A549細胞來源的Exosomes，其具有特征性的盤狀結構，由雙層膜構成，直徑30～100 nm。Western blotting結果顯示Exosomes表面富含CD9分子。A549細胞來源的Exosomes以劑量依賴性的方式促進A549和其同源腫瘤細胞HCC827細胞的遷移，并伴隨Akt和SRC的活化。結論肺癌細胞來源的Exosomes能促進其分泌細胞和同源腫瘤細胞的遷移，其機制可能與Akt和SRC的活化有關。

Exosomes；遷移；肺癌；Akt；SRC

Exosomes是納米級的由細胞分泌至胞外的囊性小泡體［1］。多種類型的細胞都可分泌Exosomes，其中包括腫瘤細胞、免疫細胞和上皮細胞等［2?4］。近年來，研究熱點主要集中于腫瘤細胞及免疫細胞分泌的Exosomes。有研究［5］顯示，腫瘤細胞來源的Exosomes可改變其周圍的微環(huán)境，從而促進腫瘤的轉移。然而，Exosomes是否能影響其分泌細胞及同源腫瘤細胞的遷移能力及其機制尚不清楚。本研究探討了肺腺癌細胞A549分泌的Exosomes對自身及同源腫瘤細胞HCC827遷移能力的影響，以及PI3K/Akt和SRC通路在其中的作用，為進一步闡明肺癌來源的Exosomes對轉移的自我調控機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

CD9、β?actin抗體購自Santa Cruze公司，phosph?Akt、Akt、phosph?SRC、SRC抗體購自美國Cell Sig?naling公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

肺癌細胞系A549、HCC827購自上海細胞庫。人肺癌細胞A549、HCC827生長于含有12 U/L慶大霉素、100 mL/L滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2的孵育箱內培養(yǎng)，2 d左右傳代1次。所有實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

1.3 Exosomes的制備

肺癌A549細胞在培養(yǎng)48 h后，收集上清液，以備提取Exosomes。首先，在4℃條件下，將收集的細胞上清液通過多步驟離心，去除細胞及細胞碎片（300g5 min、2 000g20 min、10 000g70 min）。然后將上清液移入高速離心管中，100 000g120 min。離心管中加滿PBS溶液，再次4℃100 000g120 min離心。得到提純的Exosomes沉淀。PBS 450 μL重懸，0.22 μm濾膜除菌，Bardford法測定蛋白含量，分裝后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 電鏡

Exosomes超速離心成的沉淀，于4℃經固定液（2%多聚甲醛，2.5%戊二醛）固定1 h，PBS洗滌后，再經l%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋、聚合。最后，超薄切片、鉛鈾染色，于透射電子顯微鏡下觀察并攝片。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達

提取A549細胞來源的Exosomes，經超聲破碎后加入上樣緩沖液，煮沸5 min。不同濃度（0 μg/mL，5 μg/mL，20 μg/mL）Exosomes作用于對數(shù)生長期的A549細胞48 h后，同時收集A549細胞，將其裂解，與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。將Exosomes樣品和A549細胞裂解物進行聚丙烯酰胺（SDS?PAGE）凝膠電泳，濕法轉印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入一抗，以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并處理。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移能力

采用6.5 mm直徑、10 μm厚度、8 μm孔徑的聚碳酸酯多孔濾膜（24孔板Transwell小室）。將A549或HCC827細胞（3.0×104個）懸浮于200 μL無血清RPMI1640培養(yǎng)液中，并種植在小室的上層。下室加入含2.5%血清RPMI1640培養(yǎng)液500 μL。實驗組加入15 μg/mL Exosomes，對照組加入同體積的PBS溶液。37℃培養(yǎng)24 h后，用PBS輕輕沖洗上室，用棉簽去除膜上層未遷移的細胞。37℃風干20 min后，將小室膜進行瑞氏吉姆薩法固定、染色1 h。PBS沖洗風干后，于顯微鏡下觀察穿膜細胞數(shù)，隨機取5個視野，計數(shù)5個視野穿膜細胞總數(shù)。實驗重復至少3次。遷移增加率=100%×（實驗組穿膜細胞數(shù)-對照組穿膜細胞數(shù)）/對照組穿膜細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗結果，用x±s表示。2組之間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 A549細胞來源的Exosomes的驗證

透射電子顯微鏡下觀察，肺癌A549細胞的上清液中分離出腫瘤來源的Exosomes為雙層膜構成的盤狀結構，直徑約30～100 nm（圖1A）。進一步用Western blotting檢測Exosomes的標志性蛋白，即四次跨膜分子CD9。結果發(fā)現(xiàn)Exosomes與等量的細胞裂解物相比，富含有更多的外泌體標志性蛋白CD9（圖1B）。證明成功提取了A549細胞來源的Exosomes。

圖1 肺腺癌A549細胞來源的Exosomes的驗證×50 000Fig.1 Validation of exosomes isolated from the lung adenocar?cinoma cells，A549×50 000

2.2 肺癌細胞A549來源的Exosomes促進其分泌細胞的遷移

Transwell法檢測A549細胞來源的Exosomes作用于A549細胞后，遷移能力的變化。結果表明，15 μg/mL A549來源的Exosomes作用于其自身24 h后，細胞的遷移能力明顯提高（P<0.05），見圖2。

圖2 A549來源的Exosomes促進A549細胞的遷移瑞氏吉姆薩法Fig.2 Exosomes derived from A549 cells promoted migration of A549 cells#Giemsa staining

2.3 Exosomes促進同源肺癌細胞HCC827的遷移

用Transwell法檢測Exosomes作用于肺癌細胞HCC827后，細胞遷移能力的變化。結果表明，15μg/mL A549來源的Exosomes作用于HCC827細胞24 h后，細胞的遷移能力明顯提高（P<0.01），見圖3。

2.4 Exosomes誘導其分泌細胞中Akt和SRC的活化

圖3 A549來源的Exosomes促進HCC827細胞的遷移瑞氏吉姆薩法×20Fig.3 Exosomes isolated from A549 cells promoted the migration of HCC827 cells Giemsa staining×20

Western blotting檢測不同濃度的Exosomes作用于A549細胞48 h后，Akt和SRC的表達變化。結果表明，A549細胞來源的Exosomes可以劑量依賴性的方式促進A549細胞中Akt和SRC的活化。

3 討論

Exosomes是細胞主動分泌至胞外的小囊泡，攜帶其來源細胞的重要遺傳信息，介導細胞間的信息交流，促進腫瘤的增殖及轉移等過程［6?7］。已有文獻報告，肺癌來源的Exosomes可促其轉移，然而其是否能促進其分泌細胞自身和同源腫瘤細胞的遷移及其機制尚不明確。

圖4 Western blotting檢測不同濃度的Exosomes作用于A549細胞后蛋白的表達Fig.4 Western blotting depicting the exosome?specific protein expression in response to treatment of the A549 cells with exosomes of different concentrations

既往研究［8］顯示腫瘤來源的Exosomes可改變其微環(huán)境，從而促進腫瘤的轉移。胰腺癌來源的Exo?somes可引發(fā)轉移前位（niche）形成，從而促進胰腺癌細胞向肝臟轉移［9］；慢性淋巴細胞白血病細胞來源的Exosomes誘導間充質干細胞轉變成癌相關成纖維細胞，從而促進慢性淋巴細胞白血病細胞遷移［10］。然而肺癌來源的Exosomes是否可影響其分泌細胞及其同源腫瘤細胞的遷移尚不明確。本研究結果顯示，將A549細胞來源的Exosomes作用于其分泌細胞及同源腫瘤細胞后，遷移能力明顯增強，提示肺癌細胞來源的Exosomes可促進其分泌細胞及其同源腫瘤細胞的遷移。

既往研究［5，11?13］證實，PI3k/Akt信號通路和SRC的活化促進胃癌、腸癌及乳腺癌等多種實體腫瘤的轉移。近年的研究［14］顯示，肺癌細胞來源的Exo?somalintegrins α6β4 and α6β1可通過激活肺癌細胞的SRC，促進其轉移；肺腺癌細胞來源的Exosomes中的促腫瘤轉移分子轉移金屬蛋白酶組織抑制劑?1可通過PI3K/Akt的活化，促進肺癌A549細胞的進展及轉移［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，A549細胞分泌的Exosomes以劑量依賴性的方式激活Akt和SRC，促進A549細胞的遷移能力增強。這些結果提示，肺癌來源的Exosomes可能通過激活Akt和SRC信號通路促進其分泌細胞及同源肺癌細胞的轉移。

綜上所述，肺癌來源的Exosomes不僅能夠促進其分泌細胞的遷移，同時還可促進同源細胞的遷移，并伴隨Akt和SRC的活化，提示PI3K/Akt及SRC通路是Exosomes促進其分泌細胞的遷移機制之一。本研究為進一步明確肺癌細胞自我調控遷移的機制和尋找治療肺癌的靶分子提供重要的科學依據(jù)，具有潛在的臨床應用價值。

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（編輯 于溪）

Role of Akt and SRC Pathways in Exosome?mediated Migration of Homologous Lung Adenocarninoma Cells

XIE Shilin1，QU Jinglei2，F(xiàn)AN Yibo2，CHE Xiaofang2，HOU Kezuo2，QU Xiujuan2，LIU Yunpeng2，WANG Xiaonan1，KANG Jian3，HU Xuejun1
（1.Institute of Respiratory Disease，Department of Respiratory and Infectious Disease of Geriatrics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Medical Oncology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Institute of Respiratory Disease，Department of Respiratory Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Exosomes derived from lung cancer cells on the migration of secretory cells and homologous tu?mor cells and to explore the role of PI3K/Akt and SRC signaling pathways in this process.MethodsExosomes were isolated from the supernatant post density gradient centrifugation of A549，lung cancer cells.Morphology of the Exosomes was studied using transmission electron microscopy. Protein expression was analyzed using Western blotting.Cell migration was analyzed by a transwell assay.ResultsThe double?membrane?bound Exosomes appeared as discal?shaped structures，30?100 nm in diameter.Western blotting showed that CD9 was abundant in the Exosomes.The Exosomes promoted the migration of A549 cells and their homologous tumor cells，HCC827 in a dose?dependent manner，accompanied by the acti?vation of Akt and SRC.ConclusionThe Exosomes derived from A549（lung cancer）cells promote the migration of the secreting cells and the homologous tumor cells.The mechanism may be correlated with the activation of Akt and SRC.

Exosomes；migration；lung cancer；Akt；SRC

R734.2

A

0258-4646（2017）04-0294-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.04.002

國家自然科學基金（81372546，81472193）；遼寧省科學技術計劃（2014226033，2014225013，L2014296）；遼寧省教育廳重點實驗室基礎研究（LZ2014037）

解世林（1987-），女，助教，碩士.

胡雪君，E-mail：huxuejun2008@hotmail.com

2016-10-12

網絡出版時間：