王玉霞，尹旭敏，張超

（1.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓644000；2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓644000；3.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶九龍坡401329）

枸杞多糖熱浸提工藝研究

王玉霞1，2，尹旭敏3，張超1，2

（1.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓644000；2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓644000；3.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶九龍坡401329）

為了探索枸杞多糖安全有效提取工藝，本實驗分別運用單因素實驗和正交實驗對多糖的提取量進(jìn)行考察。料液比、提取溫度、提取時間和浸提液pH值都對多糖提取量影響很大。經(jīng)過單因素實驗，選取1∶10(w/v)、1∶15(w/v)、1∶20(w/v)料液比，50℃、60℃、70℃的提取溫度，提取時間分別采用1.5 h、2.0 h、2.5 h，浸提液pH值為7、8、9作為正交實驗的處理因素和水平。4因素3水平正交實驗對熱水浴法提取枸杞多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出對多糖提取量影響作用大小的因素順序為提取溫度＞pH值＞料液比＞提取時間。正交實驗方差分析結(jié)果顯示，各因素均對多糖提取量有顯著性影響(p＜0.05)，且當(dāng)料液比為1∶25時、提取溫度控制在60℃條件下、水浴浸提時間保持在2.0 h、pH值為8時，多糖提取量能達(dá)到0.4978 g±0.036 g，提取率為9.96%。

枸杞；多糖；熱浸提；工藝研究

枸杞(Lycium barbarum L.)為茄科落葉灌木植物枸杞的成熟果實，味甘、性平、有滋腎補髓、養(yǎng)肝明目和祛風(fēng)的作用，是傳統(tǒng)中藥滋補品，也是具有藥用價值的優(yōu)良食材[1]。李時珍在其藥學(xué)著作中指出，枸杞具有“補腎生精、養(yǎng)肝、明目、堅精骨、去疲勞、易顏色、變白、明目安神、令人長壽”的功效[2]。枸杞含有枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)、胡蘿卜素、VB族、VC和微量元素鈣、磷、鐵等多種活性成分[3]。其中，枸杞多糖是枸杞最重要的保健因子，許多學(xué)者的研究都已證實其在增加免疫[4-6]、抗腫瘤[7-8]、抗氧化[9-10]、抗衰老[11-12]、降血脂[13]、降血糖[14]、保護(hù)肝臟與生殖系統(tǒng)[15-16]、促進(jìn)發(fā)育、防治老年性白內(nèi)障[17]等方面具有的多種藥理作用和生理功能。

正是由于枸杞多糖具有的多種營養(yǎng)保健和藥用價值，枸杞多糖已經(jīng)成為眾多國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注和研究的焦點。多糖得率、純度和功效很大程度上取決于提取條件，因此其提取方法以及最優(yōu)工藝條件的研究就顯得尤為重要。枸杞多糖的提取方法很多，如超聲/微波提取法[18-19]、水提醇沉法[20]、堿液提取法[21]和酶解提取法[22]等。這些研究雖都取得了良好效果，但酶法提取需消耗大量的酶，提取成本較高；超聲和微波提取雖較酶法提取成本低，但需要特殊的設(shè)備，而堿液和醇沉等方法涉及到石油醚、乙醇、丙酮等多種有機試劑的使用，在安全無毒方面存在一定負(fù)面影響，影響了枸杞多糖在食品或藥用領(lǐng)域的使用范圍。

本實驗以熱水浴法對枸杞多糖的提取工藝參數(shù)進(jìn)行考察，分別對枸杞多糖提取的料液比、提取溫度、提取時間、浸提液pH值進(jìn)行探究，采用正交實驗進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)，確定了熱水浴法枸杞多糖提取的最佳工藝條件，以期為安全快捷的枸杞多糖提取研究打下基礎(chǔ)，并為研發(fā)新型青梅枸杞果酒、柑橘枸杞果露酒等新酒種做好前期材料準(zhǔn)備和實驗鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗材料：枸杞，購自超市（產(chǎn)地寧夏中衛(wèi)）。

試劑：氫氧化鈉、乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、丙酮、鹽酸（均為AR，成都科龍化工試劑廠）。

儀器：分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；精密pH計Delta 320-S（瑞士Mettler Toledo公司）；電熱恒溫水浴鍋HH-600（蘇州威爾實驗用品有限公司）；Spectra MaxM 2酶標(biāo)儀（Molecular Devices)）；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；TDL-50B臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料的預(yù)處理

稱取500 g的枸杞洗凈晾干，再放入烘箱中50℃烘至干透，冷卻后粉碎，密封備用。

1.2.2 枸杞多糖熱水浴法提取工藝

準(zhǔn)確稱取枸杞粉末5 g，加入溫水，攪拌后于水浴鍋內(nèi)保溫浸提，3000 r/m in離心20 m in，收集上清液。重復(fù)浸提2次，合并濾液，減壓蒸發(fā)濃縮，得到枸杞多糖提取濃縮液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與枸杞多糖測定

準(zhǔn)確稱取25mg無水葡萄糖，置于250m L容量瓶中，少量蒸餾水溶解后定容，搖勻即得0.1mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L于具塞試管中，分別補加蒸餾水至2.0m L，加入5%苯酚溶液1m L，搖勻后，迅速滴入濃硫酸5m L，充分混勻，放置10m in，于40℃水浴中保溫15min后，取出并迅速冷卻至室溫，以不加葡萄糖液為對照，以紫外-可見分光光度法在490 nm波長處測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）。實驗采用苯酚-硫酸法，將粗多糖提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行測定，結(jié)合葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線、公式1和提取液體積以及測定稀釋度，換算枸杞多糖提取糖量。

式中，c為糖濃度，mg/m L；v為提取液體積，m L；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 熱水浴提取枸杞多糖單因素實驗

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4.1 料液比對枸杞多糖提取效果的影響

稱取預(yù)處理后的枸杞粉末5 g，設(shè)置料液比(w/v)為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25共5個水平，自然pH值，于70℃下提取2次，每次2 h，合并浸提液減壓蒸發(fā)濃縮，測定多糖含量，實驗進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.4.2 提取時間對枸杞多糖提取效果的影響

稱取預(yù)處理后的枸杞粉末5 g，設(shè)置提取時間為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h 5個水平，自然pH值，采用料液比(w/v)為1∶15于70℃下提取2次，合并浸提液減壓蒸發(fā)濃縮，測定多糖含量，實驗進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.4.3 pH值對枸杞多糖提取效果的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理后的枸杞粉末5 g，設(shè)置浸提液pH值為7、8、9、10、11共5個水平，采用料液比(w/v)為1∶15于70℃下提取2次，每次2.0 h，合并浸提液減壓蒸發(fā)濃縮，測定多糖含量，實驗進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.4.4 提取溫度對枸杞多糖提取效果的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理后的枸杞粉末5 g，設(shè)置提取溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃5個水平，自然pH值，采用料液比(w/v)為1∶15提取2次，每次2.0 h，合并浸提液減壓蒸發(fā)濃縮，測定多糖含量，實驗進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.5 熱水浴提取枸杞多糖正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交表，以料液比、提取溫度、提取時間、pH值進(jìn)行正交實驗。正交實驗因素及水平見表1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel進(jìn)行處理分析。

表1 熱水浴法提取枸杞多糖工藝研究正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對枸杞多糖提取效果的影響

提取液與枸杞粉的比例，直接影響著提取液中多糖的濃度。料液比太高，提取液中多糖含量過濃，反而會影響提取效果；太低，則增加濃縮工作，會延長整個提取時間。在實驗條件下，枸杞多糖提取量與料液比的關(guān)系見圖2。

圖2 料液比對枸杞多糖提取量的影響

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取蒸餾水用量的逐漸增加，提取得到的枸杞多糖的量也在不斷增大。提取量最高的料液比是1∶15，提取量為0.44 g，提取率達(dá)到8.80%；其次是1∶20的料液比，為0.40 g枸杞多糖。而提取效果最差的是1∶5，為0.21 g枸杞多糖，只有最高提取量（料液比1∶15）的46.82%。隨著料液比的進(jìn)一步提高，枸杞多糖的提取量反而呈現(xiàn)出下降趨勢。

2.2 提取時間對枸杞多糖提取效果的影響

在一定的提取溫度、提取料液比條件下，提取時間對枸杞多糖的提取量也有很大影響。提取時間過短，枸杞多糖溶解不完全，過長，則延長了整個提取時間，而且在較高溫度保溫條件下，已經(jīng)溶解的多糖，也會與提取體系中的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或形成溶解性較低的大分子類物質(zhì)而被離心除去，反而降低提取量。實驗設(shè)定了一系列提取時間梯度，以探究提取時間對枸杞多糖提取效果的影響。在提取時間為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，在自然pH值、浸提溫度70℃條件下保溫浸提2.0 h，重復(fù)提取2次，合并提取液并減壓蒸發(fā)濃縮，提取得到的多糖量見圖3。

圖3 浸提時間對枸杞多糖提取效果的影響

由圖3可知，提取得到的枸杞多糖量最高的是提取時間為1.5 h的處理，提取量為0.41 g，提取率達(dá)到8.29%；其次是2.0 h，提取的枸杞多糖量為0.34 g，再次是2.5 h，為0.30 g枸杞多糖。而提取效果最差的是1.0 h，只有0.27 g枸杞多糖，比最大提取量的1.5 h減少了0.14 g。實驗結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著提取時間的逐漸增加，提取得到的枸杞多糖的量也在不斷增加；隨著提取時間的進(jìn)一步延長，枸杞多糖的提取量反而呈現(xiàn)出一定程度的下降趨勢。

2.3 pH值對枸杞多糖提取效果的影響

實驗分別在料液比為1∶15(w/v)、浸提溫度70℃、保溫浸提2.0 h條件下，考察提取液pH值對枸杞多糖提取量的影響。設(shè)定的pH值梯度為7、8、9、10、11，在此條件下枸杞多糖的提取結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著浸提液pH值的逐漸增大，提取得到的枸杞多糖的量也在不斷增加，但隨著提取液pH值的進(jìn)一步增大，枸杞多糖的提取量反而呈現(xiàn)下降趨勢。提取得到的枸杞多糖量最高是pH值為8的條件，提取量為0.47 g，提取率為9.32%，其次是在pH7的條件下，多糖量為0.38 g。而提取效果最差的是最大pH條件（pH11），為0.26 g枸杞多糖，只有pH7條件下的54.74%。從實驗結(jié)果可以得出，提取得到的枸杞多糖中，中性糖比例較大，其次是微偏酸性的多糖，這與Chao等[23]的研究結(jié)果相似。

圖4 浸提pH值對枸杞多糖提取效果的影響

2.4 提取溫度對枸杞多糖提取效果的影響

提取溫度對枸杞多糖提取效果的影響見圖5。

圖5 提取溫度對枸杞多糖提取效果的影響

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取溫度的逐漸升高，提取得到的枸杞多糖的量也在不斷增加，但隨著提取溫度的進(jìn)一步升高，枸杞多糖的提取量反而呈現(xiàn)出一定程度的下降。在設(shè)定的5個提取溫度條件下，提取溫度為60℃時，枸杞多糖的提取量最大，達(dá)到了0.37 g，其次是70℃（0.35 g）和50℃（0.34 g）。而提取效果最差的是80℃，提取量只有0.26 g，為60℃提取條件下的69.98%。

2.5 正交實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以料液比、提取溫度、提取時間、提取液pH值為探究因素，以枸杞多糖量為考察指標(biāo)，選取L9(34)正交表進(jìn)行枸杞多糖熱水浴提取的正交實驗，并進(jìn)行極差和方差分析，以確定枸杞多糖的最佳提取工藝參數(shù)條件，結(jié)果見表2。

由表2可知，經(jīng)過4因素3水平的正交實驗，枸杞多糖的提取量在(0.2081±0.015)～(0.4842±0.011)g之間。極差R值最大的是B因素（溫度），為0.1135，其次為D因素（pH條件）0.1114，最小的是C因素（提取時間），為0.0341。因此，根據(jù)極差R值，判定4個因素對枸杞多糖提取量的影響大小順序為B＞D＞A＞C，即各因素對枸杞多糖提取效果影響的顯著性順序為：提取溫度＞pH值＞料液比＞提取時間。另外，對各個因素的k值進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：因素A（料液比）中k3值最大，為0.3458，最小為k2，其值為0.2690，所以k3＞k1＞k2，故因素A的最優(yōu)水平是A3（1∶20的料液比）；同理分析得到其他各因素的最佳水平為：B2（k2=0.3774），C2（k2=0.3162），D3（k3=0.3595）。故熱水浴法提取枸杞多糖的最佳工藝組合為A3B2C2D3，即料液比為1∶20，提取溫度為60℃，提取時間為2 h，pH值為8。

表2 熱水浴法提取枸杞多糖正交實驗

表3 正交實驗方差分析

由表3可知，用于實驗的各個單因素，對枸杞多糖的提取量影響達(dá)到了顯著水平(p＜0.05)，其中B和C二因素還達(dá)到了極顯著水平(p＜0.01)。按最佳組合進(jìn)行驗證實驗，得到枸杞多糖為0.4978 g± 0.036 g，提取率為9.96%，與正交實驗結(jié)果相差不大，證實了模型的有效性和正確性。

3 結(jié)論

實驗分別運用單因素實驗對枸杞多糖提取的料液比、提取溫度、提取時間、提取液pH值4個因素進(jìn)行考察后，得出當(dāng)料液比為1∶10(w/v)、1∶15(w/v)、1∶20(w/v)時，提取的多糖的量較高，提取溫度在50℃、60℃、70℃時，提取量高于其他溫度，而提取時間為1.5、2.0、2.5 h，浸提液pH值為7、8、9時的提取效果好于其他時間和pH值條件。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進(jìn)行正交實驗以優(yōu)化熱水浴法提取枸杞多糖最佳工藝條件。得出各因素對枸杞多糖提取效果影響的主次因素順序為：提取溫度＞pH值＞料液比＞提取時間，且枸杞多糖的最佳工藝為料液比1:20時、提取溫度控制在60℃條件下、水浴浸提時間保持在2.0 h、pH值為8時，多糖提取量最大，達(dá)到0.4842 g±0.011 g。正交實驗方差分析顯示，4個因素對枸杞多糖提取量影響顯著，驗證實驗所得的0.4978 g±0.036 g提取量與最優(yōu)組合條件下的結(jié)果相符，驗證了優(yōu)化的有效性和正確性。

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Extraction of Lycium barbarum Polysaccharideby Hot-Water Bath

WANGYuxia1,2,YIN Xum in3and ZHANG Chao1,2
（1.Sichuan Key Lab of Solid-state Fermentation Resources Utilization,Yibin,Sichuan 644000;2.College of Life Science and Food Engineering,Yibin University,Yibin,Sichuan 644000;3.Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Jiulongpo,Chongqing 401329,China)

The safe and effective extraction of Lycium barbarum polysaccharide was explored.The factors influencing the extraction such as the ratio of raw material to solution,extraction temperature,extraction time,and pH value of extract fluid were investigated by single factor test and orthogonal experiments respectively.Based on the results of single factor test,the follow ing influencing factors of different levels were selected:the ratio of raw material to solution(1∶15,1∶20,and 1∶25(w/v)),extraction temperature (50℃,60℃,and 70℃),extraction time(1.5 h,2.0 h,and 2.5 h)and pH value of extract fluid(6,7,and 8).The results of L934 orthogonal experiment demonstrated that the influence of the four factors on polysaccharide yield ranked in decreasing sequence as extraction temperature＞pH value＞the ratio＞extraction time.The analysis of the variance for orthogonal experiments exhibited that all factors had significanteffects on the extraction of polysaccharide(p＞0.05).As the ratio of raw material to solution was 1:25,extraction temperaturewas at60℃,extraction time was 2 h,and pH value of extract liquid was 8,the yield of polysaccharide reached up to 0.4978±0.036 g and the extraction ratio was 9.96%.

Lycium barbarum;polysaccharide;hot-water extraction;technical study

TS255.36；TS261.23

A

1001-9286（2017）04-0036-06

10.13746/j.njkj.2017016

四川省教育廳重點項目《發(fā)酵型青梅保健新酒種研發(fā)》(13ZA0197)，《特色桑葉顆粒茶工藝關(guān)鍵技術(shù)研究》（14ZA0273）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目《白酒大曲宏蛋白組研究》（2015JY0185），《再造粒桑葉顆粒茶加工技術(shù)研究》（2016JY0159）；固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室應(yīng)用基礎(chǔ)項目《基于宏蛋白組學(xué)的大曲主要功能酶系研究》（2015GTY001）；宜賓市重點科技項目《柑橘全果深加工技術(shù)體系研究》(2014SF030)，《特色桑葉顆粒茶加工技術(shù)開發(fā)研究》(2013NY004)；宜賓學(xué)院重點科研項目《獼猴桃果酒貯存過程中Vc變化規(guī)律研究》（2013QD15）；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目《青梅加香果酒釀造技術(shù)研究》（201510641042）。

2017-01-24

王玉霞(1974-)，女，副教授，博士，研究方向為生物工程，E-mail：wangyx0411@163.com。

張超(1972-)，男，副教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工，E-mail：zhangch8619@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-03-22；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170322.1127.001.htm。