王芙蓉，曾輝，許曌昕，席德州，王歡，曹文濤

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州盛世甲秀酒業(yè)有限公司，貴州貴陽(yáng)550025）

1株醬香型大曲中高溫放線菌的分離和鑒定

王芙蓉1，曾輝2，許曌昕1，席德州1，王歡1，曹文濤1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州盛世甲秀酒業(yè)有限公司，貴州貴陽(yáng)550025）

利用GTY培養(yǎng)基自醬香型高溫大曲中分離得到1株放線菌F6，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化代謝特征鑒定，并結(jié)合16S rRNA基因序列分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果表明，鑒定F6為高溫放線菌（Thermoactinomycessp）中的普通高溫放線菌（Thermoactinomycesvulgaris）。

醬香型白酒；高溫大曲；高溫放線菌；分離鑒定

醬香型白酒是以高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，并通過(guò)高溫堆積后入窖進(jìn)行多菌種復(fù)合固態(tài)純糧發(fā)酵而得，期間涉及了多種微生物的參與，這些微生物在白酒釀造階段的含量及發(fā)酵產(chǎn)物不同對(duì)醬香型白酒的風(fēng)味都有很大的影響。白酒香味物質(zhì)的形成更是與高溫大曲中的有益微生物有著緊密的關(guān)系。從微生物角度來(lái)說(shuō)，高溫制曲過(guò)程中淘汰了大量耐熱性差的微生物，因此高溫培養(yǎng)的過(guò)程實(shí)際上相當(dāng)于一個(gè)富集嗜熱菌的過(guò)程。放線菌是白酒釀造過(guò)程中眾多微生物的一種，近年來(lái)對(duì)它與產(chǎn)香的關(guān)系有了較為深入的研究[1-5]。本實(shí)驗(yàn)主要是以醬香型高溫大曲為原料，分離出高溫大曲中的嗜熱放線菌，在前人研究的基礎(chǔ)上對(duì)分離到的放線菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)和基因測(cè)序，為進(jìn)一步探索該菌與醬香型白酒特殊風(fēng)味的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠生產(chǎn)的醬香型高溫大曲。

菌株：F6分離自茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠生產(chǎn)的醬香型高溫大曲。

培養(yǎng)基：GTY培養(yǎng)基、ISP2培養(yǎng)基等。

試劑及耗材：TaqDNA聚合酶購(gòu)自天為時(shí)代生物有限公司；Gold View購(gòu)自北京塞百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶購(gòu)自Sigma公司，蛋白酶K購(gòu)自Merk公司，制霉菌素，新制霉素。

主要儀器：超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、高速冷凍離心機(jī)、培養(yǎng)箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 放線菌的分離篩選

1.2.1.1 樣品的預(yù)處理

稱取25 g醬香型高溫大曲、5 g CaCO3于500m L的三角瓶中，加入5m L無(wú)菌水使其保持濕潤(rùn)，在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，在100℃的烘箱中熱處理1 h，加入225m L的無(wú)菌水，在200 r/m in的搖床上振蕩30m in后，在55℃的水浴中保持1 h。

1.2.1.2 抑制劑的選擇

將GTY培養(yǎng)基滅菌后冷卻到50℃，以無(wú)菌過(guò)濾的方法加入30mg/m L的新制霉素和20mg/m L的制霉菌素。

1.2.1.3 培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品涂布到GTY培養(yǎng)基上，在55℃下培養(yǎng)48 h[6]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察

將F6菌株接種到ISP2培養(yǎng)基中，采用插片法培養(yǎng)3 d后，再觀察是否形成基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲。并在顯微鏡下觀察菌株的氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、孢子絲等生長(zhǎng)情況[7]。

1.2.3 溫度敏感性測(cè)定

將檢測(cè)菌接種在ISP2培養(yǎng)基上，分別置于45℃、50℃、55℃、60℃4個(gè)溫度梯度下培養(yǎng)48 h后，觀察其生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 生理生化特性

生理生化特性鑒定選取明膠液化、淀粉水解、牛奶的凝固與胨化、硝酸鹽還原等項(xiàng)目進(jìn)行。

1.2.4.1 明膠液化[8]

將菌種接種于明膠培養(yǎng)基中，以55℃培養(yǎng)，分別在3 d、5 d、10 d、20 d和30 d觀察培養(yǎng)基液化程度。在觀察前先將菌種管放入冰箱30m in，如明膠凝成固體狀態(tài)，說(shuō)明不液化，如試管有液體出現(xiàn)，說(shuō)明明膠已被液化。

1.2.4.2 淀粉水解[8]

將菌種接種在淀粉瓊脂面板上，以55℃培養(yǎng)10 d后，在菌落周圍滴加碘液，如菌落周圍呈現(xiàn)透明圈時(shí)，表示菌種產(chǎn)生淀粉酶。若菌落周圍染成藍(lán)色，不出現(xiàn)透明圈者，說(shuō)明該菌株不產(chǎn)生淀粉酶。

1.2.4.3 牛奶的凝固與胨化[8]

將菌種接種在脫脂牛奶管中，以55℃培養(yǎng)，分別在第3天、第6天、第10天、第20天、第30天各觀察1次，如果牛奶形成凝塊，為凝固現(xiàn)象。再繼續(xù)培養(yǎng)，如凝塊分解，則為胨化現(xiàn)象。

1.2.4.4 硝酸鹽還原

將菌種接種在硝酸鹽還原培養(yǎng)液中，55℃培養(yǎng)7 d和14 d，分別測(cè)定硝酸鹽還原的情況。測(cè)定時(shí)，倒出培養(yǎng)液1m L于干凈試管中，分別加入硝酸鹽還原試劑甲液和乙液各2滴，如呈紅色反應(yīng)，即為陽(yáng)性。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析

1.2.5.1 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工）提取菌株基因組DNA，并以基因組DNA為模板，利用通用引物對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化后的PCR產(chǎn)物送往上海生工進(jìn)行基因測(cè)序。

1.2.5.2 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

登陸NCBI（www.ncbi.nlm.gov/blast/）網(wǎng)站，進(jìn)行同源性分析，并采用MEGA 5.2將測(cè)得序列與GenBank中的模式菌株16S rRNA序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，獲得目的菌的分類地位或它的系統(tǒng)發(fā)育地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

放線菌菌株F6在ISP2培養(yǎng)基上55℃插片培養(yǎng)3 d，菌株的形態(tài)觀察結(jié)果描述見(jiàn)表1，菌落特征和顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 放線菌F6的培養(yǎng)特征

2.2 溫度敏感性測(cè)定

菌株F6在60℃條件下不生長(zhǎng)，在45～55℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且最適生長(zhǎng)溫度為55℃，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 生理生化特征鑒定

菌株F6能夠使牛奶凝固，且胨化；能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 放線菌的特征

表2 放線菌菌株溫度敏感性特征

表3 菌株F6生理生化結(jié)果

圖2 菌株F6的測(cè)序結(jié)果

2.4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)菌株F6進(jìn)行了16S rRNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3?？纱_定F6為普通高溫放線菌（Thermoactinomycesvulgaris）。

3 討論及結(jié)論

圖3 菌株F6的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》第9版中所描述的放線菌目，能產(chǎn)生單孢子的放線菌歸為4個(gè)屬，即高溫放線菌屬、高溫單孢菌屬、糖單孢菌屬和小單孢菌屬[9]。高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）于1899年由Tsilinsky[10]首次描述。它是20世紀(jì)前人類所發(fā)現(xiàn)的為數(shù)不多的幾個(gè)放線菌屬之一。該屬的特征是在高溫環(huán)境下生長(zhǎng)快，在氣絲和基絲上均有單個(gè)孢子形成，存在內(nèi)生孢子，常見(jiàn)于自然界的高溫場(chǎng)所，如堆肥、稻草、蔗渣等。高溫放線菌屬因其能夠形成良好的菌絲體而被歸入放線菌目中，但最近有不少學(xué)者對(duì)該屬分類地位提出質(zhì)疑，這不僅是因?yàn)槠浠?6S rDNA序列分析證明該屬的系統(tǒng)進(jìn)化更接近于芽孢桿菌屬，它們還產(chǎn)生具有類似芽孢桿菌屬的內(nèi)生孢子，而且它們的G+Cmol%僅為50%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他放線菌屬的65%～75%。根據(jù)分子分類研究結(jié)果，有學(xué)者將該屬并入枯草桿菌菌群。但根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，高溫放線菌屬明顯應(yīng)歸為放線菌類群?，F(xiàn)今，國(guó)內(nèi)外許多有關(guān)學(xué)者均暫時(shí)將其定位在放線菌類群中的未定單元里[11]。高溫放線菌屬?gòu)钠浣⒅两褚延?00多年的歷史，其存在數(shù)量多，分布非常廣泛，但到目前為止，僅有為數(shù)不多的幾個(gè)種被發(fā)現(xiàn)并生效描述，這說(shuō)明發(fā)現(xiàn)新的高溫放線菌的潛力還是非常大的。本研究利用細(xì)菌通用引物對(duì)F6菌16S rRNA基因序列擴(kuò)增和序列測(cè)定，并通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析比較和利用MEGA5進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，F(xiàn)6被鑒定為高溫放線菌（Thermoactinomyces sp.）。以基因系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)，結(jié)合生理生化試驗(yàn)、形態(tài)及培養(yǎng)特征結(jié)果，并參考Yoon等[12]的相關(guān)報(bào)道，最終確定放線菌F6為普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）。該菌從醬香型白酒高溫大曲中被發(fā)現(xiàn)并分離得到，本研究尚屬首次。由于高溫放線菌生長(zhǎng)發(fā)育較快，分泌產(chǎn)生的代謝物種類和性質(zhì)可能會(huì)具有其特殊性，由此可以推測(cè)該菌作為優(yōu)勢(shì)菌種在醬香型白酒特殊性風(fēng)味的形成過(guò)程中具有不可忽視的作用。對(duì)其進(jìn)行全面、準(zhǔn)確的多相分類學(xué)鑒定是研究其在白酒釀造過(guò)程中所發(fā)揮功能的必要前提。

本研究針對(duì)自醬香型白酒高溫大曲中分離得到的嗜熱放線菌F6進(jìn)行多相分類學(xué)鑒定，并最終將F6鑒定為普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）。該菌株具有特殊的生理生化特征及酶學(xué)活性，且是首次從我國(guó)醬香型白酒高溫大曲中分離并鑒定得到的高溫放線菌，具有重要的理論研究與實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

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Isolation&Identification of a Thermoactinomyces sp.Strain from High-tem perature Jiangxiang Daqu

WANG Furong1,ZENG Hui2,XU Zhaoxin1,XIDezhou1,WANGHuan1and CAOWentao1
(1.Schoolof Liquor-making&Food Engineering,Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025; 2.Shengshi Jiaxiu Distillery Co.Ltd.,Guiyang,Guizhou 550025,China)

An actinomycetes strain F6 was isolated from high-temperature Jiangxiang Daqu by use of GTY culturemediums.Itsmorphology,physiological features,biological features,andmetabolic featureswere studied.Combined w ith 16S rRNA gene sequencemolecularbiology identification and phylogenetic analysis,strain F6was identified as Thermoactinomycesvulgaris.

Jiangxiang Baijiu;high-temperature Daqu;Thermoactinomyces sp.;isolation&identification

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）04-0042-04

10.13746/j.njkj.2017004

2017-01-09

王芙蓉（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：釀酒微生物，E-mail：790251343@qq.com。

曹文濤（1967-），男，貴州人，研究生導(dǎo)師，主要從事白酒微生物的研究及其應(yīng)用，E-mail：cw tgz@163.com。