薛妮娜，董 凱，來芳芳，黃 蕊，陳曉光*

(1. 中國醫(yī)學科學院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室/創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及PK/PD研究北京市重點實驗室，北京 100050；2. 天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津 301700)

CFSE法檢測刺激劑對淋巴細胞增殖與活化

薛妮娜1#，董 凱2#，來芳芳1，黃 蕊1，陳曉光1*

(1. 中國醫(yī)學科學院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室/創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及PK/PD研究北京市重點實驗室，北京 100050；2. 天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津 301700)

研究不同刺激劑對人外周血淋巴細胞增殖與活化的影響.采用密度離心法分離人外周血淋巴細胞，并采用1μmol/L 的CFSE進行標記，通過流式細胞術(shù)技術(shù)檢測刺激劑抗CD3/28抗體、植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)培養(yǎng)72 h對淋巴細胞分裂與增殖的影響.并采用ELISA法檢測不同刺激劑對淋巴細胞上清IFNγ質(zhì)量濃度的影響.0.125 μg/mL的抗CD3/28抗體和5或10 μg/mL的PHA可以顯著誘導CFSE綠色熒光逐漸遞，形成類似“五指峰”樣圖譜，說明這兩者具有很強的誘導淋巴細胞分裂與增殖的作用.相比之下，單用PMA促進淋巴細胞分裂與增殖的作用較弱.此外，抗CD3/28抗體、PHA和PMA均可增加淋巴細胞IFNγ的分泌，但其作用強度如下：抗CD3/28抗體>PHA>PMA.采用CFSE標記法檢測淋巴細胞增殖的實驗，得出抗CD3/28抗體和PHA是高效的淋巴細胞活化刺激劑，而且最佳質(zhì)量濃度分別為0.125 μg/mL和10 μg/mL.

淋巴細胞增殖；CFSE；干擾素γ；流式細胞術(shù)

腫瘤免疫治療己成為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種常用的腫瘤治療方法.腫瘤免疫治療是通過激發(fā)或調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫能力，從而控制和殺滅腫瘤細胞.而效應(yīng)T淋巴細胞是誘發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要執(zhí)行者，行使對腫瘤細胞的識別和消滅作用[1].在腫瘤進展過程中，腫瘤細胞通過上調(diào)一些免疫檢查點分子的配體，與T淋巴細胞表面這些共抑制性受體(PD1、CTLA4、LAG3等)相互作用，從而抑制T細胞的增殖與活化，形成腫瘤免疫逃逸微環(huán)境[2-3].目前，絕大多數(shù)上市或處于臨床研究階段的抗腫瘤免疫藥物都是通過抑制T細胞的負性調(diào)控信號，通過激活T淋巴細胞的增殖和活性，強化T細胞的免疫應(yīng)答，最終達到抵御腫瘤細胞增長的目的.因此，T淋巴細胞的增殖與活性水平的檢測是細胞免疫功能研究的常用方法，也是目前抗腫瘤免疫藥物研發(fā)中一個重要的考察指標[4].

氚標記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法被廣泛用于淋巴細胞增殖的檢測.但是其需要使用放射性同位素標記，具有潛在的污染，并且不容易大批量操作.其次，還有一些研究者采用MTT或MTS的方法檢測淋巴細胞增殖.雖然MTT或MTS的操作方法相對簡單，但靈敏性不高，且此方法不適合檢測一些具有氧化還原性作用的藥物，這類藥物可直接與MTT反應(yīng)，造成假陽性.此外，3H-TdR摻入法和MTT/MTS法均是以細胞的數(shù)量來反應(yīng)增殖的變化，不能反應(yīng)細胞的分裂情況，且無法測定不同亞群淋巴細胞的增殖情況[5-6].羧基熒光素乙酰乙酸(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester, CFSE)染色是一種有效的檢測淋巴細胞分裂與增殖的方法.CFSE可穿過細胞膜，不可逆地與細胞內(nèi)的氨基共價結(jié)合偶聯(lián)到細胞內(nèi)蛋白.在細胞分裂增殖過程中，CFSE標記的熒光可平均分配到兩個子代細胞中，出現(xiàn)連續(xù)的熒光強度遞減現(xiàn)象，在流式細胞術(shù)檢測過程中出現(xiàn)類似“五指峰”的特征[7-8].

抗CD3/28抗體、刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)佛波酯(PMA)可刺激小鼠脾或人外周血T淋巴細胞增殖.目前，文獻中尚未對這些刺激劑促進T淋巴細胞增殖的強度進行比較.而且報道的這些刺激劑的最佳有效劑量也不盡相同.因此，本文采用CFSE標記法檢測不同刺激劑誘導人外周血淋巴細胞分裂與增殖的活性，為驗證腫瘤免疫藥物的活性提供有效的評價方法.

1 實驗材料

1.1 全血

健康志愿者的抗凝血購自中國食品藥品檢定研究院.

1.2 主要試劑

人外周血淋巴細胞提取分離液購自達科為生物技術(shù)有限公司.CFSE、PMA、和PHA購自Sigma公司，人源抗CD3、CD28抗體購自美國Miltenyi?Biotec公司.人源IFN γ 的ELISA檢測試劑盒購自cloud-clone公司.RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國GIBCO公司.

1.3 主要儀器

FACSVerse流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，Synergy H1多功能酶標儀為美國Bio-Tek公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品，冷凍離心機為美國Sigma公司產(chǎn)品.

2 實驗方法

2.1 淋巴細胞的制備

將健康志愿者的抗凝血與PBS混合，再緩慢加至淋巴細胞分離液中(這三者的終體積比例為1∶1∶1)，室溫，800 r/min離心30 min.小心吸取中間的一層薄而致密的白膜(淋巴細胞層)至另一層離心管中，用PBS重懸洗滌2次，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL.

2.2 CFSE標記淋巴細胞

在上述淋巴細胞懸液中加入CFSE染液(CFSE，終濃度為1 μmol/L)，37 ℃避光孵育10 min，每5 min混勻細胞.加入預(yù)冷的2 mL滅活牛血清冰上終止2 min，1 500 r/min離心5 min，用預(yù)冷的含10%滅活胎牛血清的PBS洗滌2次.離心，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，將細胞調(diào)整為3×106/mL，加入96孔圓底板，每孔100 μL，洗滌及離心過程中注意避光.

2.3 流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞增殖活性

向上述接種至96孔圓底板的淋巴細胞中分別加入100 μL含不同劑量的刺激劑的RPMI1640完全培養(yǎng)基：抗CD3/28抗體(終質(zhì)量濃度：0.125、0.5、1、1.5 μg/mL)、PHA(終質(zhì)量濃度：1、5、10 μg/mL)和PMA(終質(zhì)量濃度：1、5、10 ng/mL).每組實驗做三個平行孔，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育72h.離心，收集細胞上清，凍于-80 ℃冰箱保存.將細胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，并用200 μL PBS重懸，采用流式細胞檢測儀(BD FACS Verse)檢測淋巴細胞的分裂和增殖情況，并采用Flowjo 7.6軟件計算淋巴細胞增殖情況(CFSE熒光強度減低的細胞百分比)和分裂指數(shù)(CFSE熒光強度減低的細胞百分比與CFSE熒光強度不變的細胞百分比的比值).

2.4 ELISA法檢測淋巴細胞上清IFNγ質(zhì)量濃度

取上述條件下淋巴細胞上清液，采用ELISA法檢測IFNγ的質(zhì)量濃度.操作步驟參照試劑盒說明書.簡要步驟如下：1)加入100 μL倍比稀釋的人源IFNγ標準品及淋巴細胞上清原液，室溫靜置1 h；2)充分棄上清，分別加入1∶100稀釋的IFNγ的一抗，室溫靜置1 h；3)棄上清，洗滌三次后，加入1∶100稀釋后的IFNγ的二抗，室溫靜置30 min；4)棄上清，洗滌5次后，加90 μL底物(TMB)顯色，室溫避光放置15 min；5)加50 μL的硫酸終止反應(yīng)；6)酶標儀450 nmol/L下檢測淋巴細胞培養(yǎng)上清液中IFNγ的含量.

2.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P≤0.05具有統(tǒng)計學意義.

3 實驗結(jié)果

3.1 CFSE法淋巴細胞增殖實驗中細胞門的確定

采用Flowjo 7.6軟件對淋巴細胞分裂與增殖進行分析.根據(jù)前向散射角(FSC)和側(cè)向角散射(SSC)顯示圖，發(fā)現(xiàn)排除了細胞碎片群外，在正常條件下，淋巴細胞主要分布為左下群，均一度較好的一簇細胞群.在接受不同刺激劑活化后，左下的淋巴細胞群開始往右上方移動，且出現(xiàn)比較散在的細胞群.根據(jù)流式細胞術(shù)的原理，我們認為在刺激劑活化淋巴細胞后，淋巴細胞出現(xiàn)不同程度的分裂和增殖，其細胞大小和均一度都發(fā)生改變，從而顯示在右上方散在的細胞群.我們把原始淋巴細胞命名為R1門，刺激劑活化后的淋巴細胞命名為R2門(如圖1(A)～(B)所示).且在正常條件下，R1門的細胞具有強的CFSE染色熒光(單峰)；在刺激劑作用下，R2門內(nèi)增殖的淋巴細胞出現(xiàn)逐漸遞減的CFSE染色熒光(多峰)(如圖1(C)～(D)所示).

圖1 淋巴細胞增殖實驗中門的設(shè)立示意圖

3.2 抗CD3/28抗體對淋巴細胞分裂與增殖活性的影響

抗CD3和CD28抗體分別在體外模擬特異性T淋巴細胞活化的第一信號和第二信號，是T淋巴細胞活化常用的刺激劑.我們采用CFSE染色，通過流式細胞術(shù)檢測抗CD3和CD28抗體對淋巴細胞增殖的影響.如圖2(A)～(B)所示，抗CD3/28抗體可以強效地誘導綠色熒光強度逐漸遞減，形成類似“五指峰”樣圖譜，說明抗CD3/28抗體可以顯著促進淋巴細胞分裂和增殖.且在0.125～1.5 μg/mL劑量范圍內(nèi)，抗CD3/28抗體誘導的“五指峰”圖幾乎重疊.對其增殖指數(shù)和分裂指數(shù)進行統(tǒng)計，如圖2(C)～(D)所示，0.125～1.5 μg/mL 的抗CD3/28抗體誘導淋巴細胞增殖百分比基本可達到75%(P≤0.001)，其誘導淋巴細胞分裂指數(shù)可達3倍(P≤0.001).但隨著抗CD3/28抗體質(zhì)量濃度的增加，1.5 μg/mL的抗CD3/28抗體誘導淋巴細胞分裂指數(shù)反而有所下降.因此，在誘導淋巴細胞增殖實驗中，選用終質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL的抗CD3/28抗體即可.

圖2 不同質(zhì)量濃度抗CD3/28抗體對淋巴細胞增殖的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度PHA對淋巴細胞增殖的影響

3.3 PHA對淋巴細胞分裂與增殖活性的影響

PHA是一種有絲分裂原，主要用于激活淋巴細胞.對PHA的不同質(zhì)量濃度進行分析表明，PHA可以劑量依賴性地促進淋巴細胞分裂與增殖.1 μg/mL的PHA促進淋巴細胞增殖和分裂指數(shù)分別為40.9%和0.69倍.當質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時，PHA促進淋巴細胞增殖的效果最為明顯，淋巴細胞增殖和分裂指數(shù)為85.7%和4.7倍(如圖3所示).

3.4 PMA對淋巴細胞分裂與增殖活性的影響

PMA是PKC信號的激活物，PKC信號在T淋巴細胞活化中占據(jù)重要地位.所以PMA也是T淋巴細胞活化常用刺激劑之一.對PMA的不同質(zhì)量濃度進行分析表明，雖然PHA也可劑量依賴性地促進淋巴細胞分裂與增殖，但其誘導淋巴細胞增殖能力較弱，5 ng/mL和10 ng/mL的PMA誘導淋巴細胞增殖指數(shù)才到達20%，此劑量下的分裂指數(shù)才達到0.2倍(如圖4所示).

圖4 不同質(zhì)量濃度PMA對淋巴細胞增殖的影響

3.5 不同刺激劑對淋巴細胞IFNγ分泌的影響

收集不同刺激劑培養(yǎng)淋巴細胞72h后的上清液，采用ELISA法檢測IFNγ的質(zhì)量濃度.如圖5所示，0.125 μg/mL抗CD3/28抗體、10 μg/mL PHA和10 ng/mL PMA均可顯著增加淋巴細胞IFNγ的分泌(P≤0.001).但其增加淋巴細胞IFNγ分泌量的順序是抗CD3/28抗體>PHA>PMA.

圖5 不同刺激劑對淋巴細胞IFNγ分泌的影響

4 討 論

淋巴細胞增殖實驗是評價機體免疫功能的常用方法.CFSE染色法是近年來廣泛代替3H-TdR摻入法和MTT顯色法的一種快速、無污染的檢測淋巴細胞增殖的方法.CFSE染色結(jié)合流式細胞術(shù)技術(shù)能在不同淋巴細胞亞群及單個細胞水平上動態(tài)的分析淋巴細胞增殖情況[9-11].

小分子藥物單獨作用在體外幾乎不刺激淋巴細胞增殖，需要在淋巴細胞活化的基礎(chǔ)上，進一步評價小分子藥物調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖的作用.因此，采用CFSE法，尋找不同刺激劑活化淋巴細胞的最佳劑量，是評價調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖的小分子藥物的必要前提.本實驗采用人外周血提取獲得淋巴細胞，在不同劑量的抗CD3/28抗體、PHA和PMA作用下，觀察淋巴細胞的增殖和分裂指數(shù).實驗中發(fā)現(xiàn)，比以往報道用量更低的抗CD3/28抗體(0.12 5μg/mL)即可高效的刺激T淋巴細胞的分裂與增殖[12].5 μg/mL的PHA促進淋巴細胞增殖和分裂指數(shù)分別為75%和3倍，這與Fulcher D等研究者的報道一致[7].由于PHA可以劑量依賴性地增加淋巴細胞增殖與分裂，可根據(jù)需要活化的淋巴細胞的強弱選擇合適的PHA的劑量，同時，PHA又便宜.因此，PHA可用于調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖的化合物的大量篩選.相比之下，PKC信號的激動劑PMA促進淋巴細胞增殖的能力較弱.可能是因為T淋巴細胞的活化需要PKC信號和Ca2+信號共同參與，因此單一的PMA對淋巴細胞的活化作用較弱，需要與離子霉素聯(lián)用(Ca2+激動劑)可能對顯示出更強的促進淋巴細胞增殖的活性.這與Castagna M等人的研究相一致[13].IFNγ是T淋巴細胞活化的重要指標[14-15].實驗發(fā)現(xiàn)抗CD3/28抗體、PHA和PMA都能顯著增加淋巴細胞IFNγ的分泌，也證明了這三類刺激劑對T淋巴細胞的活化作用.并且這三種刺激劑增加IFNγ的分泌的程度與其誘導淋巴細胞分裂與增殖的程度相對應(yīng).后續(xù)將進一步研究這些刺激劑對不同亞群T淋巴細胞的促增殖作用.

[1] LANITIS E, POUSSIN M, KLATTENHOFF A W,etal. Chimeric antigen receptor T Cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced potential for toxicity in vivo [J]. Cancer immunology research, 2013, 1(1): 43-53.

[2] YAO S, ZHU Y, CHEN L. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation [J]. Nature reviews Drug discovery, 2013, 12(2): 130-146.

[3] NIRSCHL C J, DRAKE C G. Molecular pathways: coexpression of immune checkpoint molecules: signaling pathways and implications for cancer immunotherapy [J]. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2013, 19(18): 4917-4924.

[4] BOCHAROV G, LUZYANINA T, CUPOVIC J,etal. Asymmetry of Cell Division in CFSE-Based Lymphocyte Proliferation Analysis [J]. Front Immunol, 2013, 4(264): 1-7.

[5] 王 玲, 王 宏, 劉越堅, 等. 利用CFSE標記檢測CD8+淋巴細胞增殖[J]. 大連醫(yī)科大學學報, 2004, 26(4): 262-264.

[6] 季宇彬, 馮小燕, 高世勇, 等. 甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用[J].哈爾濱商業(yè)大學學報:自然科學版, 2008, 24(4): 385-388.

[7] FULCHER D, WONG S. Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory[J]. Immunol Cell Biol, 1999, 77(6): 559-564.

[8] POPMA S H, KRASINSKAS A M, MCLEAN A D,etal. Immune monitoring in xenotransplantation: the multiparameter flow cytometric mixed lymphocyte culture assay [J]. Cytometry, 2000, 42(5): 277-283.

[9] VENKEN K, THEWISSEN M, HELLINGS N,etal. A CFSE based assay for measuring CD4+CD25+ regulatory T cell mediated suppression of auto-antigen specific and polyclonal T cell responses [J]. J Immunol Methods, 2007, 322(1-2): 1-11.

[10] GANUSOV V V, MILUTINOVIC D, DE BOER R J. IL-2 regulates expansion of CD4+ T cell populations by affecting cell death: insights from modeling CFSE data[J]. J Immunol, 2007,179(2): 950-957.

[11] 包晶晶, 林海霞, 馬 璟, 等. CFSE示蹤與流式細胞儀檢測法研究環(huán)磷酰胺對T淋巴細胞增殖的影響[J]. 中國藥理學通報, 2010, 26(6): 828-831.

[12] THOMAS A K, MAUS M V, SHALABY W S,etal. A cell-based artificial antigen-presenting cell coated with anti-CD3 and CD28 antibodies enables rapid expansion and long-term growth of CD4 T lymphocytes [J]. Clin Immunol, 2002, 105(3): 259-272.

[13] CASTAGNA M, TAKAI Y, KAIBUCHI K,etal. Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumor-promoting phorbol esters [J]. J Biol Chem, 1982, 257(13): 7847-7851.

[14] 嚴 俊, 姚 堃, 周瑤璽. T細胞活化、活化信號和IFN-γ誘生的關(guān)系研究[J].免疫學雜志, 1992, 8(2): 95-98.

[15] MCNANARA M J, HILGART-MARTISZUS I, BARRAGAN E D M,etal. Interferon-gamma production by peripheral lymphocytes predicts survival of tumor-bearing mice receiving dual PD-1/CTLA-4 blockade [J]. Cancer Immunol Res, 2016, 4(8): 650-657.

CFSE-labeled proliferative assays for assessment of T cell function induced by different stimulants

XUE Ni-na1#, DONG Kai2#, LAI Fang-fang1, HUANG Rui1, CHEN Xiao-guang1*

(1. State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines/Beijing Key Laboratory of Non-Clinical Drug Metabolism and PK/PD Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China; 2. Tianjin Chase Sun Pharmaceutical Co.LTD, Tianjin 301700, China)

The aim of this paper is to investigate the effect of different stimulants on the proliferation and activation of human peripheral blood lymphocytes. Human peripheral blood lymphocytes were isolated by density centrifugation and labeled with CFSE with the final concentration of 1μmol/L. Flow cytometry analysis was used to detect the division and proliferation of lymphocytes after administration of anti-CD3/28 antibody, phytohemagglutinin (PHA) and phorbol ester (PMA) for 72 h. In addition, IFNγ content that reflects the activation of T lymphocytes was detected by ELISA method.And found that 0.125μg/mL of anti-CD3/28 antibody and 5 or 10μg/mL of PHA could induce the gradual reduction of green fluorescence, with a "Multi-peak" pattern in flow cytometry analysis, the results indicated that both anti-CD3/28 antibody and PHA are potential had strong stimulants for lymphocyte division and proliferation. In comparison, the role of PMA alone in promoting lymphocyte division and proliferation was weak. Furthermore, anti-CD3/28 antibody, PHA and PMA almost could increase the IFNγ secretion from lymphocytes. However, anti-CD3/28 antibody was the most stimulator,PHA, and PMA was the weakest agent for stimulating the production of IFNγ in lymphocytes. In the CFSE-based proliferative assays for assessment of T cell function, this paper concluded that both anti-CD3/28 antibody and PHA were effective stimulants for the proliferation and activation of lymphocytes, with the optimal concentrations of 0.125 μg/mL and 10 μg/mL, respectively.

lymphocyte proliferation; CFSE; interferon γ; flow cytometry

2016-12-27.

中國醫(yī)學科學院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目(2016ZX350041、2016ZX350002)#標注為共同第一作者

薛妮娜(1986-)，女，博士，助理研究員，研究方向：抗腫瘤免疫藥物的尋找及分子機制研究；董 凱(1974-)，男，碩士. 研究方向：小分子和多肽創(chuàng)新藥物的分子設(shè)計及研發(fā).

陳曉光(1958-)，女，博士，研究員，研究方向：抗腫瘤分子藥理.E-mail:chxg@imm.ac.cn.

R446

A

1672-0946(2017)02-0129-06