虞國(guó)凱 魏余輝 劉 林,3 張 萍 王 碩,3 劉文靜,3 周星飛 李 賓

基于原子力顯微術(shù)的DNA折紙彈性模量的研究

虞國(guó)凱1魏余輝2劉 林2,3張 萍2王 碩2,3劉文靜2,3周星飛1李 賓2

1（寧波大學(xué) 理學(xué)院 寧波 315211）
2（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 物理生物學(xué)研究室 嘉定園區(qū) 上海 201800）
3（中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

原子力顯微術(shù)(Atomic force microscopy, AFM)的力學(xué)成像模式可在高分辨成像的同時(shí)，定量測(cè)量材料的力學(xué)性質(zhì)。然而，對(duì)尺度小、質(zhì)地薄而軟的生物分子的彈性模量的測(cè)量仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。本文以脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)折紙為檢測(cè)樣品，將峰值力定量納米力學(xué)模式(Peak Force Quantitative Nanomechanical Mapping, PF-QNM)作為測(cè)量手段研究了DNA分子的力學(xué)性質(zhì)，探索不同作用力對(duì)DNA折紙彈性模量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)峰值力控制在80?100 pN時(shí)，峰值力成像穩(wěn)定，獲得的楊氏模量維持在約10 MPa。與傳統(tǒng)力曲線陣列模式(Force volume mapping, FV)相比較，在小力區(qū)(＜100 pN)，兩種方法符合性較好。這種峰值力定量納米力學(xué)模式為DNA分子定量力學(xué)性質(zhì)研究提供了一種簡(jiǎn)便而有效的研究方法。

原子力顯微術(shù)，DNA折紙，楊氏模量，峰值力

原子力顯微術(shù)(Atomic force microscopy, AFM)自1986年發(fā)明以來(lái)[1]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類(lèi)樣品的形貌表征[2?3]和力學(xué)性質(zhì)的測(cè)量[4?5]。其中，AFM的力曲線陣列模式(Force volume mapping, FV)[6]是測(cè)量不同材料力學(xué)性能（形變量、楊氏模量、粘滯力等）有效的檢測(cè)方法。FV模式的特點(diǎn)在于原子力顯微鏡的探針在接觸樣品過(guò)程中，探針懸臂部分的偏折與探針末端與樣品間的相互作用力相關(guān)。一束激光投射在探針懸臂的背面，光電二極管記錄激光的偏折信息，由此可獲得探針與樣品表面的力曲線，通過(guò)分析力-距離曲線得到樣品的納米力學(xué)性質(zhì)。由于FV模式采用的是觸發(fā)式，成像速度較慢，探針在樣品上的作用力精準(zhǔn)控制比較困難。由輕敲成像模式發(fā)展而來(lái)的力學(xué)成像模式-峰值力定量納米力學(xué)模式(Peak Force quantitative nanomechanical mapping, PF-QNM)[7]以峰值力作為反饋信號(hào)，而峰值力為設(shè)定的探針與樣品間極小的相互作用力，所以該模式可準(zhǔn)確控制探針作用在樣品上的作用力，具有高速和高分辨率測(cè)量樣品納米力學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)，可快速掃描樣品，同時(shí)獲得樣品的形貌和力學(xué)性質(zhì)信息，為精確測(cè)量生物膜[8]、蛋白質(zhì)[9]和淀粉樣纖維[10]等納米級(jí)生物分子結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)提供了一條重要途徑。

脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)是重要的生物分子，承載著生物體的遺傳信息，控制著生命體的活動(dòng)。DNA分子是一種直徑只有2.0 nm的長(zhǎng)鏈狀生物分子，它是由兩條反向平行的DNA鏈盤(pán)旋而成的規(guī)則雙螺旋立體結(jié)構(gòu)[11]。由于其具備了獨(dú)特的多樣性、特異性和化學(xué)穩(wěn)定性等特性，已經(jīng)成為人們廣泛研究的主題[12]。但是，盡管經(jīng)歷了許多年的研究，DNA分子的一些基本性質(zhì)仍然沒(méi)有被很好地理解，例如DNA分子的柔性或彈性等力學(xué)性質(zhì)。在擁擠的細(xì)胞核環(huán)境中，DNA分子不可避免與液體或生物大分子相互碰撞，被動(dòng)發(fā)生形變；DNA發(fā)揮作用時(shí)，需要發(fā)生構(gòu)象變化進(jìn)而與其他分子發(fā)生相互作用，這些都與DNA分子的力學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)[13]。楊氏模量是力學(xué)性能研究中最常用的參數(shù)之一，雖然已經(jīng)有AFM測(cè)量單個(gè)DNA分子楊氏模量的方法[14]，但是液體環(huán)境中DNA彈性測(cè)量未見(jiàn)報(bào)道。DNA分子彈性與自身以及周?chē)h(huán)境水分子的含量有密切的關(guān)系，在液體環(huán)境下的DNA分子其彈性性質(zhì)更加接近其結(jié)構(gòu)的真實(shí)狀態(tài)。實(shí)際上，DNA主要存在于細(xì)胞核中，且細(xì)胞核中DNA分子多是以超級(jí)結(jié)構(gòu)“集合體”的形式存在，DNA雙鏈以線狀舒張狀態(tài)存在的形式很少或者說(shuō)并不多見(jiàn)。所以，本文以一種DNA自組裝形式的DNA折紙為模型，測(cè)量DNA分子的楊氏模量，研究其彈性性質(zhì)。DNA折紙術(shù)是由一條DNA長(zhǎng)鏈和若干條DNA短鏈自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)，通過(guò)設(shè)計(jì)可獲得形態(tài)各異的兩維和三維的納米圖案[15]。通常兩維的單層DNA折紙是由雙鏈DNA交互排列而成，其理論高度為2 nm，此即為雙鏈DNA分子高度，能夠較好體現(xiàn)DNA鏈規(guī)則雙螺旋的本質(zhì)特性。但是如何在測(cè)量彈性的過(guò)程中，保證針尖有足夠的壓入深度同時(shí)又能夠避免基底表面作用力的影響[16]，準(zhǔn)確高效地測(cè)量DNA的力學(xué)性質(zhì)，依舊是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。

本文利用AFM的PF-QNM模式，測(cè)量DNA樣品彈性，研究峰值力對(duì)DNA折紙楊氏模量測(cè)量的影響，并與FV模式相比較，優(yōu)化DNA折紙楊氏模量的測(cè)量方法。

1 材料與方法

二維矩形圖案的DNA折紙通常是一條長(zhǎng)鏈和兩百多條短鏈自組裝形成[17]，本實(shí)驗(yàn)所用長(zhǎng)方形DNA折紙的自組裝步驟簡(jiǎn)述如下：將長(zhǎng)鏈DNA（單鏈腳手架鏈）與216條訂書(shū)釘鏈DNA混合于TAE-Mg2+緩沖體系中，放入新加坡生產(chǎn)的PCR (Polymerase Chain Reaction)儀中，從95 oC退火至20 oC，退火速率為0.1 oC/10 s，獲得DNA折紙后進(jìn)行超濾。長(zhǎng)鏈DNA為美國(guó)NEB公司的M13mp18噬菌體病毒單鏈DNA，訂書(shū)釘短鏈DNA購(gòu)于上海生物工程有限公司。用1×TAE/Mg2+緩沖液（40mmol·L?1Tris-乙酸、1 mmol·L?1乙二胺四乙酸(EDTA)、12.5mmol·L?1MgCl2，pH 8.0），將超濾完成后的DNA折紙稀釋到10 nmol，?20 oC儲(chǔ)存?zhèn)溆?。制備AFM樣品時(shí)，取2 μL的DNA折紙滴于新解離的云母上，吸附5 min后，將樣品放在載物臺(tái)上，加入30 μL 1×TAE/Mg2+緩沖液后，用于AFM成像。

AFM采用的是德國(guó)Bruker公司NanoScope VIII系統(tǒng)，在PF-QNM和FV模式下獲取數(shù)據(jù)。掃描管為J頭，探針采用Bruker公司型號(hào)為Scanasyst-FLUID+的針尖。成像溫度為25 oC左右。液相環(huán)境條件下，在Bruker公司提供的藍(lán)寶石上校準(zhǔn)探針偏折靈敏度，用AFM系統(tǒng)自帶軟件Thermal Tune功能確定探針的彈性常數(shù)(k)，使用布魯克(Bruker)公司提供的已知楊氏模量的標(biāo)準(zhǔn)樣品校準(zhǔn)針尖的半徑(R)。我們采用PF-QNM的直接法獲得樣品的彈性模量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 PF-QNM力曲線分析和楊氏模量計(jì)算

PF-QNM力曲線是力學(xué)成像模式獲得楊氏模量的原理基礎(chǔ)，圖1是PF-QNM的力-距離曲線，橫坐標(biāo)表示探針與樣品間的距離，縱坐標(biāo)表示探針與樣品間的作用力，正方向表示峰值力的大小，負(fù)方向表示粘滯力，圖1中Extend曲線表示探針靠近樣品表面時(shí)力和距離的關(guān)系，Retract曲線表示探針離開(kāi)樣品表面時(shí)力與距離的關(guān)系。為了避免趨近曲線中樣品塑形形變部分的影響，采用Retract曲線獲取樣品的彈性形變。利用這部分彈性形變與力的關(guān)系，擬合這部分?jǐn)?shù)據(jù)，定量計(jì)算樣品的楊氏模量[18]。

圖1 力曲線示意圖Fig.1 Sketch of force-distance curve.

楊氏模量的計(jì)算，選擇合適的物理模型對(duì)力曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合是首要關(guān)鍵步驟。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件的不同和樣品材料的多樣性和特殊性，需要考慮探針接觸樣品表面時(shí)的各種相互作用的差異（主要是粘滯力[19]），可以將探針與樣品之間的接觸物理模型分為Hertz模型、Sneddon 模型、Johnson-Kendall-Roberts (JKR)模型和Derjaguin-Mrjagui-Toporov (DMT)模型。Hertz和Sneddon 模型是兩種本質(zhì)上相同的模式，它們是不考慮接觸面間的相互作用，以針尖-樣品之間的相互作用為線性彈性關(guān)系。原始Hertz模型僅適用于半球狀針尖，后來(lái)Sneddon模型對(duì)其進(jìn)行了擴(kuò)展，將其它軸對(duì)稱(chēng)幾何形狀（圓錐）的針尖也包含在內(nèi)，豐富了探針形狀的選擇。JKR模型適用于針尖和樣品之間除了有彈性相互作用之外，還有較強(qiáng)的粘合接觸。DMT模型適用于粘附力較弱但仍可測(cè)到的樣品，以及和與樣品壓痕深度相比針尖半徑相對(duì)較小的樣品最為有效[20]。在動(dòng)態(tài)掃描過(guò)程中，樣品與探針之間的粘滯力很小[21]，涉及相對(duì)較弱的粘附力和較小的針尖半徑，因此DMT模型更適用于DNA彈性研究。其公式如下：

式中：F是AFM施加的負(fù)載力；Fadh是樣品的粘滯力；R是針尖半徑；d是樣品的形變量；E*是簡(jiǎn)約楊氏模量。其中E*可以由式(2)得到：

式中：υs、υt分別是樣品和針尖的泊松系數(shù)；Es、Et是樣品楊氏模量和針尖的楊氏模量。由于生物樣品相比較針尖而言彈性非常大，所以擬合數(shù)據(jù)只需要υs，這樣F就可以算出樣品的彈性楊氏模量。

2.2 PF-QNM模式DNA折紙楊氏模量的測(cè)量

在AFM的PF-QNM模式下，不僅可以獲得樣品的高分辨率形貌圖，還可以獲得包含樣品力學(xué)性質(zhì)的信息。圖2(a)和(c)分別為DNA折紙的形貌圖和DMT楊氏模量圖（峰值力100 pN）。AFM形貌圖中（圖2(a)），DNA折紙和云母襯底差別明顯。DNA折紙呈現(xiàn)為長(zhǎng)方形，橫線處高度測(cè)量值約為1.9 nm（圖2(b)），與設(shè)計(jì)的幾何形狀相符合。楊氏模量圖中（圖2(c)）可以觀察到兩部分彈性楊氏模量，一部分為較硬的白云母，另一部分為DNA折紙，質(zhì)地較軟。橫線處模量約為10.0 MPa（圖2(d)）。楊氏模量圖中（圖2(c)和(d)），雖然云母和DNA折紙可很好地區(qū)分，但是測(cè)量獲得的云母基底楊氏模量在70 MPa左右，與云母的實(shí)際值不符。造成這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是100 pN的小力對(duì)較硬的云母不能達(dá)到足夠的壓入深度[20]。當(dāng)AFM測(cè)量樣品的楊氏模量，AFM的探針是否壓入樣品足夠的深度，是非常重要的物理信息。要保證足夠的壓入深度，除了選擇合適的探針外，在PF-QNM模式下也需要選取合適大小的峰值力。圖2(e)是圖2(a)在快速掃描過(guò)程中的云母和DNA折紙的力曲線（圖2(e)為DNA折紙上某點(diǎn)的力曲線）。

圖2 原子力顯微鏡形貌圖像(a)和高度信息圖(b)、DMT楊氏模量圖像(c)和信息圖(d)、DNA折紙的力-距離曲線圖(e)Fig.2 AFM topography image (a) and cross section profile (b), AFM DMT modulus image (c) and cross section profile (d), force-distance curve of DNA origami (e).

2.3 PF-QNM模式不同峰值力對(duì)DNA折紙楊氏模量測(cè)量值的影響

PF-QNM模式能精確控制峰值力大小，同時(shí)獲得彈性楊氏模量的圖像，使獲得樣品模量值的過(guò)程更加快速便捷。對(duì)于只有2 nm高度的DNA折紙生物樣品，在測(cè)量過(guò)程中，探針壓入的深度對(duì)于DNA折紙楊氏模量的測(cè)量具有非常大的影響[22]。所以，選取合適的峰值力對(duì)測(cè)試小分子生物樣品的彈性楊氏模量至關(guān)重要。也就是說(shuō)，我們要準(zhǔn)確定量測(cè)量DNA的彈性楊氏模量，尋找到合適力區(qū)間是非常重要的。

為了尋找測(cè)量DNA彈性的最佳峰值力，測(cè)量中對(duì)同一DNA折紙樣品，改變峰值力大小，觀察DNA折紙的DMT楊氏模量變化趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖3(a)），當(dāng)設(shè)定的峰值力為60?100 pN時(shí)，DNA折紙的楊氏模量變化不大。當(dāng)峰值力增大到140pN時(shí)，DNA折紙的彈性楊氏模量的測(cè)量值顯著增加，可達(dá)到20.0 MPa左右，而峰值力降低到40 pN時(shí)，DNA折紙的彈性顯著減小。從力-距離曲線中，可以獲得樣品在受到不同力作用下的形變。當(dāng)AFM峰值力較小在40 pN時(shí)，DNA的彈性楊氏模量顯著減小。這可能由于峰值力太小，造成探針壓入DNA折紙深度不夠，如圖3(b)中第一種探針與樣品壓入位置深度關(guān)系所示；當(dāng)峰值力在140pN時(shí)，由于力過(guò)大，導(dǎo)致探針壓入形變受到基底云母的影響，造成實(shí)際的DNA模量值被掩埋，如圖3(b)中第三種情形。當(dāng)峰值力在80?100 pN時(shí)，探針壓入DNA折紙深度相對(duì)合適，如圖3(b)中第二種情況，結(jié)合模量值與峰值力關(guān)系，可得出該力區(qū)間所測(cè)的DNA楊氏模量值較為準(zhǔn)確，并且穩(wěn)定性好。

圖3 不同峰值力DNA折紙的彈性楊氏模量(a)和三種針尖壓入折紙深度的示意圖(b)Fig.3 The DMT modulus of DNA origami as a function of peak force (a) and sketch of the three kinds of indentation of tip pressuring on DNA origami (b).

2.4 FV模式DNA折紙楊氏模量的測(cè)量

傳統(tǒng)的FV模式廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)和材料等領(lǐng)域，在FV模式下得到的力曲線更能反映樣品真實(shí)的物理特性[23]。

圖4(a)是FV模式形貌圖，圖4(b)是圖4(a)中黑色叉處的力曲線，即探針作用白云母的力-距離曲線，圖4(c)是圖4(a)中折紙?zhí)幍牧?距離曲線，即探針作用在DNA折紙的力-距離曲線。在圖4(b)中，Extend曲線表示探針靠近白云母表面時(shí)力與距離的關(guān)系曲線，Retract曲線表示探針離開(kāi)白云母表面時(shí)力與距離的關(guān)系曲線。比較圖4(b)和圖4(c)中的Retract曲線，并進(jìn)行DMT楊氏模量的擬合，圖4(b)中，Retract曲線部分線性好，反映的是白云母的彈性楊氏模量，擬合值為4.5 GPa；圖4(c)中的折紙的Retract曲線可以觀察到斜率不一樣的曲線，可大致分為兩部分：Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)。曲線Ⅰ區(qū)的對(duì)應(yīng)擬合的力區(qū)間在100?400 pN，形變量在0.5 nm，根據(jù)DMT擬合的彈性楊氏模量是450MPa。在這部分力區(qū)間內(nèi)，所測(cè)得楊氏模量明顯高于Ⅱ區(qū)部分。而在曲線II區(qū)的對(duì)應(yīng)擬合的力區(qū)間是0?100pN，形變量在1.2nm，擬合的彈性楊氏模量為10.0 MPa左右。綜合DNA折紙的特點(diǎn)，高度為2.0nm?？梢哉J(rèn)為，Ⅱ區(qū)的彈性楊氏模量就是DNA折紙的楊氏模量，Ⅰ區(qū)部分的力曲線是固體基底白云母和DNA折紙共同作用的結(jié)果。而且通過(guò)觀察多條DNA折紙上的力曲線，此現(xiàn)象比較明顯，并非偶然現(xiàn)象。圖4(d)中分別為400 pN和720pN作用力條件下的力曲線，發(fā)現(xiàn)在100pN以下區(qū)間擬合楊氏模量在10.0 MPa左右，400 pN力曲線擬合數(shù)據(jù)為10.3 MPa，720 pN力曲線擬合數(shù)據(jù)為8.9 MPa。說(shuō)明在不同的力作用下，擬合力曲線中力為0?100 pN，可以得到DNA折紙的彈性模量約為10 MPa。以上結(jié)果顯示，盡管兩種力學(xué)測(cè)量模式成像有些差異，但在一定范圍內(nèi)獲得的DNA折紙的力學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)相近似。

圖4 FV原子力顯微鏡形貌圖像(a)、白云母表面上的力-距離曲線(b)、DNA折紙的力-距離曲線(c)、DNA折紙分別受到400 pN和720 pN條件下，探針離開(kāi)DNA折紙表面時(shí)的力曲線(d)Fig.4 FV topography AFM image (a), force-distance curve of mica (b), force-distance curve of DNA origami (c), retract curves of DNA origami under the force of 400 pN and 720 pN, respectively (d).

3 結(jié)語(yǔ)

DNA是重要的長(zhǎng)鏈狀生物分子，其彈性與結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。本文將AFM的力學(xué)性質(zhì)測(cè)量與DNA折紙技術(shù)相結(jié)合，建立了一種新穎可靠的定量測(cè)量DNA分子楊氏模量的方法。通過(guò)AFM的PF-QNM模式，獲得了液體環(huán)境中DNA折紙的楊氏模量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)峰值力區(qū)間為80?100 pN時(shí)，測(cè)量結(jié)果較為準(zhǔn)確和穩(wěn)定。AFM的PF-QNM模式與傳統(tǒng)的力學(xué)性質(zhì)測(cè)量模式FV相比較顯示兩種力學(xué)性質(zhì)測(cè)量模式各有特點(diǎn)。對(duì)于DNA折紙來(lái)說(shuō)，只有在合適的針尖與樣品相互作用力范圍內(nèi)，獲得的楊氏模量才比較可靠。本文測(cè)量的DNA折紙的楊氏模量約為10 MPa，隨著樣品與探針間的作用力有所改變，說(shuō)明生物材料有較大的彈性、易形變，提示在對(duì)微小的生物薄樣品進(jìn)行定量力學(xué)性質(zhì)測(cè)定時(shí)，需要控制作用力的范圍，這對(duì)其他生物分子彈性測(cè)量具有借鑒的意義。

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Compression elastic property of DNA origami measured by atomic force microscopy

YU Guokai1WEI Yuhui2LIU Lin2,3ZHANG Ping2WANG Shuo2,3LIU Wenjing2,3ZHOU Xingfei1LI Bin2
1(School of Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)
2(Division of Physical Biology, Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China)
3(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Background: The mechanical mapping mode of atomic force microscopy (AFM) enables to measure mechanical properties of materials while imaging with high-resolution. However, to measure the elastic Young’s modulus of biomolecules is still a challenge because they are so small, soft and thin. Purpose: This study aims to explore the compression elasticity of DNA origami and the different forces on the effect of Young’s measurement on the deoxyribonucleic acid (DNA) origami sample. Methods: The peak force imaging mode (Peak Force Quantitative Nanomechanical Mapping, PF-QNM) was used to measure the Young’s modulus of DNA origami under various activing forces. Results: It was found that by using of 80?100 pN peak forces, the elastic Young’s modulus measurement results were relatively stable, keeping about 10 MPa for the peak force measurement on DNA origami. Compared with the traditional force volume contract mode (Force volume mapping, FV), the values obtainedconsisted well with that of FV when the force were limited below 100 pN. Conclusion: This method provided a simple and effective way for quantitative measuring the elasticity of DNA molecules.

YU Guokai, male, born in 1991, graduated from Chongqing Three Gorges University in 2014, master student, focusing on quantitative

ZHOU Xingfei, E-mail: zhouxingfei@nbu.edu.cn; LI Bin, E-mail: libin@sinap.ac.cn

AFM, DNA origami, Young’s modulus, PF-QNM

TL99

10.11889/j.0253-3219.2017.hjs.40.040501

科技部973項(xiàng)目(No.2013CB932800、No.2012CB932600)、國(guó)家自然科學(xué)基金(No.11375253、No.11474173、No.31670871)、中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新項(xiàng)目(No.QYZDJ-SSW-SLH019)資助

虞國(guó)凱，男，1991年出生，2014年畢業(yè)于重慶三峽學(xué)院，現(xiàn)為碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓肿拥募{米機(jī)械性能的定量測(cè)量的研究通信作者：周星飛，E-mail: zhouxingfei@nbu.edu.cn；李賓，E-mail: libin@sinap.ac.cn

2017-01-17，

2017-02-15

Supported by National Basic Research Program of China (No.2013CB932800, No.2012CB932600), National Natural Science Foundation of China

(No.11375253, No.11474173, No.31670871), Chinese Academy of Sciences Knowledge Innovation Project (No.QYZDJ-SSW-SLH019)

measurement of the mechanical properties of biomolecule

Received date: 2017-01-17, accepted date: 2017-02-15