劉霞宇，陳亮，喬永剛，宋蕓，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

金銀花花器官實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

劉霞宇，陳亮，喬永剛，宋蕓，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

為了篩選金銀花花器官基因表達分析的適宜內(nèi)參基因，試驗以金銀花花器官6個時期為材料，選取金銀花的9個候選內(nèi)參基因Lonja.ACT11，Lonja.ACT2/7，Lonja.G6PD，Lonja.GAPDH，Lonja.MTP，Lonja.TUA，Lonja. UBQ10，Lonja.EF1A，Lonja.UBC，利用qRT-PCR技術(shù)及GeNorm，NormFinder軟件對它們的表達穩(wěn)定性進行分析評價。結(jié)果表明，Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD在金銀花花器官生長的不同時期表達水平較穩(wěn)定，運用qRT-PCR研究金銀花花器官基因表達時可選用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD組合作為內(nèi)參基因。

實時熒光定量PCR；金銀花花器官；內(nèi)參基因

基因表達在生物研究的許多領(lǐng)域都非常重要[1]。相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）[2]是檢測mRNA最可信的方法[3]。其具有高靈敏性、高通量以及特異性高、動態(tài)范圍廣等優(yōu)點[4]，但同時也存在一些困難，最重要的就是內(nèi)參基因的標準化。

在進行植物qRT-PCR研究時通常選用管家基因作為內(nèi)參，比如肌動蛋白（actin，ACT）、微管蛋白（tublin，TUA，TUB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、核糖體RNA（ribosomal RNA，18sr RNA，28sr RNA）、延伸因子（elongation factor1-α，EF1-α）等[5]。然而，在許多情況下這些基因的表達水平并不是很穩(wěn)定，甚至會導致錯誤的試驗結(jié)果[6-7]。所以，在用qRT-PCR技術(shù)進行基因表達研究時要提前篩選適合試驗條件的內(nèi)參基因。目前，常用篩選內(nèi)參基因的軟件有GeNorm[8]和NormFinder[9]。

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）又名忍冬，為忍冬科多年生半常綠纏繞木質(zhì)藤本植物，根據(jù)金銀花花色的變化，可以將金銀花開花過程分為米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期[10]。金銀花商品以花蕾為佳，其性甘寒、氣芳香，在中醫(yī)藥學中多作為宣散風熱、清解血毒等配方，是一種常見的中醫(yī)藥學藥用植物[11]。另外，金銀花可作為食物，也普遍被認為是一種健康飲品，所以使得金銀花在中草藥市場的商業(yè)價值快速上升[12]。

目前，國內(nèi)外已有很多關(guān)于金銀花的研究報道，主要集中在化學成分[13]、質(zhì)量[14]、生態(tài)價值[15]等方面。

本試驗對金銀花花器官的6個時期：米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期進行取材，通過qRT-PCR技術(shù)對9個候選內(nèi)參基因Lonja.ACT11，Lonja.ACT2/7，Lonja.G6PD，Lonja.GAPDH，Lonja.MTP，Lonja.TUA，Lonja.UBQ10，Lonja.EF1A和Lonja.UBC進行穩(wěn)定性分析，旨在為研究金銀花花器官的基因表達qRT-PCR分析奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇長勢一致的金銀花植株（種植于山西省晉中市太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學山西天然藥用生物研究院），分別在其米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期進行取材。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈合成利用北京華越洋植物RNA提取試劑盒提取各個樣品的總RNA，步驟參照說明書進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，RNA的濃度和純度用Nanodorp 2000c測定。反轉(zhuǎn)錄按照全式金TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒的方法進行，每個樣品分別以100 ng/μL總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，得到的產(chǎn)物部分用于普通PCR，部分凍存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量PCR引物的設計通過前期大量的文獻閱讀，找出植物中常用的qRT-PCR內(nèi)參基因（9個），利用生物信息學方法從山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院藥用植物育種實驗室已得到的金銀花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找出它們的同源基因。根據(jù)熒光定量PCR引物的設計原則，利用在線引物設計軟件IDT PrimerQuest Tool（http://sg.idtdna.com/PrimerQuest/H ome/Index）分別設計Lonja.ACT11，Lonja.ACT2/7，Lonja.G6PD，Lonja.GAPDH，Lonja.MTP，Lonja.TUA，Lonja.UBQ10，Lonja.EF1A，Lonja.UBC引物（表1）。

表1 候選內(nèi)參基因引物信息

1.2.3 內(nèi)參基因的特異性檢驗用內(nèi)參基因的普通PCR檢測其特異性：試劑為中科瑞泰2×Taq PCR MasterMix。反應體系列于表2。反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

表2 普通PCR反應體系（20 μL）

1.2.4 熒光定量PCR反應用全式金TransStartrRTip Green qPCR SuperMix試劑盒進行qRT-PCR反應，每個樣品3次生物學重復。反應體系列于表3。反應程序為94℃預變性30 s；94℃變性5 s，57℃退火15 s，72℃延伸10 s，45個循環(huán)；特異性檢測：以0.5℃/5 s的速率從70℃上升到95℃，期間讀取熒光信號值，繪制熔解曲線。

表3 qRT-PCR反應體系（10 μL）

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)熒光定量儀給出的數(shù)據(jù)，利用GeNorm，NormFinder軟件分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測

金銀花花器官的總RNA經(jīng)檢測可知，A260/A280的值均在2.0左右，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），28S的亮度約為18S的2倍，說明試驗提取的RNA完整性良好，可用于后續(xù)的試驗。

2.2 內(nèi)參基因的特異性檢驗

從圖2可以看出，每個基因的產(chǎn)物為單一條帶，表明有較高的專一性，而且產(chǎn)物片段在79～150 bp，與預測結(jié)果一致，說明設計的引物可用于進一步試驗。

2.3 內(nèi)參基因的選擇

利用GeNorm軟件通過計算基因的表達穩(wěn)定值（M）評價基因表達的穩(wěn)定性，基因的M值越小越穩(wěn)定。由圖3可知，金銀花花器官中9個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性大小依次是Lonja.ACT2/7＝Lonja.G6PD＞Lonja.GAPDH＞Lonja.MTP＞Lonja.ACT11＞Lonja. UBC＞Lonja.EF1A＞Lonja.UBQ10＞Lonja.TUA。由圖4可知，V2/3小于閾值0.15，說明沒有必要引入第3個內(nèi)參。NormFinder軟件計算結(jié)果表明（表4），Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD表達較穩(wěn)定，Lonja. UBQ10和Lonja.TUA穩(wěn)定性較差。2個軟件得到的結(jié)果一致，在一定程度上驗證了結(jié)果的可靠性。

表4 NormFinder軟件計算結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前，在藥用植物領(lǐng)域有一些關(guān)于篩選內(nèi)參基因的研究。侯維海等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TIP41和UBQ10在地黃花器官中表達穩(wěn)定，而在地黃根、莖、葉中TIP41和UBQ5表達穩(wěn)定。張崗等[17]以我國名貴中藥材鐵皮石斛為材料，研究發(fā)現(xiàn)，最適內(nèi)參基因為EF-1α和18S rRNA。李金弟[18]以托品烷類生物堿藥源植物顛茄作為研究對象進行研究，結(jié)果表明，PKG是其一個可靠的內(nèi)參基因。蔡嘉洛等[19]研究發(fā)現(xiàn)，18S rRNA是灰氈毛忍冬的適宜內(nèi)參基因。說明不同種類的藥用植物最適的內(nèi)參基因不同，同一物種不同的組織、器官最適宜的內(nèi)參基因也不同。因此，在進行基因表達研究前，篩選適合試驗的內(nèi)參基因是非常必要的。

本試驗通過qRT-PCR技術(shù)，篩選出金銀花花器官的最適內(nèi)參基因為Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD，運用qRT-PCR研究金銀花花器官基因表達時可選用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD組合作為內(nèi)參基因，這為金銀花花器官基因表達研究奠定了基礎。

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Selection of Reference Genes by qRT-PCR in Flower Organ ofLonicera japonicaThunb.

LIUXiayu，CHENLiang，QIAOYonggang，SONGYun，WANGJinsheng
（College ofLife Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The study aimed to select stable and optimal reference genes for gene expression analysis in flower of Lonicera japonica Thunb.,taking 6 periods of Lonicera japonica Thunb.as materials.A total of nine reference genes including Lonja.ACT11,Lonja. ACT2/7,Lonja.G6PD,Lonja.GAPDH,Lonja.MTP,Lonja.TUA,Lonja.UBQ10,Lonja.EF1A,Lonja.UBC were compared by qRT-PCR.The stability of expression of the nine reference genes were evaluated by GeNorm and NormFinder software.The results showed that Lonja.ACT2/7 and Lonja.G6PD were the most suitable reference genes among different periods of flower organ,Lonja. ACT2/7 and Lonja.G6PD were used as the reference gene in the studyofgene expression ofhoneysuckle flower organs byqRT-PCR.

qRT-PCR;flower organ ofLonicera japonica Thunb.;reference genes

S567.7＋9

A

1002-2481（2017）04-0514-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.06

2016-10-04

山西省科技攻關(guān)項目（20140312001-2）；山西農(nóng)業(yè)大學橫向項目（2014HX60）

劉霞宇（1991-），女，山西方山人，在讀碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。王金勝為通信作者。