趙衛(wèi)東 侯 燕 韓國新 王慶寶

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬東平醫(yī)院普外科，山東 東平 271500；2. 東平縣中醫(yī)院體檢中心，山東 東平 271500；3. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，山東 泰安 271000)

轉(zhuǎn)染BRMS1基因?qū)θ祟愐认侔┘?xì)胞在裸鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移能力影響的研究*

趙衛(wèi)東1侯 燕2韓國新3王慶寶3

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬東平醫(yī)院普外科，山東 東平 271500；2. 東平縣中醫(yī)院體檢中心，山東 東平 271500；3. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，山東 泰安 271000)

目的 建立人類胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，研究BRMS1基因?qū)θ祟愐认侔┘?xì)胞在裸鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移能力的影響，尋找胰腺癌基因治療的有效模式。方法 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建的pEGFP-C1-BRMS1重組載體、pEGFP-C1空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人類胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中，接種三組(轉(zhuǎn)染組、空載體組、未轉(zhuǎn)染組)細(xì)胞于裸鼠背部皮下，5周后處死裸鼠，取腫瘤、淋巴結(jié)及肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 將pEGFP-C1-BRMS1重組載體、pEGFP-C1空載體轉(zhuǎn)染入人類胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，并建立了人類胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，三組裸鼠腫瘤大小無明顯差異，但轉(zhuǎn)染組裸鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯低于空載體組和未轉(zhuǎn)染組。結(jié)論 BRMS1基因不影響人類胰腺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長，但可以抑制人類胰腺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的局部淋巴轉(zhuǎn)移。

BRMS1；腫瘤轉(zhuǎn)移；胰腺癌；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；裸鼠皮下移植瘤模型

胰腺癌是一種惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差的消化道惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]，在所有腫瘤中其發(fā)病率位居第11位，但死亡率居第5 位，其死亡率與發(fā)病率之比為0.99∶1[2]。近年來，腫瘤轉(zhuǎn)移基因[3]與腫瘤的關(guān)系日益引起人們的重視，通過抑制腫瘤轉(zhuǎn)移來治療腫瘤是可以考慮的，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制將成為我們治療腫瘤的一個新途徑[4]。BRMS1(breast-cancer metastasis suppressor 1, BRMS1)是Seraj等[5]在2000年新報道的一種轉(zhuǎn)移抑制基因，該基因同其他轉(zhuǎn)移抑制基因一樣可以抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但不影響腫瘤在原位的生長[6]。我們將BRMS1通過脂質(zhì)體介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BRMS1基因表達(dá)缺失的人類胰腺癌細(xì)胞PANC-1中，恢復(fù)胰腺癌細(xì)胞BRMS1基因的表達(dá)，觀察BRMS1基因?qū)β闶骩7]體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移能力的影響，為胰腺癌的基因治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗用細(xì)胞、動物及質(zhì)粒

人類胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1由泰山醫(yī)學(xué)院肝膽胰研究所惠贈；BALB/C-NU裸鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部；pEGFP-C1空載體質(zhì)粒由泰山醫(yī)學(xué)院肝膽胰研究所惠贈；pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒由長沙贏潤生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購自Solarbio公司；新生牛血血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、Opti-MEM、G418均購自Invitrogen公司。

1.3 方法

根據(jù)NCBI上序列號為NM_015399的BRMS1基因序列設(shè)計上游引物和下游引物(pEGFP-C1載體圖譜和多克隆位點見圖1)。為克隆至pEGFP-C1載體，上游引物引入BglⅡ酶切位點，下游引物引入EcoRⅠ酶切位點，且使其讀碼框與pEGFP-C1載體的讀碼框一致。BRMS1-f：5'-CCC AGATCT ATGCCTGTCCAGCCTCCAAGCAAAG-3'(下劃線為BglⅡ酶切位點)BRMS1-r：5'-CG GAATTC TCAAGGTCCATCCGATTTTCTCTTCTGAGG-3'(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)。以pUC57-BRMS1為模板，擴(kuò)增BRMS1基因片段，PCR產(chǎn)物的特異性條帶用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，亞克隆至pEGFP-C1載體，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在GIS凝膠成像系統(tǒng)中檢測750 bp的帶，初步證明BRMS1片段克隆到pEGFP-C1載體(見圖2)，同時將目的DNA片段BRMS1連入pEGFP-C1 載體的陽性菌種送南京金斯瑞公司測序(見圖3)。PANC-1復(fù)蘇、傳代，觀察14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低濃度600μg/ml為G418篩選濃度，采用脂質(zhì)體法介導(dǎo)細(xì)胞pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及pEGFP-C1空載體轉(zhuǎn)染，24 h后用熒光顯微鏡觀察pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒及pEGFP-C1空載體是否轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中(實驗結(jié)果見圖4)。以濃度為600μg/ml的G418篩選pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞、pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的陽性克隆，隨機(jī)挑取陽性克隆移至25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)并傳代。細(xì)胞分組如下：A組為轉(zhuǎn)染組，B組為空載體組，C組為為轉(zhuǎn)染組。

免疫細(xì)胞化學(xué)(SP法)檢測細(xì)胞BRMS1的表達(dá)，(實驗結(jié)果見圖5)。分別取A、B、C三組細(xì)胞，觀察細(xì)胞匯合度達(dá)90%，臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活力>90%，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/ml，置于無菌EP管中備用。取36只4周齡雌性BALB/C-NU裸鼠隨機(jī)分成3組，每組12只，分組如下：A組為轉(zhuǎn)染組，B組為空載體組，C組為為轉(zhuǎn)染組。將A、B、C三組細(xì)胞懸液分別接種于A、B、C三組裸鼠背部皮下，每只裸鼠接種0.2 ml(細(xì)胞密度為2×106/ml)，常規(guī)SPF級飼養(yǎng)裸鼠，每三天觀察裸鼠皮下移植瘤的生長變化，測量裸鼠體重。繼續(xù)飼養(yǎng)裸鼠至5周后，脫頸處死裸鼠，解剖裸鼠，取出皮下移植瘤、局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、肺臟。分別測量A、B、C三組裸鼠皮下移植瘤，腫瘤相互垂直的兩條徑線分別記作x與y，MD為腫瘤平均直徑，根據(jù)MD=(xy)1/2來計算腫瘤大小。分別計數(shù)A、B、C三組裸鼠的局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個數(shù)。分別觀察A、B、C三組裸鼠的肺臟轉(zhuǎn)移情況。將皮下移植瘤、局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、肺臟標(biāo)本置于10%中性甲醛中固定，石蠟包埋切片，HE染色，免疫組織化學(xué)(SP法)檢測裸鼠皮下移植瘤及局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)BRMS1的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0版軟件，進(jìn)行單因素方差分析和四格表卡方檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P≤0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BRMS1片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在GIS凝膠系統(tǒng)中檢測，出現(xiàn)BRMS1片段的條帶(約750 bp)，PCR擴(kuò)增出的片段大小與BRMS1片段的理論大小一致，膠回收約750 bp大小的PCR片段。將BRMS1基因片段亞克隆至pEGFP-C1載體。pEGFP-C1-BRMS1陽性克隆經(jīng)EcoRⅠ和BglⅡ酶切鑒定，切出約4.7 kb的載體帶和約750 bp的片段，初步推測BRMS1已經(jīng)克隆到pEGFP-C1載體(實驗結(jié)果見圖2)。陽性克隆測序結(jié)果表明，pEGFP-C1-BRMS1構(gòu)建正確(實驗結(jié)果見圖3)。

2.2 采用脂質(zhì)體法分別將pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒和pEGFP-C1空載體轉(zhuǎn)染到PANC-1細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下觀察到pEGFP-C1-BRMS1和pEGFP-C1在PANC-1細(xì)胞中表達(dá)。以100 μg/ml為濃度梯度，在100 μg/ml～1000 μg/ml范圍內(nèi)將G418加入PANC-1細(xì)胞中，并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。免疫細(xì)胞化學(xué)(SP法)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒的胰腺癌PANC-1細(xì)胞BRMS1呈陽性表達(dá)，胞內(nèi)可見棕褐色顆粒，而轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1空載體與未轉(zhuǎn)染的胰腺癌PANC-1細(xì)胞BRMS1則未見陽性表達(dá)。

2.3 細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部皮下后7～10天開始出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)，色與周圍皮膚相同，呈圓形，直徑4～6 mm，局部隆起1～2 mm，質(zhì)地韌，漸增大。至4～5周形成約11 mm×11 mm×11 mm大小瘤體，呈圓形、橢圓形，色粉紅，邊界清楚，表面光滑，包膜完整，活動度大。三組裸鼠成瘤時間、腫瘤生長速度、瘤體大小未見明顯差異。5周后處死三組裸鼠大體解剖(肺臟未見明顯轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié))并取腫瘤、局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及肺臟標(biāo)本行組織病理學(xué)觀察。

轉(zhuǎn)染組(A)、空載體組(B)、未轉(zhuǎn)染組(C)裸鼠皮下移植瘤直徑均數(shù)分別為： 10.75±1.54 mm 、11.17±1.53 mm、11.67±1.37 mm，A、B、C三組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)處理，F(xiàn)=1.149，P=0.329，P>0.05，說明A、B、C三組裸鼠皮下移植瘤大小比較無統(tǒng)計學(xué)意義。

轉(zhuǎn)染組(A)、空載體組(B)、未轉(zhuǎn)染組(C)裸鼠局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)比例分別為：33.33%±0.49%、83.33%±0.39%、91.67%±0.08%。 A、B、C三組數(shù)據(jù)采用四格表精確概率檢驗法(Fisher's exact test)處理(見表1～3)。轉(zhuǎn)染組分別與空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較，P值分別為：0.036、0.009，P<0.05，說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。空載體組與未轉(zhuǎn)染組比較，P值為1.000，P>0.05，說明差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 pEGFP-C1載體圖譜和多克隆位點

1：pEGFP-C1-BRMS1 M：DNA Marker IV

圖3 測序比對結(jié)果

圖4 轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒后胞內(nèi)表達(dá)(典型細(xì)胞)

圖5 轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒的PANC-1細(xì)胞：

圖6 轉(zhuǎn)染組局部淋巴結(jié)免疫組化切片(40×)：BRMS1

有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)P值轉(zhuǎn)染組(A)空載體組(B)410820.036

表2 轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組比較

表3 空載體組與未轉(zhuǎn)染組比較

轉(zhuǎn)染組、空載體組、未轉(zhuǎn)染組裸鼠局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)性免疫組化結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)BRMS1呈陽性表達(dá)，胞內(nèi)可見棕褐色顆粒(見圖6)，而空載體組和未轉(zhuǎn)染組局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)BRMS1呈陰性表達(dá)。

3 討 論

BMRS1基因是Seraj等[8]于2000年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，BMRS1基因全稱為乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1(breast-cancer metastasis suppressor l)，定位于染色體1lql3.1～q13.2，有10個外顯子和9個內(nèi)含子，cDNA全長為1485 bp，其中包含一個740 bp的開放讀碼框，分子量為28500。Smanat等[9]將BRMS1基因轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)移潛能降低了70%～90%，但是對乳腺癌的生長并未見明顯影響，然后將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了BRMS1基因的乳腺癌細(xì)胞接種至裸鼠乳腺脂肪墊下，發(fā)現(xiàn)肺部和局域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與對照組比較明顯減少。盡管BRMS1基因是作為乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因而被首先發(fā)現(xiàn)的，但是后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)BRMS1基因在多種腫瘤轉(zhuǎn)移中也起抑制作用。Seraj等[10]、Shevde等[11]和張殊等[12]相繼研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌、黑色素瘤和卵巢上皮癌中BRMS1基因表達(dá)的缺失和降低可以造成腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

本研究采用基因重組技術(shù)構(gòu)建BRMS1基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-BRMS1，根據(jù)NCBI上序列號為NM_015399的BRMS1基因序列設(shè)計上游引物和下游引物。然后選擇具有高轉(zhuǎn)移潛能的人類胰腺癌細(xì)胞PANC-1 作為靶細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法分別將pEGFP-C1-BRMS1重組質(zhì)粒和pEGFP-C1空載體轉(zhuǎn)染到PANC-1細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下分別觀察到pEGFP-C1-BRMS1和pEGFP-C1在PANC-1細(xì)胞中表達(dá)。我們將pEGFP-C1空載體轉(zhuǎn)染到PANC-1細(xì)胞中設(shè)為陰性對照，是為了排除轉(zhuǎn)染對細(xì)胞狀態(tài)的影響，同時又設(shè)未轉(zhuǎn)染的PANC-1細(xì)胞為空白對照以評定實驗的準(zhǔn)確度以及觀察實驗是否處于正常狀態(tài)，然后又用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞BRMS1的表達(dá)。

本研究選用BALB/C-NU裸鼠來作為實驗動物，其主要特征表現(xiàn)為無毛(hair less)和無胸腺(athymus less)，僅有胸腺殘跡或異常上皮，這種上皮不能使T細(xì)胞正常分化，缺乏成熟T細(xì)胞的輔助、抑制及殺傷功能，因而細(xì)胞免疫力低下。其B淋巴細(xì)胞正常，但功能欠正常，免疫球蛋白主要是IgM，只含少量IgG。由于T淋巴細(xì)胞缺陷，不能執(zhí)行正常T淋巴細(xì)胞功能，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中全無有絲分裂反應(yīng)，也不產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞，對刀豆A或植物凝集素亦無有絲分裂應(yīng)答，無接觸敏感性，無移植排斥，成年裸鼠(6～8周齡)較普通鼠有較高水平的NK細(xì)胞活性，但幼年裸鼠(3～4周齡)的NK細(xì)胞活性低下。隨著裸鼠年齡增長或有關(guān)因素的影響(如病毒感染)，裸鼠體內(nèi)正常T細(xì)胞會增加，故本研究接種腫瘤采用4周齡小鼠。

本研究得出的數(shù)據(jù)顯示：BRMS1基因轉(zhuǎn)染組、空載體組、未轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤直徑均數(shù)分別為：10.75±1.54 mm、11.17±1.53 mm、11.67±1.37 mm，三組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)處理，F(xiàn)=1.149，P=0.329，P>0.05，說明三組裸鼠皮下移植瘤大小比較無統(tǒng)計學(xué)意義，從以上數(shù)據(jù)可以得出，BRMS1基因不影響人類胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的形成和生長。另一組數(shù)據(jù)顯示： BRMS1基因轉(zhuǎn)染組、空載體組、未轉(zhuǎn)染組裸鼠局域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)比例分別為：33.33%±0.49%、83.33%±0.39%、91.67%±0.08%，三組數(shù)據(jù)采用四格表精確概率檢驗法(Fisher's exact test)處理，轉(zhuǎn)染組分別與空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較，P值分別為：0.036、0.009，P<0.05，說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。從這一組數(shù)據(jù)可以得出，BRMS1基因?qū)θ祟愐认侔┞闶笃は乱浦擦鼍钟蛄馨徒Y(jié)的轉(zhuǎn)移有抑制作用。BRMS1基因作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因有望于腫瘤的基因治療[13]，將是一種非常有前景的的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制制劑，該基因的開發(fā)和利用定會給腫瘤的基因治療開辟一條新的途徑，具有重要的社會意義和經(jīng)濟(jì)價值。然而該研究領(lǐng)域目前還處于動物實驗階段，對腫瘤轉(zhuǎn)移抑制的確切機(jī)制尚未闡明，我們將進(jìn)一步通過更先進(jìn)的實驗手段深入研究BRMS1基因?qū)θ祟愐认侔┺D(zhuǎn)移的影響并進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制。

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Study on BRMS1 gene transfection of human pancreatic cancer cells in nude mice effects of tumor metastasis

ZHAO Wei-dong HOU Yan HAN Guo-xin WANG Qing-bao

(1.Dept. of general surgery, Affiliated Hospital of Taishan Medical University of Dongping branch， Dongping 271500,China;2.Medical examination center, Dongping County Hospital of traditional Chinese， Dongping 271500,China;3.Dept. of general surgery, Affiliated Hospital of Taishan Medical University， Taian 271000,China)

Objective: The establishment of human pancreatic cancer nude mice model to study the BRMS1 gene in human pancreatic cancer cells in nude mice tumor metastasis ability to find an effective model of pancreatic cancer gene therapy.Methods: Liposome transfection technique using the constructed pEGFP-C1-BRMS1 recombinant vector, pEGFP-C1 empty vector stably transfected into human pancreatic cancer cell line PANC-1, the inoculated three groups (transfected group, empty vector group, not transfected group) cells subcutaneously in nude mice, mice were killed after 5 weeks, the tumor, lymph node and lung tissue for histopathological examination.Results: The pEGFP-C1-BRMS1 recombinant vector, pEGFP-C1 empty vector transfected into human pancreatic cancer cell line PANC-1, and established human pancreatic cancer xenograft model in nude mice, three groups no significant difference in tumor size in nude mice However, lymph node metastasis in nude mice transfected group was significantly lower than the empty vector group and untransfected group.Conclusion: BRMS1 gene in human pancreatic cancer cells without affecting tumor growth in nude mice subcutaneously, but can inhibit human pancreatic cancer cells transplanted into nude mice of the local lymph node metastasis.

metastasis; pancreatic cancer; stable transfection; nude mice subcutaneous xenograft model

泰安市科技局立項項目(項目編號：20083042)。

趙衛(wèi)東(1974—)，山東泰安人，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事臨床肝膽胰腫瘤工作。

王慶寶，教授，山東省泰安人，泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，泰山醫(yī)學(xué)院肝膽胰研究所。Email：qbwang@tsmc.edu.cn。

R735

A

1004-7115(2017)02-138-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.02.006

2016-10-13)