謝典佑

[摘要]作為體外合成蛋白表達(dá)手段的一種，無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系有著蛋白合成高效快速、反應(yīng)操縱簡(jiǎn)便等方面的優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域的研究中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系目前已成功應(yīng)用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)。高通量藥物篩選等領(lǐng)域，為解決生物制藥領(lǐng)域中的難題提供了新的解決思路。同時(shí)，經(jīng)過研究人員的不斷努力，對(duì)其在生物制藥工程中的應(yīng)用也取得了新的研究進(jìn)展，顯示出重要的應(yīng)用潛能。本文基于對(duì)無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系的闡述和分析，對(duì)其在生物制藥工程中的應(yīng)用做出了相關(guān)的探討和研究，以期能為生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展提供一定的技術(shù)支撐和借鑒。

[關(guān)鍵詞]生物：制藥工程；無細(xì)胞蛋白；表達(dá)體系；應(yīng)用

隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的前沿領(lǐng)域的研究越來越關(guān)注，無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系（cell-free protein synthesis，CFPS）也因此備受重視。尤其是近些年來，無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系的研究已逐漸從原核深入到真核的反應(yīng)體系，成本不斷降低。較之于傳統(tǒng)的體內(nèi)表達(dá)體系，無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系基于細(xì)胞提取物，有著不受細(xì)胞的生理限制以及胞內(nèi)蛋白酶的降解、可以在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量的毒性蛋白表達(dá)、無需繁雜的下游處理以及產(chǎn)物的活性增加等諸多方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，其在生物制藥中也逐漸體現(xiàn)出了毒性蛋白、復(fù)雜蛋白以及膜蛋白表達(dá)等方面的優(yōu)勢(shì)。但由于天然蛋白水溶性差、半衰期短等因素的影響，如何實(shí)現(xiàn)重組蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)揮無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系在醫(yī)療方面的應(yīng)用潛力，就成為生物制藥領(lǐng)域的重要研究課題。因此，本文討論和研究無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)在生物制藥工程中的有效應(yīng)用問題，將對(duì)更好地實(shí)現(xiàn)該系統(tǒng)在制藥科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用潛力的發(fā)揮有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1.無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系概述

作為一種生物學(xué)技術(shù)，傳統(tǒng)的蛋白表達(dá)是基于細(xì)胞體內(nèi)，對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞以及細(xì)菌等外源基因的表達(dá)。而無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)是一種全新的蛋白合成方式，實(shí)現(xiàn)了以外源DNA或mRNA為模板，利用細(xì)胞抽取物中的蛋白因子、相關(guān)的酶系等，通過在體系內(nèi)加入ATP、GTP以及氨基酸、能量再生物質(zhì)等來實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)的體外系統(tǒng)（如圖1所示）。自1982年世界上第一個(gè)重組蛋白藥物胰島素問世以來，重組蛋白藥物由于來源廣泛，且有著較高的安全性在短短幾十年時(shí)間就實(shí)現(xiàn)了在生物制藥領(lǐng)域的飛速發(fā)展，在全球藥物市場(chǎng)上越來越占據(jù)著舉足輕重的地位。表達(dá)重組蛋白藥物最常用的系統(tǒng)包括大腸桿菌、釀酒酵母以及中國(guó)的倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。但諸如此類的體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)往往由于種種原因而導(dǎo)致一些復(fù)雜蛋白不能順利表達(dá)，在這一迫切需求下，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。

隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蛋白合成技術(shù)的深入研究以及蛋白連續(xù)翻譯系統(tǒng)的建立，無細(xì)胞表達(dá)也有了突破性的研究，實(shí)現(xiàn)了蛋白的連續(xù)表達(dá)。該系統(tǒng)無需在活體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，基于細(xì)胞提取物就可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而快速高效合成目標(biāo)蛋白。該系統(tǒng)沒有細(xì)胞壁，也不必關(guān)注維持活體細(xì)胞生命的相關(guān)生化反應(yīng)，在表達(dá)技術(shù)上占據(jù)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，蛋白合成的條件相對(duì)容易調(diào)整，有助于蛋白的表達(dá)和折疊。依據(jù)這一優(yōu)勢(shì)，無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系在生物制藥工程中也較多適用于快速表達(dá)醫(yī)用蛋白、高通量蛋白庫(kù)篩選等復(fù)雜蛋白質(zhì)的合成。該系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是表達(dá)具有毒性的蛋白，由于無需維持宿主細(xì)胞的活性，也更容易地實(shí)現(xiàn)插入非天然氨基酸的表達(dá)，可較好地被用于研究蛋白的化學(xué)特性中。因此，隨著近些年來對(duì)該系統(tǒng)相關(guān)應(yīng)用研究的不斷深入，已經(jīng)逐漸實(shí)現(xiàn)了在生物制藥相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，如進(jìn)行多肽類藥物、腫瘤疫苗、重組蛋白藥物等大規(guī)模的生產(chǎn)以及高通量藥物的篩選等。

2.無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系的分類

就目前來講，已開發(fā)出來的無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要包括原核和真核兩種表達(dá)系統(tǒng)類型。兩者由于表達(dá)系統(tǒng)的不同，也存在著不同的特點(diǎn)，在實(shí)際科學(xué)生產(chǎn)研究的過程中需要根據(jù)不同的需求進(jìn)行兩種表達(dá)系統(tǒng)的恰當(dāng)選擇。

2.1原核系統(tǒng)

對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)的研究由來已久，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)是利用的原核生物細(xì)胞提取物，最為常見的是大腸桿菌。由于其具有較強(qiáng)的耐受性，因此在此基礎(chǔ)上建立無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)就具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。人們?cè)诰唧w進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)中，可以根據(jù)需要加入蛋白酶抑制劑以及標(biāo)記蛋白等特殊添加劑，在含有雜質(zhì)的情況下依舊可以進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)。其不足之處在于在進(jìn)行蛋白的翻譯加工后，在正確折疊方面現(xiàn)階段仍是較大的困難。不過由于大腸桿菌材料來源廣泛，成本較低，也存在著較高的表達(dá)效率，因此在體外表達(dá)系統(tǒng)研究中仍是較為熱門的話題。

2.2真核系統(tǒng)

真核表達(dá)系統(tǒng)是與原核表達(dá)相對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)，其進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)，利用的是真核生物細(xì)胞提取物。其中，最為常見的就是麥芽提取物和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液。與上述表達(dá)系統(tǒng)不同的是，真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不存在基因的非特異性激活或者抑制，因此能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)調(diào)控基因的高效表達(dá)。在該表達(dá)系統(tǒng)中，為保證得到性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)真核細(xì)胞基因組的整合，也常需要將環(huán)狀的模板線性化，以保證合成效率不斷加強(qiáng)。經(jīng)過相關(guān)學(xué)者的實(shí)踐研究證實(shí)了，大腸桿菌以及麥芽提取物系統(tǒng)都有著較高的合成量，能夠進(jìn)行高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

3.在生物制藥工程中的應(yīng)用

無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系長(zhǎng)時(shí)間以來由于生產(chǎn)效率低下、成本高昂等缺點(diǎn)的限制，在生物學(xué)領(lǐng)域的研究較廣。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，相關(guān)的能量再生系統(tǒng)以及細(xì)胞提取物制備工藝等近些年來逐漸得以深入的研究和不斷優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了蛋白的體外高通量表達(dá)，并有效拓展了無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域。尤其是在生物制藥領(lǐng)域，該系統(tǒng)有著重要的應(yīng)用潛力，為實(shí)現(xiàn)生物制藥諸多問題的解決提供了新的解決思路。以下是筆者根據(jù)自身所學(xué)，總結(jié)出的無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)在生物制藥工程中進(jìn)行重組蛋白藥物的大規(guī)模生產(chǎn)、非天然氨基酸的引入以及蛋白的高通量表達(dá)等方面的具體應(yīng)用。

3.1引入非天然氨基酸

進(jìn)行蛋白工程改性的重要途徑就是將非天然氨基酸引入蛋白序列，以為蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾提供額外的基因。在早期的無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中，通過加入抑制性tRNA以識(shí)別特定終止密碼子的氨?；?，并以攜帶特定位點(diǎn)無義突變的基因作為模板，在目標(biāo)蛋白的特定位點(diǎn)引入非天然氨基酸（見圖2）。相關(guān)的研究人員在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了更為有效的編碼非天然氨基酸技術(shù)，并成功實(shí)現(xiàn)了在蛋白藥物進(jìn)行特異性修飾中的應(yīng)用，賦予了非天然氨基酸以獨(dú)特的藥理特性，如延長(zhǎng)半衰期以及提高了藥代動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性等。在現(xiàn)階段的研究中，通過在無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中添加非天然氨基酸底物，建立了高效便捷的反應(yīng)體系，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白進(jìn)行選擇性的修飾。如國(guó)外研究者Zimmerman等現(xiàn)已研發(fā)出新型的抗腫瘤藥物等。總之，由于這一方面的優(yōu)勢(shì)，該體系在升級(jí)蛋白藥物領(lǐng)域以及開發(fā)新型蛋白藥物中有著廣闊的應(yīng)用前景。

3.2重組蛋白藥物的大規(guī)模生產(chǎn)

隨著相關(guān)科學(xué)家研究的不斷深入和優(yōu)化，近些年來無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)已日趨成熟，能夠成功開發(fā)出反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)、體積更大且生產(chǎn)效率更高的體外蛋白合成系統(tǒng)。除此以外，無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系的優(yōu)勢(shì)還表現(xiàn)在蛋白活性以及下游純化工藝等方面，推進(jìn)了在重組蛋白藥物生產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用該系統(tǒng)的更深層次的研究和發(fā)展。無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)的常用來源為大腸桿菌，除此以外對(duì)上述的真核系統(tǒng)為來源的表達(dá)體系也逐漸被得以進(jìn)一步開發(fā)，在更加復(fù)雜結(jié)構(gòu)的膜蛋白以及翻譯后的修飾中得以開發(fā)生產(chǎn)。在這一方面國(guó)外學(xué)者Brodel等有了新的研究進(jìn)展，其建立了一套新型的哺乳動(dòng)物無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系，在促進(jìn)蛋白正確折疊、表達(dá)復(fù)雜蛋白方面占據(jù)著優(yōu)勢(shì)地位。并且在這一系統(tǒng)下，他們已實(shí)現(xiàn)了在體外進(jìn)行人促紅細(xì)胞生成素和螢火蟲熒光素酶的成功表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)其進(jìn)行糖基化修飾，有著里程碑的研究意義。其研究結(jié)果也證實(shí)了，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在重組蛋白藥物中，有著較好的大規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用前景。

3.3蛋白的高通量表達(dá)

實(shí)現(xiàn)基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系以及結(jié)構(gòu)功能的系統(tǒng)闡明，成為后基因組時(shí)代科學(xué)家面臨的重大難題之一。在這一背景下，建立相對(duì)高效的高通量蛋白表達(dá)技術(shù)就有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。而無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系由于其自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在近些年來的科學(xué)研究中倍受青睞。較之傳統(tǒng)的體內(nèi)表達(dá)體系，無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系省去了對(duì)分子的克隆過程，可直接使用PCR片段作為模板。對(duì)于一些很難在體內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)表達(dá)的復(fù)雜蛋白，也能夠?qū)崿F(xiàn)在無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的正確折疊。利用這些優(yōu)勢(shì)，研究人員在進(jìn)行體外蛋白質(zhì)組學(xué)的研究過程中，就有了一個(gè)更加靈活的研究手段。除此以外，該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)還在于能夠進(jìn)行高效便捷的制備蛋白芯片。利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系能夠一步法實(shí)現(xiàn)蛋白的固定化，無需在進(jìn)行大量可溶性蛋白的純化，從而省去了高昂的成本費(fèi)用以及蛋白的表達(dá)與純化過程，有著較為靈活的過程和特點(diǎn)?，F(xiàn)階段經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，蛋白芯片技術(shù)已逐漸能夠在臨床診斷以及對(duì)有毒物質(zhì)的檢測(cè)中進(jìn)行有效地應(yīng)用，如對(duì)代謝類疾病、癌癥以及免疫的診斷等?？傊瑹o細(xì)胞蛋白表達(dá)體系在蛋白制備技術(shù)以及高通量蛋白表達(dá)中的成功應(yīng)用和快速發(fā)展，也促進(jìn)了其在新藥發(fā)現(xiàn)、疫苗研發(fā)以及疾病診斷等諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

綜上所述，作為一種快速高效的體外蛋白合成手段，無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系較之傳統(tǒng)的體內(nèi)表達(dá)，能夠有效彌補(bǔ)其不足，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜蛋白在體外的順利表達(dá)，因此在生物制藥領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)然，在現(xiàn)階段的無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中的研究中也仍然存在一定的不足之處，要實(shí)現(xiàn)其在生物制藥工程中更為廣泛的應(yīng)用，還需要相關(guān)的研究人員不斷優(yōu)化和研究其反應(yīng)體系，充分挖掘體外合成系統(tǒng)的應(yīng)用潛力，更好地推進(jìn)我國(guó)生物制藥工程的發(fā)展。