陶峰　顧超　張齊

[摘要] 目的 探討環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP，新型的核酸擴增技術）聯(lián)合結核分枝桿菌快速培養(yǎng)（BACTEC MGIT 960，結核分枝桿菌檢測儀）在痰涂片陰性肺結核中的診斷價值。 方法 收集疑似肺結核患者90例，隨機分成A、B、C組，A組通過指南推薦涂陰肺結核診斷，B組通過LAMP確診，C組通過LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960確診，并給予抗結核治療2個月后隨訪所有入組患者胸部CT變化情況，分別比較涂陰肺結核診斷方法，LAMP及LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960的診斷可靠性。 結果 涂陰肺結核指南推薦診斷陽性率40.0%，LAMP陽性率53.3%，聯(lián)合檢測陽性率60.0%，差異無統(tǒng)計學意義。聯(lián)合檢測敏感性88.9%，特異性91.7%均明顯升高。 結論 在實際臨床中，環(huán)介導等溫擴增技術聯(lián)合結核分枝桿菌快速培養(yǎng)（BACTEC MGIT 960）在痰涂片陰性肺結核診斷中特異性及敏感性高。

[關鍵詞] 環(huán)介導等溫擴增技術；BACTEC MGIT 960；涂陰肺結核；診斷

[中圖分類號] R446.5；R521 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）05-0019-04

目前每年結核病在全球的發(fā)病率仍以1%的速度增長，而結核分枝桿菌的耐藥性也在增加，中國作為結核病高發(fā)的國家，應該提升結核病診治技術，才可提升診治結核病的效率[1]。然而，在2010年期間，經(jīng)第五次全國結核病流行病學抽樣調查，結果表明2010年15歲以及以上人群中，發(fā)生活動性肺結核發(fā)病率達到459/10萬比例，而其中涂陽肺結核患病發(fā)病率也達到66/10萬比例[2]。盡管活動性肺結核及涂陽肺結核的患病率逐年下降，但是總體下降幅度不大，其中一部分原因是菌陰肺結核，Singh M等[3]研究結果表明涂陰肺結核的接觸者被感染的幾率在7.3%～21.0%，其傳染性低于痰培養(yǎng)陽性的肺結核。

盡管肺結核的診斷方法日益增多，針對涂陰肺結核的診斷標準也越來越多，但是仍缺少特異性、敏感性高的有效診斷方法。目前結核病診斷研究比較多的主要是LAMP[4]和BACTEC MGIT 960[5]。本研究主要通過比較涂陰肺結核指南組、LAMP組及LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960檢測組考慮肺結核患者抗結核治療2個月后，所有陽性及陰性疑似肺結核患者各30例隨訪胸部CT，觀察2個月后所有患者胸部CT病灶變化情況，評價環(huán)介導等溫擴增技術聯(lián)合結核分枝桿菌快速培養(yǎng)在涂陰肺結核中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料

2015年1～12月于嘉興市第一醫(yī)院收集符合標準的影像學疑似肺結核疾病患者，隨機從中抽取90例疑似肺結核疾病患者入組研究。臨床疑似肺結核疾病患者癥狀包含：出現(xiàn)慢性咳嗽、連續(xù)3周咳痰以及咳痰伴咯血癥狀，胸部CT檢查可見陰影。納入標準：（1）肺部CT或X線檢查疑似肺結核者；（2）3次痰涂片未見抗酸桿菌者；（3）肺部影像學異常且有結核臨床癥狀者；（4）既往無結核病史者；（5）年齡>16歲；（6）意識清醒者；（7）知情同意者。排除標準：（1）排除肺部疾病已診斷明確者；（2）排除存在影響凝血機制疾病者，如血友病、尿毒癥、重癥肝炎、血小板<50×109/L等；（3）排除1周內使用抗凝藥物者，如低分子肝素、華法令、阿司匹林、氯吡格雷等；（4）排除精神病及神智障礙患者；（5）年齡<16歲者；嚴重高血壓、3個月內心?；颊?、嚴重心肺功能不全者；（6）病情危重不能堅持試驗過程者。最終納入90例疑似肺結核患者。90例疑似肺結核患者隨機雙盲法分為A組、B組、C組，各30例。A組以指南推薦涂陰結核診斷標準診斷，B組通過LAMP診斷，C組通過LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960診斷疾病。A組患者男15例，女15例，年齡>16歲，平均年齡（38.0±5.2）歲；B組患者男14例，女16例，年齡>16歲，平均年齡（35.0±7.1）歲；C組患者男15例，女15例，年齡>16歲，平均年齡（36.0±6.3）歲；三組患者資料對比不存在統(tǒng)計差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷涂陰肺結核的標準[6] 臨床診斷中必須具備的診斷指標：（1）臨床診斷中，至少在3份痰標本的涂片鏡檢中，得出抗酸桿菌為陰性；（2）臨床經(jīng)胸部X線及胸部CT診斷，符合活動性肺結核病變；（3）在臨床中，排除患其他非結核性肺部疾?。唬?）經(jīng)病理檢查，證實肺部出現(xiàn)結核性改變；（5）應用支氣管肺泡灌洗液（BALF）檢驗，檢出支氣管以及肺部組織含有抗酸桿菌。臨床診斷中的輔助診斷指標：（1）對患者在臨床中進行結核菌素（PPD 5TU）皮膚試驗，結果為強陽性；（2）進行血清抗結核抗體檢驗，結果呈陽性；（3）應用PCR加探針檢測痰結核分枝桿菌，結果呈陽性；（4）對患者進行病理檢查，證實出現(xiàn)肺外組織結核病變。

1.2.2 LAMP 檢測肺結核疾病 制備DNA 模板：可以將獲取的患者痰標本處理液，轉移到1.5 mL EP管內。然后，設置12 000 r/min轉速高速離心5 min。之后去除上清液，洗滌2次得到的緩沖液，并加入適量的DNA提取液。最后，將液體混勻后，進行沸水浴10 min，再瞬時離心，將得到的上清液轉移到另外一只準備好的EP管中，作為檢驗模板。

進行LAMP檢測操作：可以根據(jù)相關文獻[7]中的方法，應用gyrB基因進行檢驗，可以選用gyrB內6個區(qū)段的4種引物作為本次檢驗肺結核疾病的LAMP引物，主要如下所示：

外引物為：F3：5'-ACCACGGAATACGACTTCGA-3'，B3：5'-AGTGAAAGGTGCGGCTCT-3'；內引物為： FIP：5'-GGTCACCCTCTCGTCGGTCAGCAAGAGATGGC-GTTCCTC-3'，BIP：5'-GAAGTGGTCAGCGACGTCGCTAACTTTGTGCGGTGCAGTG-3'。

而在具體進行實驗操作中，需要嚴格按照說明書進行檢驗。其實際反應體系內，可以將dNTP、（NH4）2SO4、MgSO4、KCl、Tris-HCl、甜菜堿、TritionX-100、FIP、BIP、F3以及聚合酶等放置到反應管內，并加水確?？傄后w為25 μL，在65℃環(huán)境內使其反應1 h。在反應結束之后，觀察反應管的顏色變化。若在實際中產(chǎn)生特異性片段，則擴增產(chǎn)物將會和染料結合，從而形成綠色熒光，反之，反應管顏色仍為橙色，并不會發(fā)生顏色變化。

1.2.3 BACTEC MGIT 960儀器 檢驗中應用BACTEC MGIT 960 全自動儀器（美國 BD 公司）。配套試劑：MGIT OADC營養(yǎng)添加劑、MGIT培養(yǎng)管、PANTA雜菌抑制劑。具體檢測方法：在無菌條件下，將MGITPANTA/OADC混合液（0.8 mL）加入MGIT培養(yǎng)管內備用。送檢標本進行常規(guī)去污染濃縮處理之后，將送檢標本接種到12B培養(yǎng)瓶與MGIT培養(yǎng)管中，并將MGIT培養(yǎng)管置入BACTEC MGIT 960儀器內培育。若有陽性標本，則儀器的紅色指示燈將會閃亮且伴有報警提示音。此時，可以按儀器的提示步驟，依次取出陽性標本。將陽性標本從培養(yǎng)管內取出，直接對陽性標本涂片進行抗酸染色，培養(yǎng)6周，以確定陽性標本是否是分枝桿菌。

1.2.4 診斷結果 針對最終的診斷結果，對肺結核患者治療2個月后，隨訪進行胸部CT，從而考慮明確給出診斷結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SSPS20.0統(tǒng)計學軟件計算，計數(shù)資料以率%表示，采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1不同方法臨床診斷結果比較

傳統(tǒng)涂陰肺結核診斷方法符合涂陰肺結核陽性率40.0%（12/30），1例經(jīng)BALF檢出抗酸分枝桿菌，1例肺穿刺病理符合，10例通過診斷標準符合涂陰肺結核診斷，12例患者均給予抗結核治療，所有患者2個月后隨訪胸部CT，胸部CT病灶吸收9例。LAMP檢測法檢測陽性率53.3%（16/30），最終胸部CT吸收13例。LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960檢測陽性率60.0%（18/30），最終胸部吸收16例。

2.2三種方法陽性率比較

見表1。LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960診斷涂陰肺結核檢測陽性率高于單獨LAMP檢測，高于涂陰肺結核診斷標準診斷的陽性率，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）?？紤]本研究收集病例數(shù)較少，因此差異無統(tǒng)計學意義，如果加大樣本量，統(tǒng)計學可能有差異。

2.3三種方法敏感性和特異性比較

見表2。LAMP聯(lián)合BACTEC MGIT 960診斷涂陰肺結核的敏感性和特異性均高于LAMP及涂陰肺結核診斷指南。聯(lián)合診斷減少了假陰性及假陽性的結果，有利于涂陰肺結核的診斷。

2.4 檢測及治療過程中不良反應

三種方法檢測過程中未見明顯不良反應，患者均能耐受。BACTEC MGIT 960在本研究未見污染標本出現(xiàn)?？菇Y核治療患者5例出現(xiàn)肝功能損失，3例出現(xiàn)消化道癥狀，但給予對癥處理后癥狀均好轉，其余患者均能耐受。

3討論

在我國臨床疾病檢測中，一直都將結核病列為重大傳染病檢測范圍，并且也充分認識到該病的危害，強化臨床疾病檢測工作，可早診斷、早治療呼吸道結核病。盡管近年來傳染性肺結核患病率下降明顯，但是涂陰肺結核發(fā)病率明顯升高。在Cowie等[8]研究中，針對隨機抽取的152例結核病患者研究發(fā)現(xiàn)，在患者肺尖部有活動性結核病變，對患者進行結核菌素試驗以及痰液涂片直接檢查，得出針對被觀察152例患者中，在未來的65個月內將會有88例患者發(fā)展成陽性肺結核。因此如何有效診斷涂陰肺結核將對結核病的防治起到關鍵的作用。

目前涂陰肺結核傳統(tǒng)診斷方法存在敏感性、特異性低的缺陷，改良羅氏培養(yǎng)方法更加可靠，但臨床檢測疾病的陽性率低[9-13]。而在許家璉等[14]研究中指出，改良羅氏培養(yǎng)方法在檢測涂陰肺結核中，其陽性檢出率是12.86%，且耗時長，往往需2個月之久。BACTEC MGIT 960 檢測系統(tǒng)能將報告時間縮短。也有相關報道中指出，在BACTEC MGIT 960 檢測中，可將非結核桿菌陽性檢出率的時間縮短到7 d以內，并且還可以使分離培養(yǎng)得出的陽性檢測結果比常規(guī)培養(yǎng)檢出率高出10%。彭亦平等[15]研究發(fā)現(xiàn)初治涂陰培陽率13.78%。而林健雄等[16]研究發(fā)現(xiàn)BACTEC MGIT 960檢測結核分枝桿菌痰標本陽性率54.02%，而本研究陽性率60.0%，考慮本研究通過嚴格的標準納入疑似涂陰肺結核患者，故陽性率有差異。

在1989年期間，Hanee首次報道指出，臨床中可以應用PCR檢測觀察結核分枝桿菌，從而Hanee開創(chuàng)應用分子生物學技術在臨床中診斷結核病的新起點，缺點是由于探針技術等操作程序比較復雜、費用較貴。近年來因環(huán)介導等溫擴增LAMP診斷技術的出現(xiàn)，給疑似疾病患者早期診斷帶來新的曙光。這是一種新的基因診斷技術，它具有簡單、快速、特異性強的特點。江勇等[17]報道LAMP法的靈敏度為92.9%，特異性為98.0%，陽性預測值為94.5%。劉毅等[18]報道LAMP敏感性92.16%，特異性87.14%。而本研究LAMP敏感性為81.3%，特異性為78.6%，考慮本研究主要檢測涂陰患者，故其敏感性等指標較江勇[17]及劉毅等[18]研究的指標低。

同時本研究聯(lián)合LAMP及BACTEC MGIT 960方法檢測，其陽性率、敏感性及特異性均高于傳統(tǒng)指南方法診斷及單獨LAMP檢測[19-21]。因此兩者聯(lián)合有利于涂陰肺結核的檢測，同時指導抗結核用藥，有利于治療和預防。兩種方法聯(lián)合檢測對結核病的診斷和防治有著極其重要的意義，值得臨床推廣。目前本研究的樣本例數(shù)較少，三組陽性率比較無統(tǒng)計學差異，有待加大樣本量，提高數(shù)據(jù)可靠性。

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（收稿日期：2016-12-17）