邱 華， 高月求， 毛德文， 周振華， 龍富立， 王明剛

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院， 上海 200000； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 南寧 530023)

HBV全基因組1.3倍體HepG2細(xì)胞模型的構(gòu)建與表達(dá)

邱 華1,2， 高月求1， 毛德文2， 周振華1， 龍富立2， 王明剛2

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院， 上海 200000； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 南寧 530023)

目的 構(gòu)建含HBV全基因組1.3倍體(1.3 ploid HBV, HBV 1.3P)的HepG2細(xì)胞模型，并觀察HBV生物標(biāo)志物的表達(dá)規(guī)律。方法 通過腺病毒將全基因組合成的1.3倍HBV序列轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，構(gòu)建HBV 1.3P-HepG2細(xì)胞模型，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定HBV 1.3P重組腺病毒質(zhì)粒，利用ABI 3730測序儀確定重組腺病毒質(zhì)粒中含有正確的1.3倍HBV序列，熒光顯微鏡下鑒定HBV 1.3P腺病毒感染HepG2細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)，qRT-PCR測定0～9 d HBV 1.3P-HepG2細(xì)胞模型中HBV DNA、cccDNA的表達(dá)水平，化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法分別檢測上清液及細(xì)胞內(nèi)HBsAg、HBeAg的表達(dá)量。計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。結(jié)果 當(dāng)MOI=40時(shí)，HepG2細(xì)胞被HBV 1.3P重組腺病毒感染的效率達(dá)到90%以上；在感染第2天即可分別在上清液和細(xì)胞內(nèi)中檢測出HBV DNA、ccc DNA、HBsAg及HBeAg等標(biāo)志物的表達(dá)，在4～6 d達(dá)到峰值水平，7 d之后逐漸下降。結(jié)論 所構(gòu)建的HBV全基因組1.3倍體HepG2細(xì)胞模型能穩(wěn)定表達(dá)HBV標(biāo)志物，為開展HBV的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

肝炎病毒， 乙型； 細(xì)胞模型； 腺病毒科

HBV是一種嗜肝性DNA病毒，具有嚴(yán)格的宿主和組織特異性，其感染的種屬范圍僅限于人和黑猩猩。因此，構(gòu)建體外細(xì)胞模型對研究HBV生物學(xué)特征、發(fā)病機(jī)制及藥物篩選等方面具有重要作用。傳統(tǒng)的HBV體外研究方法是通過轉(zhuǎn)染試劑(如脂質(zhì)體等)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBV的表達(dá)質(zhì)粒，但該方法存在轉(zhuǎn)染效率低和轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞毒性大的弊端。因此，尋找一種新的HBV在宿主中的表達(dá)方式變得尤為重要。HBV 1.3倍體(1.3 ploid HBV,HBV 1.3P)是在HBV 1.1倍體上游加入其自身啟動(dòng)子形成的，使其依賴自身啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，這樣可以充分反映病毒株的自身復(fù)制情況，便于研究HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的全過程。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用重組腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建HBV 1.3P-HepG2細(xì)胞模型，為開展HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)制及有效中藥篩選等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 包含HBV 1.3P的質(zhì)粒pMD18-T-HBV DNA 1.3P(上海諾百生物有限公司)，293A細(xì)胞(上海諾百生物有限公司)，HepG2細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TransGen Biotech)，腺病毒入門載體pENTR-IRES-GFP(Invitrogen)，腺病毒表達(dá)載體pAd-CMV-V5-DEST(Invitrogen)，腺病毒陰性對照Ad-GFP(上海諾百生物有限公司)，內(nèi)切酶PacⅠ(ER2201，F(xiàn)ermentas)，Taq DNA聚合酶(10966034，Invitrogen)，凝膠回收試劑盒(AP-GX_250，Axygen)，質(zhì)粒抽提試劑盒(AP-MN-P-250，Axygen)，SYBR Green PCR Master Mix(Q321，南京諾唯贊生物)，ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(C112-01/02，Vazyme)，GatewayTMLR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix(12535019，Invitrogen)，腺病毒純化試劑盒Biomiga ViraTrap Adenovirus Purification Miniprep Kit(V1160，Biomiga)，0.25% Trypsin(25200-072，Invitrogen)，胎牛血清(S1810-500，Biowest)，lipofectamine 2000(11668-019，Invitrogen)，MEM培養(yǎng)基(41500034，GIBCO)，Opti-MEM(31985，GIBCO)，DMEM培養(yǎng)基(SH30023.01B，HyClone)，Mouse Anti-HBsAg(H2F4)抗體(bsm-2024M，Gentaur)，Anti-Mouse IgG H&L (PE/Cy5.5?) preadsorbed(ab130784，Gentaur)，HBsAg、HBeAg化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，PCR引物合成和測序由金唯智生物科技有限公司完成。1.2 方法

1.2.1 HBV DNA 1.3P的擴(kuò)增 以pMD18-T-HBV DNA 1.3P質(zhì)粒為模板， 擴(kuò)增HBV DNA 1.3P序列并通過酶切位點(diǎn)SalⅠ/BglⅡ克隆到pENTR-IRES-GFP載體。根據(jù)無縫克隆引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HBV DNA 1.3P序列，其中上游引物(F)為: TTCTAGACTCAGATCTCTCGAGTTCAATCTAAGCAGGCT，下游引物(R)為：CCGCGGTACCGTCGACGCGGCCGCGATCTCG。擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer for KOD 5 μl、2 mmol/L dNTP 5 μl、25 mmol/L MgSO43 μl、引物F(10 mmol/L) 1.5 μl、引物R(10 mmol/L) 1.5 μl、模板1 ng、KOD 2.5 units，加ddH2O至50 μl；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min、94 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、68 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸10 min;PCR產(chǎn)物記為HBV DNA 1.3P(PCR)。

1.2.2 HBV DNA 1.3P PCR產(chǎn)物回收以及In-fusion連接 pENTR-IRES-GFP質(zhì)粒在37 ℃進(jìn)行雙酶切，酶切條件：pENTR-IRES-GFP 2 μg、 10×Buffer 5 μl、SalⅠ 2 μl、BglⅡ 2 μl，加ddH2O至50 μl。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，回收產(chǎn)物記為pENTR-IRES-GFP(SalⅠ/ BglⅡ)。pENTR-IRES-GFP(SalⅠ/ BglⅡ)和HBV DNA 1.3P(PCR)通過In-fusion連接，連接產(chǎn)物記為pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3P。連接體系：5×CE Ⅱ Buffer4 μl、pENTR-IRES-GFP(SalⅠ/ BglⅡ)50 ng、HBV DNA 1.3P(PCR)150 ng、Exnase?Ⅱ 2 μl，加入ddH2O至20 μl，混勻。連接條件：37 ℃反應(yīng)30 min后，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻。

1.2.3 pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3P重組質(zhì)粒鑒定 pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3P連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆經(jīng)PCR鑒定，選取HBV DNA 1.3P 166 bp的序列設(shè)計(jì)引物(F：CTCGTGGTGGACTTCTCTC；R： CAGCAGGATGAAGAGGAA)，PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer for KOD 5 μl、2 mmol/L dNTP 5 μl、25 mmol/L MgSO43 μl、引物F(10 mmol/L) 1.5 μl、引物R(10 mmol/L) 1.5 μl、模板1 ng、KOD 2.5 units，加ddH2O至50 μl，同時(shí)設(shè)置陰性對照(ddH2O作為模板)和陽性對照(pMD18-T-HBV DNA 1.3P質(zhì)粒作為模板)；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min、94 ℃變性15 s、58 ℃退火30 s、68 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸10 min。

1.2.4 質(zhì)粒提取 挑取陽性轉(zhuǎn)化子，接入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。37 ℃ 250 r/min震蕩培養(yǎng)過夜；離心獲得菌體后，利用質(zhì)粒抽提試劑盒抽取質(zhì)粒。

1.2.5 腺病毒表達(dá)載體pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP制備 pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3P質(zhì)粒和pAd-CMV-V5-DEST質(zhì)粒通過LR重組，獲得含有HBV DNA 1.3P的腺病毒表達(dá)載體pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR選取HBV DNA 1.3P 166 bp的序列設(shè)計(jì)引物(F：CTCGTGGTGGACTTCTCTC；R：CAGCAGGATGAAGAGGAA)。LR反應(yīng)體系：pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3P 100 ng、pAd-CMV-V5-DEST 100 ng、LR ClonaseTMⅡ enzyme mix 2 μl，加TE Buffer pH 8.0 至10 μl，混勻；LR反應(yīng)條件：25 ℃反應(yīng)1 h后，加入1 μl蛋白酶K，37 ℃反應(yīng)10 min，終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer for KOD 5 μl、2mmol/L dNTP 5 μl、25 mmol/L MgSO43 μl、引物F(10 mmol/L) 1.5 μl、引物R(10 mmol/L) 1.5 μl、模板 1 ng、KOD 2.5 units，同時(shí)設(shè)置陰性對照(ddH2O作為模板)和陽性對照(pMD18-T-HBV DNA 1.3P質(zhì)粒作為模板)；加ddH2O至50 μl；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min、94 ℃變性15 s、58 ℃退火30 s、68 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸10 min。

1.2.6 pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP腺病毒包裝 pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP質(zhì)粒用Pac Ⅰ酶切，酚氯仿抽提法純化獲得線性化的腺病毒質(zhì)粒，將其通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24～48 h后(根據(jù)熒光情況，細(xì)胞熒光率達(dá)到80%以上)，293A細(xì)胞用胰酶消化，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至直徑10 cm的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)至80%以上，收集培養(yǎng)基和293A細(xì)胞， -80 ℃條件下反復(fù)凍融3次后離心收集上清液，用0.45 μm濾膜過濾，獲得pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP腺病毒，用綠色熒光蛋白標(biāo)記法計(jì)算重組腺病毒滴度[1]。1.2.7 pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP感染HepG2細(xì)胞 HepG2細(xì)胞用MEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青霉素，1%鏈霉素，0.11 g/L丙酮酸鈉)培養(yǎng)，感染前更換為MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入病毒液，37 ℃培養(yǎng)4 h后再次更換為MEM完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)。HepG2 接種于96 孔板中，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，用Ad-GFP 病毒按照感染復(fù)數(shù)(multiplication of infection，MOI)=0、5、10、20、40 和80 感染后在37 ℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的感染情況，根據(jù)感染效率和細(xì)胞狀態(tài)確定最佳MOI。MOI值=感染時(shí)病毒與細(xì)胞的數(shù)量比值。1.2.8 qRT-PCR檢測HBV DNA、cccDNA的表達(dá)

pAd-CMV-HBV 1.3P-IRES-GFP腺病毒感染HepG2細(xì)胞后，分別于感染0、1、2、3、4、5、6、7、8和9 d時(shí)收集細(xì)胞，抽提總DNA，采用qRT-PCR檢測HBV DNA、cccDNA的表達(dá)水平，HBV DNA的檢測引物為F：CTCGTGGTGGACTTCTCTC，R： CAGCAGGATGAAGAGGAA，cccDNA的檢測引物為F：CTCCCCGTCTGTGCCTTCT，R：GCCCCAAAGCCACCCAAG；以18S rDNA為內(nèi)參，檢測引物為18S-F：GAATTGACGGAAGGGCACCAC，18S-R： AAGAACGGCCATGCACCACCA。實(shí)驗(yàn)組與對照組中基因的倍數(shù)關(guān)系通過公式R=2-ΔΔCt= 2-(△Ct待測樣品 -△Ct 對照樣品)= 2-[(MeanCt目- MeanCt內(nèi))待測樣品-(MeanCt目- MeanCt內(nèi))對照樣品]計(jì)算。反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、引物F(10 mmol/L)1 μl、引物R(10 mmol/L)1 μl、模板 1 μg、RNase-free H2O 5 μl；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，PCR數(shù)據(jù)采集。

1.2.9 化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg、HBeAg的表達(dá) pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP腺病毒感染HepG2細(xì)胞后培養(yǎng)，分別于感染0、1、2、3、4、5、6、7、8和9 d時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按HBsAg和HBeAg試劑盒檢測說明書檢測HBsAg和HBeAg水平。由于檢測時(shí)間跨度較大，為了減少因細(xì)胞數(shù)量對檢測的影響，實(shí)驗(yàn)按4×105個(gè)細(xì)胞量計(jì)算發(fā)光強(qiáng)度，具體方法為：根據(jù)HepG2細(xì)胞的倍增時(shí)間3 d，24板最多培養(yǎng)4×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)鋪板以及培養(yǎng)，收集上清時(shí)保證細(xì)胞數(shù)量約為4×105。

1.2.10 間接免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)HBsAg pAd-CMV-HBV 1.3P-IRES-GFP腺病毒感染HepG2細(xì)胞后，分別在 0、2、4、6 d消化細(xì)胞，將細(xì)胞爬片，爬片后的細(xì)胞用PBS洗滌3次， 4%多聚甲醛固定，PBS洗滌3次，0.25% TRITON X-100/PBS孵育5 min通透細(xì)胞，PBS洗滌2次； 10% BSA/PBS，37 ℃下孵育30 min，用3%BSA/PBS稀釋第一抗體，37 ℃下孵育2 h，PBS洗滌3次，3%BSA/PBS稀釋第二抗體，37 ℃下避光孵育45 min，PBS冼3次；熒光顯微鏡觀察并拍照，每張玻片拍攝5張(4個(gè)邊角及片中央)，將熒光顯微鏡拍下的照片用Image-Pro Plus軟件計(jì)算平均光密度，分析熒光的強(qiáng)弱。

較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV DNA 1.3P序列擴(kuò)增 HBV DNA 1.3P擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，在4100 bp處可見清晰的條帶，其大小與理論大小一致(圖1)。

圖1 HBV DNA 1.3P序列的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 1: Marker；

2.2 pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3P重組質(zhì)粒鑒定 pENTR-IRES-GFP(SalⅠ/BglⅡ)和HBV DNA 1.3P(PCR)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物大小約為160 bp(泳道2，5，6，7)，其大小與目標(biāo)序列大小一致并且和陽性對照處于相同的位置，陰性對照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)。

圖2 PCR鑒定pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3PM: Marker；1～7：pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3P相關(guān)轉(zhuǎn)

2.3 pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP腺病毒表達(dá)載體的鑒定 腺病毒入門載體pENTR-IRES-GFP-HBV DNA 1.3P和腺病毒表達(dá)載體pAd-CMV-V5-DEST載體LR重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物挑取克隆進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產(chǎn)物大小約為160 bp(泳道2，3，5，6，7)，其大小與目標(biāo)序列大小一致并且和陽性對照處于相同的位置，陰性對照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)；選取陽性克隆進(jìn)行測序，測序峰圖為單一峰(圖4)，測序結(jié)果與目的序列比對一致，即獲得構(gòu)建正確的pAd-CMV-HBV 1.3P-IRES-GFP腺病毒表達(dá)載體。

圖3 PCR鑒定pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP

M: Marker；1～7：pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP相關(guān)轉(zhuǎn)化子；NC:陰性對照；PC：陽性對照(PCR擴(kuò)增HBV DNA

1.3P)

圖4 pAd-CMV-HBV DNA 1.3P-IRES-GFP部分測序圖譜

2.4 腺病毒滴度及感染HepG2細(xì)胞的MOI測定 制備pAd-CMV-HBV 1.3P-IRES-GFP腺病毒表達(dá)質(zhì)粒，將質(zhì)粒用Pac Ⅰ 酶切進(jìn)行線性化，線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞以包裝腺病毒，收集病毒初液并進(jìn)行擴(kuò)增、純化和濃縮，測定病毒滴度為1.23×1012TU/ml。MOI=40時(shí)，HepG2細(xì)胞被腺病毒感染的效率達(dá)到90%以上，且細(xì)胞狀態(tài)良好，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求(圖5)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中腺病毒感染HepG2細(xì)胞以MOI=40進(jìn)行。

圖5 MOI=40時(shí)，腺病毒感染HepG2細(xì)胞的感染效率(×100) a:白光；b:綠色熒光；

c:混合光

2.5 HBV DNA 和cccDNA的表達(dá)水平 腺病毒感染前2天HBV DNA的表達(dá)水平相對較低，在3 d時(shí)HBV DNA的表達(dá)水平快速增高，在4～6 d時(shí)達(dá)到峰值，6 d后表達(dá)水平下降(圖6a)；cccDNA水平與HBV DNA表達(dá)趨勢基本一致，在3 d后快速增高，在4～6 d時(shí)達(dá)到峰值水平，6 d后逐漸下降(圖6b)。

圖6 HBV DNA和cccDNA不同時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量

2.6 HepG2細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg的表達(dá)水平 檢測4×105個(gè)HepG2細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度，HBsAg、HBeAg的表達(dá)水平在4 d和5 d時(shí)最高，隨后表達(dá)下降(圖7)。

圖7 HepG2細(xì)胞上清中HBsAg、HBeAg的表達(dá)量

2.7 免疫熒光法檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)HBsAg的表達(dá)水平 4、6 d時(shí)HepG2細(xì)胞內(nèi)HBsAg的表達(dá)水平高于2 d，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖8,表1)。

3 討論

HBV感染呈世界性流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭和肝癌等疾病。而良好的疾病模型是開展相關(guān)研究的基礎(chǔ)。人HBV感染的種屬范圍很窄，黑猩猩HBV感染模型是目前唯一的HBV自然感染的動(dòng)物模型，但價(jià)格昂貴，受到倫理學(xué)的限制[2]。樹鼩與靈長類動(dòng)物親緣關(guān)系很近，可被HBV感染，但感染率很低[3]。其他建立在嚙齒動(dòng)物上的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型、高壓水注射HBV感染小鼠模型、嵌合小鼠HBV感染模型等與人體感染的病理特征仍有較大區(qū)別，且重復(fù)性、穩(wěn)定性及經(jīng)濟(jì)性均尚待改進(jìn)[4]。因此，體外細(xì)胞模型成為研究HBV生命周期、病理機(jī)制及藥物篩選的重要手段，其中成熟的原代肝細(xì)胞、胚胎肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞是首選的靶細(xì)胞，主要采用感染與轉(zhuǎn)染兩種方式，各有優(yōu)缺點(diǎn)，需根據(jù)不同研究目的進(jìn)行選擇[5]。

圖8 免疫熒光檢測HBsAg在HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(100 μm)

檢測時(shí)間點(diǎn)(d)樣本數(shù)熒光強(qiáng)度032344±590 2314356±1327 4344524±26941)6343276±18151)F值422．32P值<0．05

注：與感染2 d比較，1)q值分別為29.37、28.15，P<0.01

永生性的肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7、HepaRG、PLC/PRF/5等是目前構(gòu)建HBV體外細(xì)胞模型應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞材料。通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將HBV基因組與宿主細(xì)胞染色體整合，科學(xué)家們已經(jīng)建立了HepG2.2.15、HepAD38等多種能穩(wěn)定表達(dá)HBV標(biāo)志物的細(xì)胞系。然而這些細(xì)胞株仍存在不足：(1)應(yīng)用了包含異源啟動(dòng)子的構(gòu)建物，如HepAD38采用了對四環(huán)素敏感的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，與自然感染條件下，HBV通過內(nèi)源啟動(dòng)子作用下轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的機(jī)制是不同的[6]；(2)由于是通過人為手段將HBV基因整合至宿主細(xì)胞染色體中，因此HBV表達(dá)與復(fù)制是宿主染色體復(fù)制的結(jié)果，且不易改變，與自然感染以cccDNA為模板的復(fù)制機(jī)制亦不相同[7]；(3)HBV復(fù)制水平較低，表達(dá)不穩(wěn)定，隨傳代次數(shù)增加，HBV基因產(chǎn)生異質(zhì)性幾率升高[8]。因此構(gòu)建一種高效、能以自身啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、以cccDNA為復(fù)制模板的HBV體外細(xì)胞模型仍然非常必要。

HBV基因組是閉合環(huán)狀雙鏈DNA，在利用酶切獲得線性HBV DNA 作為目的基因時(shí)，必然會(huì)破壞其開放閱讀框，從而影響其轉(zhuǎn)錄與復(fù)制功能。因此，需要通過構(gòu)建大于全長基因的HBV基因組，才能在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定復(fù)制。HBV 1.3P包含了5′末端Enh Ⅰ、Enh Ⅱ，復(fù)制起始區(qū)(DR1、DR2)，前基因組轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)X和前C區(qū)啟動(dòng)子，X開放閱讀框等構(gòu)件，能依賴自身啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，且復(fù)制和表達(dá)效率高于1.1和1.2倍體，逐漸成為HBV模型構(gòu)建的主要形式[9]。

病毒載體是近年發(fā)展最為迅速的一種基因?qū)爰夹g(shù)，主要包括慢病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)。其中腺病毒表達(dá)系統(tǒng)可將外源目的基因游離于宿主基因組外獨(dú)立表達(dá)，不整合入宿主細(xì)胞的基因組中，能實(shí)現(xiàn)目的基因瞬時(shí)、高豐度表達(dá)，并避免因基因整合作用而引發(fā)的潛在基因突變和隨機(jī)效應(yīng)，具有更高的安全性和可控性[10]。本課題組通過腺病毒表達(dá)系統(tǒng)將HBV 1.3P 轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，當(dāng)MOI=40時(shí)HepG2細(xì)胞被腺病毒感染的效率達(dá)到90%以上，且對細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能未造成明顯影響。該細(xì)胞模型在第2天即可在細(xì)胞內(nèi)和上清液中檢測到HBV DNA、cccDNA、HBsAg及HBeAg等標(biāo)志物表達(dá)，在4～6 d達(dá)到峰值水平，之后逐漸下降。由于腺病毒的表達(dá)高峰期一般在7 d左右，因此該模型尚存在HBV高峰復(fù)制時(shí)間較短等不足，未來有必要應(yīng)用慢病毒等技術(shù)，研究建立HBV長效表達(dá)的HBV 1.3P穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系模型?？傊摷?xì)胞模型為后續(xù)的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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引證本文：QIU H, GAO YQ, MAO DW, et al. Construction of HBV whole-genome 1.3 ploid HepG2 cell model and expression of HBV biomarkers[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(4): 668-673. (in Chinese) 邱華， 高月求， 毛德文， 等. HBV全基因組1.3倍體HepG2細(xì)胞模型的構(gòu)建與表達(dá)[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(4): 668-673.

(本文編輯：葛 俊)

Construction of HBV whole-genome 1.3 ploid HepG2 cell model and expression of HBV biomarkers

QIUHua,GAOYueqiu,MAODewen,etal.

(ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200000,China)

Objective To construct an HepG2 cell model containing HBV whole-genome 1.3 ploid (HBV 1.3P), and to investigate the expression of HBV biomarkers. Methods HepG2 cells were transfected with the 1.3-ploid whole-genome HBV DNA sequence using the adenovirus vector to construct an HBV 1.3P-HepG2 cell model. Agarose gel electrophoresis was used to identify HBV 1.3P recombinant adenovirus plasmids, and the ABI 3730 sequencer was used to confirm whether the recombinant adenovirus plasmids had correct HBV 1.3P sequence. The optimal multiplicity of infection (MOI) of HepG2 cells infected by the HBV 1.3P adenovirus was determined under a fluorescence microscope. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of HBV DNA and cccDNA in the HBV 1.3P-HepG2 cell model at 0-9 days, and chemiluminescence and immunofluorescence assay were used to measure the expression of HBsAg and HBeAg, respectively, in supernatant and cells. An analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the SNK-qtest was used for comparison between any two groups. Results When MOI was 40, the efficiency of HepG2 cells being infected by HBV 1.3P recombinant adenovirus reached above 90%. On the second day of infection, the expression of the biomarkers HBV DNA, cccDNA, HBsAg, and HBeAg was detected in supernatant and cells, and the levels of these biomarkers reached peak values at 4-6 days and gradually decreased after 7 days. Conclusion This HBV 1.3P-HepG2 cell model can express HBV biomarkers stably, which lays a foundation for future research on HBV.

hepatitis B virus; cell model; adenoviridae

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.04.014

2016-12-01；

2016-12-16。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81303066，81660827)；廣西自然科學(xué)基金青年基金(2013GXNSFBA019154)；廣西教育廳課題(2013YB121)

邱華(1980-)，男，博士，副教授，副主任，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治慢性病毒性肝炎的基礎(chǔ)與臨床研究。

高月求，電子信箱：gaoyueqiu@hotmail.com。

R512.62

A

1001-5256(2017)04-0668-06