張林，王磊，吳廣興，勇強(qiáng)，余世袁

(南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京210037)

β-葡萄糖苷酶合成龍膽二糖及產(chǎn)物分離

張林，王磊，吳廣興，勇強(qiáng)，余世袁*

(南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京210037)

以葡萄糖為原料，通過β-葡萄糖苷酶發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)制備龍膽二糖，研究不同來源的酶、反應(yīng)溫度、pH、加酶量、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間等對(duì)龍膽二糖的影響。結(jié)果表明：南京林業(yè)大學(xué)自產(chǎn)酶適合于龍膽二糖的制備，用900 g/L的葡萄糖溶液，加酶量為60 U/g葡萄糖，在pH 5、溫度60℃的條件下，以80 r/min振蕩轉(zhuǎn)化24 h后得到濃度為46.9 g/L龍膽二糖。得到產(chǎn)物后采用高效陰離子交換色譜進(jìn)行鑒定和定量。陽離子交換樹脂2次洗脫分離后，得到純度97.0%的龍膽二糖。用制備的龍膽低聚糖增殖青春雙歧桿菌，36 h代謝了含有碳元素74.9 mmol/L的碳源，生成含有碳元素62.1 mmol/L的有機(jī)酸和7.1 mmol/L的菌體，菌體濃度增長了3.8倍，表明實(shí)驗(yàn)得到的龍膽二糖可以有效增殖對(duì)人體有益的青春雙歧桿菌。

龍膽二糖；β-葡萄糖苷酶；陽離子交換樹脂；青春雙歧桿菌

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、科技進(jìn)步，食品添加劑中的糖也變得多樣化。人們對(duì)健康的關(guān)注度越來越高，更加注重食品的營養(yǎng)、口感及調(diào)節(jié)生理活性的結(jié)合。人體胃腸道里沒有能分解低聚糖的酶，所以低聚糖能到達(dá)消化系統(tǒng)的最末端，被雙歧桿菌利用[1]。雙歧桿菌是人類的生理性細(xì)菌，雙歧桿菌的存在和含量是人體健康的重要標(biāo)志，可以調(diào)理腸功能的紊亂，消除腹瀉與便秘；可起雙向調(diào)節(jié)功能，降低血內(nèi)毒素，降低膽固醇濃度，對(duì)防止動(dòng)脈硬化和高血壓、抗腫瘤、提供機(jī)體免疫功能和延年益壽具有一定作用。

低聚糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進(jìn)鈣磷吸收、預(yù)防齲齒、提高機(jī)體免疫力等功能，攝入后不會(huì)引起血糖、胰島素的升值，可供糖尿病、高血壓、肥胖等特殊人群食用[2]。龍膽低聚糖是一類由葡萄糖β-1，6糖苷鍵結(jié)合的新型功能性低聚糖，包括龍膽二糖、少量的三糖和四糖。與其他功能性低聚糖相比，它能更好地促進(jìn)人體小腸中雙歧菌和乳酸菌的繁殖，且耐熱、耐酸，可應(yīng)用于其他低聚糖不適宜使用的保健品中，其柔和、提神、苦味是龍膽低聚糖獨(dú)特的性質(zhì)[3-4]。雖然龍膽低聚糖有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但是目前只有日本進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，且主要在日本國內(nèi)銷售，其兩種產(chǎn)品規(guī)格分別為45%和80%[5]。我國也開始試產(chǎn)龍膽低聚糖，但產(chǎn)量較小，還沒有大規(guī)模的產(chǎn)品。目前，龍膽低聚糖市場(chǎng)價(jià)格約700元/kg，作為一種功能性食品添加劑新資源，龍膽低聚糖具有廣闊的市場(chǎng)前景。

β-葡萄糖苷酶能將纖維二糖或其他可溶性的纖維寡糖水解成葡萄糖分子，以消除纖維二糖和纖維寡糖對(duì)葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切酶的反饋抑制作用，在纖維素酶系中發(fā)揮非常重要的作用[6]。有些β-葡萄糖苷酶也有轉(zhuǎn)糖苷活性，能夠合成龍膽二糖[7]。使用高濃度的葡萄糖為底物，β-葡萄糖苷酶將游離的葡萄糖通過β-1，6糖苷鍵轉(zhuǎn)移到其他糖底物上合成龍膽二糖或三糖。轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的過程是溫和、安全、低成本并且低程度的污染，最終的產(chǎn)物易于從混合物中分離[8]。葡萄糖作為糖平臺(tái)化學(xué)最主要的產(chǎn)物，產(chǎn)量大，價(jià)格低廉。在當(dāng)今社會(huì)，可再生生物質(zhì)資源均可向糖平臺(tái)轉(zhuǎn)化，利用生物煉制技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)生物能源和生物基產(chǎn)品(生物燃料、生物基化學(xué)品和生物基材料)已成為國際上的研究熱點(diǎn)，一個(gè)全球性的產(chǎn)業(yè)革命正在朝著以碳水化合物為基礎(chǔ)的經(jīng)濟(jì)時(shí)代發(fā)展[9-11]。

本研究從不同公司生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶中選擇具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的酶催化劑，由不同濃度的葡萄糖底物、β-葡萄糖苷酶最適宜的反應(yīng)pH和溫度、酶添加量制備龍膽二糖，通過層析色譜手段對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離提純，并將得到的龍膽二糖用于青春雙歧桿菌厭氧增殖，以期為進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

β-葡萄糖苷酶共5種：Novozyme188購于Novozymes；購于Sigma公司的β-葡萄糖苷酶是提取苦杏仁得到的；黑曲霉來源的和提取苦杏仁冷凍干燥得到的購于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；南京林業(yè)大學(xué)自產(chǎn)酶(NFBGL02)是熱纖維素梭菌的β-葡萄糖苷酶基因重組于大腸桿菌制得。青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)CGMCC1.2190，嚴(yán)格厭氧菌株凍干粉，安培管保存，由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

葡萄糖(≥99.5%)和麥芽糖標(biāo)樣(≥99%)購于Sigma公司；異麥芽糖標(biāo)樣(≥98%)購于阿拉丁公司；龍膽二糖標(biāo)樣(≥98%)購于生工生物工程(上海)股份有限公司；纖維二糖標(biāo)樣(≥99%)購于Fluke公司。

1.2 龍膽二糖的酶法合成及分離

1.2.1 龍膽二糖的酶法合成

配制檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，溶解葡萄糖后放入高壓蒸汽滅菌器滅菌。滅菌結(jié)束，待溫度降至室溫時(shí)加入β-葡萄糖苷酶，反應(yīng)開始。轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度，水浴鍋振蕩幅度為80 r/min，按時(shí)取樣0.1 mL，用超純脫氣水稀釋樣品，離子交換色譜對(duì)龍膽二糖含量進(jìn)行定量測(cè)定。

1.2.2 層析色譜分離龍膽二糖

1.3 龍膽二糖增殖青春雙歧桿菌歷程

1.3.1 雙歧桿菌的活化與增殖

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中各組分的濃度：胰蛋白胨，1.0 g/L；酵母粉，1.0 g/L；CaCl2·6H2O，0.005 g/L；MgSO4·7H2O，0.005 g/L；KH2PO4，0.02 g/L；K2HPO4，0.02 g/L；NaHCO3，1.0 g/L，NaCl，0.05 g/L；膽汁鹽，0.25 g/L；L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.25 g/L；吐溫80，1 mL。

活化培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度5.0 g/L的葡萄糖。增殖培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入適量的龍膽二糖。以上培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌15 min后使用。

1.3.2 雙歧桿菌的活化

活化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱(英國Ruskinn公司)，厭氧箱內(nèi)開啟青春雙歧桿菌安培管，吸取培養(yǎng)基至安培管，洗滌干粉至錐形瓶中塞緊橡皮塞，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中的恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)36 h，獲得增殖培養(yǎng)用的雙歧桿菌種母液[12]。

1.3.3 雙歧桿菌的培養(yǎng)

龍膽二糖和氮源分別滅菌后轉(zhuǎn)入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，加入還原劑，在具塞螺紋試管中加入培養(yǎng)基，接入種母活化液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，定時(shí)取樣分析。

1.4 分析方法

1.4.1β-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定方法

β-葡萄糖苷酶酶活通常以4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(pNPG)為底物進(jìn)行測(cè)定，一個(gè)β-葡萄糖苷酶活力(U)單位定義為每分鐘水解生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量[13-14]。

1.4.2 龍膽二糖及副產(chǎn)物含量測(cè)定

離子交換色譜Dionex ICS-5000是美國賽默飛世爾科技公司 (Thermo Fisher Scientific)生產(chǎn)的，使用陰離子交換柱Dionex CarbopacTMPA10(2 mm×250 mm)檢測(cè)龍膽二糖，以脫氣水和200 mmol/L NaOH為淋洗液進(jìn)行二元梯度洗脫；流速0.25 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)方式四電位脈沖安培檢測(cè)。樣品經(jīng)過10 000 r/min離心10 min，取上清液用脫氣超純水稀釋，離子交換色譜分析，電導(dǎo)檢測(cè)池檢測(cè)。

1.4.3 菌體濃度的測(cè)定

采用比濁法測(cè)定，具體操作方法如下：繪制菌液吸光度A值與菌體濃度Yg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=0.553 0A-0.064 0，R2=0.993 5。

樣品測(cè)定：培養(yǎng)液離心，菌體經(jīng)生理鹽水洗滌3次后，無菌水再洗滌2次。將菌體濃度稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性范圍內(nèi)，搖勻后以無菌水為空白樣，用分光光度計(jì)在620 nm測(cè)吸光度A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算菌體濃度。

1.4.4 雙歧桿菌代謝產(chǎn)物分析

采用高效液相色譜法分析樣品中的乙酸、乳酸、丙酸、丁酸。調(diào)節(jié)pH，經(jīng)0.22 μm膜過濾后，取上清液進(jìn)行HPLC分析。色譜儀Agilent 1200；色譜工作站Chemstation；色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm)；洗脫液0.005 mol/L H2SO4；流速0.6 mL/min；柱溫50℃；檢測(cè)器示差檢測(cè)器；進(jìn)樣量12 μL。

1.4.5 碳平衡計(jì)算

在青春雙歧桿菌代謝龍膽二糖的實(shí)驗(yàn)中，采用分批培養(yǎng)，可將每一批次看作是1個(gè)黑箱，測(cè)定初始時(shí)進(jìn)入系統(tǒng)的碳含量及培養(yǎng)結(jié)束時(shí)回收的碳含量。實(shí)驗(yàn)中測(cè)定底物含碳量、菌體含碳量及代謝產(chǎn)物中的含碳量[15]。生物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)元素組成為CH1.8O0.5N0.2，其摩爾質(zhì)量為24.6 g無灰分生物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用CH1.8O0.5N0.2(分子量24.6)代表青春雙歧桿菌元素組成[16]。青春雙歧桿菌代謝產(chǎn)氣較少，可以忽略氣體中的碳含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍膽二糖的制備

目前對(duì)β-葡萄糖苷酶的研究大多集中于其水解活性，而有關(guān)β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性的報(bào)道很少，利用于低聚龍膽糖生產(chǎn)的更是微乎其微。如朱婧等[17]采用紫外-60Co復(fù)合誘變米曲霉獲得抗高濃度葡萄糖阻遏的β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌用于制備龍膽低聚糖。劉玲玲[3]采用基因工程菌發(fā)酵獲得的β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化葡萄糖，得到50.0 g/L的龍膽低聚糖，然而其使用的DTF-02陽離子樹脂分離，得到的最純濃度才73.0%。本研究采用不同的酶和葡萄糖為原料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)為龍膽二糖。前期研究轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)條件，以期得到較高產(chǎn)量的龍膽二糖，實(shí)驗(yàn)得出Novozyme188和NFGBL02具有較高的轉(zhuǎn)糖苷活性，優(yōu)化NFBGL02轉(zhuǎn)糖苷條件與Novozyme188的效果進(jìn)行比較。

2.1.1 不同來源β-葡萄糖苷酶的篩選

考察5種不同來源的β-葡萄糖苷酶對(duì)合成龍膽二糖的效果。以pH 5.0的緩沖液配制900 g/L葡萄糖溶液，按60 U/g葡萄糖添加β-葡萄糖苷酶，在60℃、80 r/min的恒溫振蕩器中反應(yīng)，反應(yīng)24 h，每3 h取樣分析，結(jié)果如表1所示。試驗(yàn)的5支酶，僅Novozyme188和NFBGL02具有良好的轉(zhuǎn)糖活性，能合成龍膽二糖。

表1 β-葡萄糖苷酶的來源及24 h時(shí)的龍膽二糖濃度

圖1 Novozyme188與NFBGL02產(chǎn)龍膽二糖比較Fig. 1 The comparison between Novozyme188 and the enzyme produced by Nanjing Forestry University (NFBGL02)

NFBGL02與Novozyme188合成龍膽二糖的試驗(yàn)結(jié)果比較見圖1。由圖1可見，NFBGL02與Novozyme188在前9 h合成龍膽二糖的速率均很快，而后速率放緩，NFBGL02在24 h可以達(dá)到峰值46.9 g/L，Novozyme188在24 h時(shí)達(dá)到最大值34.6 g/L。NFBGL02生產(chǎn)的龍膽二糖產(chǎn)量比Novozyme188多36.1%。龍膽二糖與異麥芽糖生成構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，Novozyme188在合成龍膽二糖的同時(shí)，生成的副產(chǎn)物異麥芽糖比目標(biāo)產(chǎn)物還多，異麥芽糖生成速率與龍膽二糖相一致，相對(duì)Novozyme188而言，異麥芽糖抑制龍膽二糖的作用強(qiáng)于NFBGL02。異麥芽糖同龍膽低聚糖一樣，也是功能性低聚糖，能夠促進(jìn)雙歧桿菌的增殖。如果從生產(chǎn)低聚糖的角度出發(fā)，Novozyme188能得到更多的雙歧因子。但如果以NFBGL02制備龍膽二糖，產(chǎn)物純度更高。

2.1.2 轉(zhuǎn)糖反應(yīng)緩沖液pH、溫度的確定

溫度和溶液的pH是轉(zhuǎn)糖反應(yīng)進(jìn)程的重要參數(shù)。在考察不同溫度對(duì)NFBGL02酶活的影響時(shí)，固定pH為4.8，得到酶活最大時(shí)的溫度；考察不同pH對(duì)酶活的影響時(shí)，固定最佳溫度?？疾霳FB-GL02隨溫度和pH的變化結(jié)果如圖2所示：60℃之前，酶活隨溫度增加而增加；β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為60℃，在50～70℃之間，β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活均在50%以上，說明酶活在此區(qū)間都是穩(wěn)定的。由圖2可知，β-葡萄糖苷酶酶活隨pH波動(dòng)較大，最適反應(yīng)pH為5.0，在pH在3.6～6.0之間，β-葡萄糖苷酶相對(duì)酶活均在50%以上。因此，轉(zhuǎn)糖反應(yīng)條件為：pH為5.0，溫度60℃。

圖2 NFBGL02在不同溫度、pH下的相對(duì)酶活Fig. 2 Relative enzyme activity of the produced enzyme under different temperature, pH

2.1.3 最佳加酶量的確定

圖3 加酶量對(duì)龍膽二糖合成的影響Fig. 3 Effects of enzyme dose on the synthesis of gentiobiose

選取NFBGL02不同加酶量，如20，40，60，80，100 U/g葡萄糖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)溫度60℃，底物濃度600 g/L，pH為5，轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)36 h。通過測(cè)定龍膽二糖的濃度，確定NFBGL02的加酶量對(duì)龍膽二糖含量的影響，結(jié)果如圖3所示。前12 h，隨著加酶量的增加，龍膽二糖濃度增加與加酶量有關(guān)。在反應(yīng)前期，龍膽二糖濃度較低，其反饋抑制作用不是很強(qiáng)，而反應(yīng)物濃度很高，龍膽二糖的生成速率與加酶量成正比，與米氏方程相符。而在22～36 h內(nèi)，龍膽二糖濃度生成速率變得平緩，24 h處為速率變化轉(zhuǎn)折點(diǎn)，而不同加酶量的樣本(40，60，80，100 U/g葡萄糖)最終生成的龍膽二糖濃度趨于一致。但40 U/g葡萄糖的時(shí)候較60，80，100 U/g葡萄糖的時(shí)候得到的龍膽二糖濃度偏低，而60 U/g葡萄糖能達(dá)到80 U/g和100 U/g葡萄糖的效果，且生成的龍膽二糖濃度穩(wěn)定。綜合考慮β-葡萄糖苷酶的成本和龍膽二糖的得率，葡萄糖轉(zhuǎn)糖反應(yīng)的加酶量選擇為60 U/g葡萄糖。

2.1.4 葡萄糖底物濃度對(duì)龍膽二糖合成的影響

為確定合適的葡萄糖底物濃度，對(duì)NFBGL02合成龍膽二糖反應(yīng)進(jìn)行考察。以不同濃度的葡萄糖溶液為原料，濃度由600 g/L，增加到1 000 g/L加酶量為60 U/g葡萄糖，60℃反應(yīng)，pH 5.0，80 r/min條件下反應(yīng)36 h，定時(shí)取樣，用離子交換色譜法測(cè)定龍膽二糖的含量，結(jié)果見圖4。葡萄糖底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)糖苷平衡有重要的影響，在一定溫度下，增加葡萄糖濃度，反應(yīng)平衡正向移動(dòng)，有利于龍膽二糖的生成。圖4表明：高濃度的葡萄糖溶液有利于龍膽二糖的生成；但生成的龍膽二糖濃度相對(duì)于葡萄糖并不是很高。因?yàn)辇埬懚亲鳛楫a(chǎn)物對(duì)反應(yīng)有著抑制作用，是導(dǎo)致葡萄糖利用率不高的主要原因。

圖4 葡萄糖濃度對(duì)龍膽二糖合成的影響Fig. 4 The effects of the glucose concentration on the synthesis of gentiobiose

圖5 龍膽二糖混合物經(jīng)離子交換樹脂洗脫圖譜Fig. 5 The ion exchange resin elution chromatography of the gentiobiose mixture

從整體來看，幾乎所有濃度的葡萄糖溶液在0～7 h都是隨時(shí)間的增加而增加的，并且增長的速率與時(shí)間類似于正比。從不同濃度的葡萄糖溶液比較來看，濃度增加確實(shí)會(huì)使產(chǎn)物增加，不同濃度的葡萄糖在相同時(shí)間得到的龍膽二糖濃度為900 g/L的最多，再者是800 g/L濃度的。但是濃度1 000 g/L的葡萄糖溶液得到的龍膽二糖濃度卻是最低的，糖濃度過高，黏度增大，酶與糖液并不能發(fā)生較好的有效碰撞，可能是產(chǎn)率較低的主要原因。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)龍膽二糖的影響

為確定比較合適的酶轉(zhuǎn)化時(shí)間，對(duì)NFBGL02合成龍膽二糖周期進(jìn)行考察。以濃度為900 g/L的葡萄糖為原料，加酶量60 U/g葡萄糖，60℃反應(yīng)，每隔12 h取樣，用離子交換色譜法測(cè)定龍膽二糖的含量。在反應(yīng)過程中，前24 h龍膽二糖的含量急劇上升，龍膽二糖濃度從0增加到46.6 g/L。隨后龍膽二糖的含量略微減少，但是自反應(yīng)48到72 h，龍膽二糖的含量又開始上升，增幅較小，龍膽二糖達(dá)到峰值49.7 g/L，葡萄糖利用率5.5%。之后龍膽二糖的含量在72到84 h內(nèi)大幅度降低，其原因可能是轉(zhuǎn)化反應(yīng)達(dá)到平衡后，β-葡萄糖苷酶又將龍膽二糖當(dāng)作底物水解了。所以反應(yīng)是反復(fù)進(jìn)行的，自84到108 h龍膽二糖的濃度又開始直線上升。雖然在72 h，龍膽二糖達(dá)到峰值，但在24 h時(shí)，龍膽二糖就能達(dá)到最大值的94.0%(46.9 g/L)，從時(shí)間和得率的角度，選擇24 h轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間，葡萄糖的利用率為5.2%。此結(jié)果明顯高于前人報(bào)道的利用纖維二糖為底物，A.niger來源的Family 3β-葡萄糖苷酶為轉(zhuǎn)糖苷酶，50 mmol/L的纖維二糖僅得到6.5 g/L的龍膽二糖[3]。

2.2 龍膽二糖粗產(chǎn)品的分離提純

龍膽二糖層析分離所進(jìn)樣中，龍膽二糖21.4 g/L，纖維二糖1.7 g/L和很少的異麥芽糖。圖5a為葡萄糖與龍膽二糖的混合液經(jīng)過第1次離子交換樹脂分離，能夠得到大部分組分為龍膽二糖的粗產(chǎn)品。收集第1次洗脫24.5～30.5 min的樣品，龍膽二糖的純度為50.9%，20.0～25.0 min出現(xiàn)的小峰可以推斷是緩沖鹽形成的，31.5～40.0 min洗脫的是葡萄糖與殘余的龍膽二糖。將第1次離子交換樹脂洗脫得到的龍膽二糖粗產(chǎn)品收集、濃縮，第2次洗脫得到圖5b，可以看出葡萄糖和龍膽二糖能夠?qū)崿F(xiàn)很好的分離，收集圖5b中第2次洗脫15.5～22.5 min的樣品，龍膽二糖在總混合物中的純度達(dá)到97.0%，在“M”峰底部能夠檢測(cè)到殘余的龍膽二糖。

2.3 龍膽二糖增殖青春雙歧桿菌

雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)重要的優(yōu)勢(shì)菌群，它能保護(hù)宿主免受致病菌侵害，提高免疫力及促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收，同時(shí)其代謝的有機(jī)酸還能抑制腸道內(nèi)有害菌、病原菌的生長[18]。以提純酶法制得的龍膽二糖為碳源，稀釋到5.0 g/L，在37℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。青春雙歧桿菌代謝龍膽二糖36 h后，龍膽二糖質(zhì)量濃度由5.0 g/L降低至3.7 g/L(圖6a)。前24 h龍膽二糖消耗速率達(dá)到0.05 g/(h·L)，24～36 h消耗速率為0.004 g/(h·L)。前12 h青春雙歧桿菌菌體迅速增殖，從0.06 g/L增殖到0.2 g/L，這與龍膽二糖在此期間迅速降低相對(duì)應(yīng)；而后在12～36 h期間勻速增殖，龍膽二糖濃度也相應(yīng)地勻速降低。培養(yǎng)期間，青春雙歧桿菌產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酸，導(dǎo)致pH從6.0降低到4.7，而pH的降低及菌體濃度的增長與龍膽二糖的降低有明顯的相關(guān)性。前12 h，龍膽二糖濃度與pH迅速降低，而菌體濃度迅速上升；12～36 h，龍膽二糖濃度和pH近似勻速緩慢減少，而菌體濃度近似勻速緩慢增加。

青春雙歧桿菌代謝龍膽二糖36 h后殘?zhí)菨舛葹?.7 g/L，而代謝相同濃度的葡萄糖36 h剩余葡萄糖1.8 g/L。由表2可知，龍膽二糖增殖青春雙歧桿菌36 h后獲得的菌體碳含量9.6 mmol/L，較0 h的菌體碳含量2.5 mmol/L增殖了3.8倍左右。而葡萄糖增殖青春雙歧桿菌36 h得到菌體含碳量13.3 mmol/L?？梢?，龍膽二糖確有增殖青春雙歧桿菌的能力，但較葡萄糖增殖效果偏差。葡萄糖雖然效果好，但其在到達(dá)腸道之前就已經(jīng)被人體吸收利用了。人體胃腸內(nèi)由于缺乏水解功能性低聚糖的酶系統(tǒng),因此不能直接利用功能性低聚糖,但其可以被腸道內(nèi)的有益菌群充分利用,功能性低聚糖是雙歧桿菌、乳酸菌、腸球菌等有益菌群最直接、最有效的養(yǎng)料,它能排除消化系干擾，促使雙歧桿菌等快速生長和大量繁殖[19]。

表2 青春雙歧桿菌代謝龍膽二糖碳元素分布

青春雙歧桿菌代謝龍膽二糖后，培養(yǎng)基pH降低，這是因?yàn)榍啻弘p歧桿菌產(chǎn)生代謝產(chǎn)物有機(jī)酸。由圖6b可知，從2 h就開始產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酸和少量的丁酸。0～36 h，乳酸和乙酸的質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化增加，而丙酸和丁酸的質(zhì)量濃度變化不大，青春雙歧桿菌產(chǎn)生的乙酸質(zhì)量濃度是乳酸的7.8倍，總酸濃度從1.01 g/L增加到2.03 g/L。

青春雙歧桿菌代謝龍膽二糖過程中，最大的碳損失為9.6%，因此可以認(rèn)為青春雙歧桿菌代謝過程碳元素是守恒的。碳源減少的碳元素都轉(zhuǎn)移到菌體和有機(jī)酸的碳含量中，青春雙歧桿菌36 h代謝了含有74.9 mmol/L碳元素的碳源，生成了含有碳元素62.1 mmol/L的有機(jī)酸和含有碳元素7.1 mmol/L的菌體。

3 結(jié) 論

1)通過對(duì)β-葡萄糖苷酶酶法合成龍膽二糖的研究，選擇5種不同酶中的南京林業(yè)大學(xué)自產(chǎn)酶(NFBGL02)來制備龍膽二糖，其最佳反應(yīng)條件：pH 5.0，溫度60℃，60 U/g葡萄糖的加酶量，900 g/L的葡萄糖溶液，反應(yīng)24 h，得到龍膽二糖46.9 g/L，葡萄糖的利用率為5.2%。

2)離子交換色譜分析結(jié)果表明反應(yīng)結(jié)束后混合物中主要成分為葡萄糖、龍膽二糖和少量的異麥芽糖。以鈣型陽離子交換樹脂為介質(zhì)，可以將龍膽二糖和葡萄糖有效分開，收集其中最好的分離組分龍膽二糖純度達(dá)到97.0%。

3)龍膽二糖能夠有效增殖青春雙歧桿菌，菌體濃度較開始時(shí)增長了3.8倍左右；代謝產(chǎn)物含有乳酸、乙酸、丙酸和少量的丁酸，乳酸和乙酸隨時(shí)間增加，丙酸和丁酸變化不大；36 h后，有機(jī)酸達(dá)到2.03 g/L。

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Synthesis of gentiobiose by β-glucosidase and separation of the product

ZHANG Lin, WANG Lei, WU Guangxing, YONG Qiang, YU Shiyuan*

(College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

Gentiobiose was prepared by glucose catalyzed byβ-glucosidase via transglycosylation. The effects of the source of theβ-glucosidase, reaction temperature, pH,β-glucosidase dose, substrate concentration and reaction time on the gentiobiose were analyzed. The enzyme produced by Nanjing Forestry University was selected for the synthesis of gentiobiose. It was found that optimal conditions for synthesis were as follows: glucose at a concentration of 900 g/L was added withβ-glucosidase at a dosage of 60 U/g glucose; the mixture was incubated at pH 5, temperature of 60℃ with a shaking speed of 80 r/min; after 24 h, 46.9 g/L of gentiobiose was obtained. Anion exchange chromatography was used to quantitatively detected gentiobiose. Separation and purification of the gentiobiose product was completed by ion chromatography. Cation exchange resin was used in 2-step separation. The results showed that the gentiobiose was well separated from glucose after 2 times elution, getting a purity of 97.0%. The prepared gentiobiose was used for the proliferation ofBifidobacteriumadolescentis. Sugar source containing 74.9 mmol/L of carbon was metabolized for 36 h, generating organic acids of 62.1 mmol/L carbon and bacterium biomass of 7.1 mmol/L carbon. The concentration of bacterium biomass increased by 3.8 times, indicating that the gentiobiose prepared in this study was an effective inducer forB.adolescentiswhich was beneficial to human health.

gentiobiose；β-glucosidase；cation exchange resin；Bifidobacteriumadolescentis

2016-08-08

2016-12-19

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD15B09)。

張林，男，研究方向?yàn)樯锘?。通信作者：余世袁，男，教授。E-mail:syu@njfu.edu.cn

Q533

A

2096-1359(2017)02-0076-07