鄧嘉雯，楊海艷△，史正軍*，鄧佳，楊靜，鄭志鋒，輝朝茂

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校生物質(zhì)化學(xué)煉制與合成重點實驗室；2.西南林業(yè)大學(xué)教育部省部共建西南山地森林資源保育與利用重點實驗室，昆明650224)

超聲-弱堿協(xié)同作用下巨龍竹木質(zhì)素的分離及表征

鄧嘉雯1，楊海艷1△，史正軍1*，鄧佳2，楊靜1，鄭志鋒1，輝朝茂2

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校生物質(zhì)化學(xué)煉制與合成重點實驗室；2.西南林業(yè)大學(xué)教育部省部共建西南山地森林資源保育與利用重點實驗室，昆明650224)

巨龍竹是一種具有極高研究和開發(fā)價值的大型經(jīng)濟用材竹種，其基礎(chǔ)理化性質(zhì)有待進(jìn)一步解析研究。為表征巨龍竹木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在超聲-弱堿協(xié)同作用下處理竹材原料，脫蠟竹粉在2%NaOH溶液中分別經(jīng)超聲處理5，20，40，60和90 min，并設(shè)置僅在2% NaOH溶液中抽提90 min的對照組，最后得到6個木質(zhì)素樣品L1～L6。采用紅外光譜(FTIR)、核磁共振碳譜(13C NMR)和二維核磁共振(2D HSQC)分別對分離得到的巨龍竹木質(zhì)素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明：超聲-弱堿協(xié)同處理對竹材木質(zhì)素具有良好的促溶效果，隨著超聲作用時間的增加，木質(zhì)素得率從6.6%提高到22.9%；巨龍竹木質(zhì)素大分子主要由愈創(chuàng)木基(G)、紫丁香基(S)和對羥基苯基(H)結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，屬于禾草類木質(zhì)素(GSH型)；巨龍竹木質(zhì)素大分子的主要聯(lián)接鍵為β-O-4′醚鍵，其次是β-β′和β-5′結(jié)構(gòu)；但隨著超聲處理時間的增加，巨龍竹木質(zhì)素中一定量的β-O-4′聯(lián)接鍵會被打斷。

巨龍竹；木質(zhì)素；超聲-弱堿協(xié)同作用；結(jié)構(gòu)表征

木質(zhì)素是竹材細(xì)胞壁主要組成物質(zhì)中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的組分，人們至今依然沒有完全掌握其內(nèi)在結(jié)構(gòu)規(guī)律。早在1952年，Leopold等[1]就發(fā)現(xiàn)竹子木質(zhì)素與木材不同， 它由紫丁香基(S)、愈創(chuàng)木基(G)和對羥基苯基(H)3種基本單元構(gòu)成。Lu等[2]用AcBr衍生、Zn粉還原使其β位醚鍵斷裂的方法(DFRC)證明了撐蒿竹(Bambusapervariabilis)木質(zhì)素中存在β-芳基醚和γ-對香豆酸酯構(gòu)型。Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)琴絲竹(Neosinocalamusaffinis)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中存在其他竹子木質(zhì)素鮮有的α-O-α′連接鍵(占6.1%)。Yang等[4]發(fā)現(xiàn)金竹(Phyllostachyssulphurea)離子液體可溶性木質(zhì)素大分子基本單元間化學(xué)連接鍵中β-O-4′、β-β′和β-5′聯(lián)接分別占43.2%，4.3%和5.1%。最近，Wen等[5]研究發(fā)現(xiàn)硬頭黃竹(Bambusarigida)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中，以β-O-4′連接的苯丙烷單元側(cè)鏈γ位碳比其他方式連接的γ位碳具有更多的對香豆酸和阿魏酸酯結(jié)構(gòu)。黃曹興等[6]發(fā)現(xiàn)竹黃在稀硫酸預(yù)處理過程中發(fā)生解聚反應(yīng)，木質(zhì)素側(cè)鏈區(qū)域螺旋二烯酮聯(lián)接鍵發(fā)生斷裂，同時，木質(zhì)素在稀硫酸預(yù)處理過程中的縮合反應(yīng)主要發(fā)生在愈創(chuàng)木基單元上。對比分析現(xiàn)有研究可發(fā)現(xiàn)，雖然人們對竹材木質(zhì)素化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但有關(guān)竹子木質(zhì)素中苯丙烷單元間碳-碳鍵和醚鍵連接方式、結(jié)合位置、結(jié)合強度等化學(xué)結(jié)構(gòu)特征還有待深入解析。

巨龍竹(Dendrocalamussinicus)因其具有稈型高大、單株產(chǎn)量高、生長速度快等優(yōu)良特性，而被視為是一種具有極高研究和開發(fā)價值的大型經(jīng)濟用材竹種。但由于其分布地經(jīng)濟文化相對落后，人們對其認(rèn)識較晚，目前對其基本理化性質(zhì)的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，其高值化開發(fā)利用缺乏可靠的科學(xué)理論指導(dǎo)，潛在的開發(fā)利用價值一直未能得以真正實現(xiàn)。鑒于此，筆者擬通過超聲波與化學(xué)處理相結(jié)合的方法分離巨龍竹木質(zhì)素，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，解析竹材木質(zhì)素化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，以期為巨龍竹資源的化學(xué)轉(zhuǎn)化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇3年生巨龍竹為原料，采自云南省普洱市孟連縣景信鄉(xiāng)。將采伐的竹子去除梢和側(cè)枝，并將竹稈按基部、中部、梢部進(jìn)行三等分，風(fēng)干后切成小塊，粉碎并篩選出粒徑0.25～0.42 mm(60～40目)的竹粉。粉碎后的竹粉經(jīng)體積比2∶1的甲苯-乙醇溶液在索氏抽提器中抽提10 h，去除抽提物，脫蠟竹粉在60℃條件下烘干，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

將60 g脫蠟的竹粉平均分成6份，每份10 g，在溫度為30℃、功率400 W、頻率35 Hz、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%、固液比1∶10(g/mL)的條件下，將前5份竹粉分別經(jīng)超聲結(jié)合堿處理(含2.0%NaOH)5，20，40，60和90 min，第6份竹粉作為對照，僅在2.0% NaOH堿溶液中抽提90 min。將每一步抽提出來的樣品分別進(jìn)行殘渣和濾液的分離，調(diào)節(jié)濾液pH至5.5，中和后的液體用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮到約30 mL，后緩慢倒入3倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇進(jìn)行沉淀，并用磁力攪拌器攪拌，靜置0.5 h后析出半纖維素沉淀。通過離心機將固液分離，去掉多糖組分，將濾液繼續(xù)減壓濃縮到15 mL并調(diào)pH至2.0，靜置后析出木質(zhì)素，經(jīng)離心分離和冷凍干燥分別得到竹材木質(zhì)素樣品L1～L6，備用。

1.3 木質(zhì)素分析與表征

1.3.1 紅外光譜分析

木質(zhì)素樣品的紅外光譜分析在Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀上進(jìn)行。采用KBr壓片法，樣品均勻分散于KBr中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。掃描波長范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)設(shè)為32次，分辨率1.928 cm-1，在透射模式下獲得紅外光譜數(shù)據(jù)。

1.3.2 核磁共振分析

核磁共振碳譜(13C NMR)和二維核磁共振(2D HSQC)均采用布魯克400 M超導(dǎo)核磁共振儀進(jìn)行測定。13C NMR以氘代 DMSO為溶劑，將80 mg木質(zhì)素溶于0.5 mL DMSO-d6中。采用30°脈沖序列，采樣時間1.36 s，弛豫時間1.89 s，累計掃描30 000次。2D HSQC分析時，把60 mg樣品溶于1 mL的 DMSO-d6中，采樣時間0.17 s，弛豫時間1.5 s，采樣128次，256增加量。

2 結(jié)果與分析

2.1 得率分析

本試驗在相同濃度的堿溶液、依次增加超聲時間條件下對脫蠟竹粉進(jìn)行抽提，并得到6個木質(zhì)素樣品。木質(zhì)素得率按照產(chǎn)物占總木質(zhì)素(酸溶木質(zhì)素和酸不溶木質(zhì)素)的百分比進(jìn)行計算。巨龍竹原料木質(zhì)素含量為26.12%，酸溶木素和酸不溶木素的含量分別參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10337—2008、GB/T 2677.8—1994 測量。超聲弱堿協(xié)同作用下抽提巨龍竹木質(zhì)素樣品的得率如表1所示。由表1可知，在超聲-弱堿協(xié)同作用5，20，40，60和90 min后，竹材木質(zhì)素樣品L1～L5的得率隨作用時間而逐步提高，而對照組L6在無超聲作用條件下抽提90 min，其得率僅為3.9%，表明超聲作用可顯著提升竹材木質(zhì)素的溶出效率。

表1 巨龍竹木質(zhì)素樣品的得率

2.2 紅外光譜分析

木質(zhì)素L1～L6紅外光譜結(jié)果如圖1所示，紅外光譜中各個信號峰參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行標(biāo)識[7-9]。從圖1可見，6個木質(zhì)素樣品的紅外光譜吸收峰都極為相似，只在吸收強度上略有不同。L6作為對照組沒有進(jìn)行超聲處理，但其與其他5個樣品在超聲-弱堿協(xié)同作用下抽提得到的竹材木質(zhì)素的紅外吸收峰并沒有太大差異，這也間接說明了超聲處理除對木質(zhì)素組分起促溶作用外，并未顯著改變木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2 木質(zhì)素L2、L5的13C NMR譜Fig. 2 13C NMR spectra of L2 and L5

圖1 巨龍竹木質(zhì)素組分的紅外光譜圖Fig. 1 FTIR spectra of lignin fractions isolated from Dendrocalamus sinicus

2.3 核磁共振碳譜分析

為了進(jìn)一步研究木質(zhì)素大分子的整體結(jié)構(gòu)信息，對巨龍竹木質(zhì)素樣品L2和L5進(jìn)行了核磁共振碳譜分析，測定結(jié)果如圖2。木質(zhì)素13C NMR圖中相關(guān)信號峰對照文獻(xiàn)進(jìn)行了相關(guān)歸屬[10-13]。從巨龍竹木質(zhì)素樣品L2和L5的核磁共振碳譜圖可看出，化學(xué)位移(δ)172.1處的信號峰是由脂肪酸中的—COOH形成的，可能源自提取過程中部分水解的乙?；?。δ104～168為木質(zhì)素特征峰區(qū)，δ168.1，159.7，144.1，130.1，125.2，115.8和115.5處分別代表對香豆酸酯(pCA)的 C-γ、C-4、C-α、C-2/C-6、C-1、C-β和C-β，從13C NMR圖譜中也能看出對香豆酸脂的信號峰很強，說明巨龍竹木質(zhì)素中對香豆酸酯的含量較高。木質(zhì)素L2和L5的13C NMR圖譜中均出現(xiàn)明顯的愈創(chuàng)木基單元(G)、紫丁香基單元(S)以及對羥基苯基單元(H)信號峰。其中，S型結(jié)構(gòu)單元對應(yīng)的信號峰有δ152.1 (C-3/C-5，醚化)，132.2 (C-1，非醚化)和104.2 (C-2/C-6，醚化)，G型結(jié)構(gòu)單元對應(yīng)的信號峰有δ149.1(C-3，醚化和非醚化),145.4 (C-4，非醚化的)和111.1 (C-2)，H型結(jié)構(gòu)單元C-2/C-6信號峰在δ128.3，C-3/C-5結(jié)構(gòu)的相關(guān)信號峰出現(xiàn)在δ114.7處，相對較弱的信號說明其在木質(zhì)素大分子中含量較低。上述信號進(jìn)一步證實了巨龍竹木質(zhì)素屬于GSH型木質(zhì)素。

在側(cè)鏈信號區(qū)，β-O-4′結(jié)構(gòu)信號位于δ72.2 (C-α)和δ60.0 (C-γ)；β-β′聯(lián)接結(jié)構(gòu)的信號位于δ71.3(C-γ)。而愈創(chuàng)木基(G)或紫丁香基(S)的甲氧基出現(xiàn)在δ56.0強信號處。此外，δ90～102處無無任何信號峰，表明該木質(zhì)素糖含量極少。

2.4 二維碳?xì)湎嚓P(guān)核磁共振譜圖分析

為了深入解析木質(zhì)素化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，在一維核磁基礎(chǔ)上，本研究利用二維核磁共振(HSQC)樣品進(jìn)行分析。需要說明的是，在一般情況下，木質(zhì)素樣品進(jìn)行核磁表征時，會將木質(zhì)素樣品進(jìn)行乙酰化處理，以提高木質(zhì)素在溶劑中的溶解度。但經(jīng)該預(yù)處理后，木質(zhì)素樣品中一些本身的?；Y(jié)構(gòu)會因乙?；幚矶谎谏w，從而導(dǎo)致天然木質(zhì)素的固有?；Y(jié)構(gòu)無法被檢測和區(qū)分出來。故本實驗對所得樣品并沒有進(jìn)行乙酰化處理，而是直接將其溶于氘代試劑進(jìn)行測試。巨龍竹木質(zhì)素樣品L2、L5的二維核磁共振(HSQC)圖譜如圖3。各相關(guān)信號峰的歸屬參照文獻(xiàn)[12-16]進(jìn)行，結(jié)果見表2。

圖3 L2、L5的HSQC譜圖Fig. 3 HSQC-NMR spectra of lignin sample L2 andL5

信號δC/δH歸屬Bβ536/303Cβ?Hβinβ?β′(resinol)substructures(B)MeO556/370C?HinmethoxylsAγ597/322Cγ?Hγinβ?O?4′substructures(A)Cγ622/367Cγ?Hγinphenylcoumaransubstructures(C)Bγ709/379Cγ?Hγinβ?β′resinolsubstructures(B)A′γ(A″γ)711/416Cγ?Hγinγ?acylatedβ?O?4′substructures(A′andA″)Aα716/485Cα?Hαinβ?O?4′substructureslinkedtoaSunit(A，A′)Aβ(G/H)836/424Cβ?Hβinβ?O?4′substructureslinkedtoaGunitandHunit(A)Bα849/464Cα?Hαinβ?β′(resinol)substructures(B)Aβ(S)859/409Cβ?Hβinβ?O?4′substructureslinkedtoaSunit(A)Cα868/549Cα?Hαinphenylcoumaransubstructures(C)S2，61038/668C2，6?H2，6inetherifiedsyringylunits(S)S′2，61066/718C2，6?H2，6inoxidized(CαO)phenolicsyringylunits(S′)G21109/700C2?H2inguaiacylunits(G)G51157/681C5?H5inguaiacylunits(G)pCAβ1154/628Cβ?Hβ，p?coumaroylatedsubstructures(pCA)G61191/672C6?H6，Gunits(G)FA61225/705C6?H6inFAH2，61277/716C2，6?H2，6inHunits(H)pCA2，61299/747C2，6?H2，6，p?coumaroylatedsubstructures(pCA)pCAα1440/746Cα?Hα，p?coumaroylatedsubstructures(pCA)

注：(A)β-O-4′醚鍵結(jié)構(gòu)，γ位為羥基；(A′)β-O-4′醚鍵結(jié)構(gòu)，γ位為乙?；?；(A″)β-O-4'醚鍵結(jié)構(gòu)，γ位為酯化對羥基苯甲酸酯；(B)樹脂醇結(jié)構(gòu)，由β-β′、α-O-γ′和γ-O-α′聯(lián)接而成；(C)苯基香豆?jié)M結(jié)構(gòu)，由β-5′和α-O-4′聯(lián)接而成；(G)愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)；(S)紫丁香基結(jié)構(gòu)；(S′)氧化紫丁香基結(jié)構(gòu)，α位為酮基；(H)對羥苯基結(jié)構(gòu)；(pCA)酯化的對香豆酸單元；(FA)阿魏酸酯結(jié)構(gòu)。下同。

木質(zhì)素基本單元之間聯(lián)接方式的重要特征信號主要集中在二維HSQC譜圖的側(cè)鏈區(qū)(化學(xué)位移δC/δH40～100/2.5～6.0)，其中，以β-O-4′芳基醚鍵結(jié)構(gòu)和甲氧基(δC/δH55.6/3.70)的信號最強。β-O-4′結(jié)構(gòu)(A、A′和A″)中α、γ位相關(guān)信號出現(xiàn)在化學(xué)位移δC/δH71.6/4.85和71.1/4.15，S型β-O-4′結(jié)構(gòu)β位信號在δC/δH85.9/4.09，G/H型β位的信號出現(xiàn)在δC/δH83.6/4.24，γ位信號出現(xiàn)在δC/δH59.7/3.2。β-β′結(jié)構(gòu)(樹脂醇B)的α位信號出現(xiàn)在化學(xué)位移δC/δH84.9/4.65，γ信號出現(xiàn)在δC/δH70.9/3.79，β位信號出現(xiàn)在δC/δH53.6/3.03。β-5′結(jié)構(gòu)(C，苯基香豆?jié)M)α、γ位的相關(guān)信號分別出現(xiàn)在δC/δH86.8/5.49和62.2/3.67。結(jié)合L2和L5的二維HSQC譜圖可知，巨龍竹木質(zhì)素β-O-4′和β-β′結(jié)構(gòu)的信號較強，而β-5′結(jié)構(gòu)信號較弱，說明巨龍竹木質(zhì)素中的主要聯(lián)接鍵為β-O-4′和β-β′結(jié)構(gòu)，另外還含有少量的β-5′結(jié)構(gòu)。

從二維HSQC圖譜中的芳環(huán)區(qū)(化學(xué)位移δC/δH100～160/6.0～8.5)可檢測到巨龍竹木質(zhì)素大分子基本機構(gòu)單元紫丁香基結(jié)構(gòu)(S)、愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)(G)、對羥基苯基結(jié)構(gòu)(H)的相關(guān)信號以及對香豆酸(pCA)和少量阿魏酸(FA)的信號。其中，紫丁香基(S)結(jié)構(gòu)單元C2,6-H2,6信號位于δC/δH103.8/6.68，α位氧化的紫丁香基結(jié)構(gòu)(S′)C2,6-H2,6信號位于δC/δH106.6/7.18；愈創(chuàng)木基(G)結(jié)構(gòu)單元的C2-H2、C5-H5、C6-H6信號分別位于δC/δH110.9/7.00、115.7/6.81、119.1/6.72；對羥基苯基(H)結(jié)構(gòu)單元的C2, 6-H2, 6信號位于δC/δH127.7/7.16。此外，酯化的對香豆酸酯信號在HSQC圖譜中也較明顯，其C2,6-H2,6信號位于129.9/7.47，側(cè)鏈Cα和Cβ的信號分別位于144.0/7.46、115.4/6.28。

由圖3比較可知，L2和 L5中各結(jié)構(gòu)單元的相關(guān)信號強弱程度基本一致，再次表明超聲處理不會明顯打斷巨龍竹木質(zhì)素大分子中的各種聯(lián)接鍵。

綜合紅外光譜和核磁共振譜圖綜合分析結(jié)果可以看出，巨龍竹木質(zhì)素屬于禾草類木質(zhì)素(GSH型)，其大分子中可能存在的基本結(jié)構(gòu)單元及主要聯(lián)接結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 巨龍竹木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元及主要聯(lián)接結(jié)構(gòu)Fig. 4 Main substructures presented in lignin fractions isolated from Dendrocalamus sinicus

3 結(jié) 論

1)弱堿條件下，超聲處理能有效促進(jìn)竹材木質(zhì)素溶出。在2.0% NaOH 水溶液中從竹材中提取木質(zhì)素，超聲協(xié)同處理5，20，40，60和90 min以及對照組僅抽提90 min時，竹材木質(zhì)素的溶出率分別為6.6%，14.9%，16.0%，20.7%，22.9%和3.9%，木質(zhì)素得率隨超聲處理時間延長而增加。

2)巨龍竹木質(zhì)素大分子主要由愈創(chuàng)木基(G)、紫丁香基(S)和對羥基苯基(H)結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，屬于典型的禾草類木質(zhì)素(GSH型)。

3)巨龍竹竹材木質(zhì)素大分子的主要聯(lián)接鍵為β-O-4′醚鍵，其次是β-β′和β-5′結(jié)構(gòu)，超聲處理對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)破壞較小，所得的木質(zhì)素樣品較完整的保存了竹材木質(zhì)素的天然結(jié)構(gòu)特征。

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Isolation and structural characterization of lignin isolated fromDendrocalamussinicusby ultrasonic-alkaline treatment

DENG Jiawen1, YANG Haiyan1△, SHI Zhengjun1*, DENG Jia2,YANG Jing1, ZHENG Zhifeng1, HUI Chaomao2

(1. University Key Laboratory of Biomass Chemical Refinery & Synthesis, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

In response to the severe challenges of resource scarcity and energy shortage, the preparation of biobased materials, energy and chemicals has attracted increasing attention. Fractionation of lignocelluloses based on the concept of biorefinery is of vital importance for their effective utilization.Dendrocalamussinicus, belonging to Bambusoideae of Gramineae, has strong and woody stems (maximum diameter of 30 cm, maximum height of 33 m). It is the largest bamboo species in the world and widely distribute in the southwest of China. According to whether the bottom ofD.sinicusbends or not, it can be divided into two subspecies, straight-barD.sinicusand askewD.sinicus. Due to its easy propagation, fast growth and high productivity, the bamboo species is considered as a potential renewable non-woody forestry feedstock for the production of biofuel and biomaterials. However, the detailed physicochemical properties of the largest bamboo species have not been clarified so far. In this study, five soluble lignin fractions (L1, L2, L3, L4and L5) were isolated under the ultrasonic-alkaline (2% NaOH) combined treatment for 20, 40, 60 and 90 min, respectively. In addition, another bamboo lignin fraction (L6) was isolated by 2% NaOH without ultrasonic treatment as control. Isolated lignin samples were characterized by FTIR,13C NMR and 2D HSQC NMR. The results showed that the ultrasonic-alkaline combined treatment could promote bamboo lignin dissolution. The obtained bamboo lignin belongs to GSH-type lignin, consisting syringl (S), guaiacyl (G) and p-hydroxylphengl (H) units. The major inter-unit linkages presented in the obtained bamboo lignin wereβ-O-4′ aryl ether linkages,β-β′, andβ-5′ linkages. With the increased of ultrasonic treatment time, the yield of lignin increased from 6.6% to 22.9%, and a certain amount ofβ-O-4′ linkages were degraded. The results of present study provided useful information for the selection and evaluation to superior germplasm resources.

Dendrocalamussinicus; lignin; ultrasonic-alkaline treatment; structural characterization

2016-06-15

2016-09-30

國家自然科學(xué)基金(31260165，31560195)；云南省科技計劃項目(2015FD023)。

鄧嘉雯，女，研究方向為竹類資源的開發(fā)利用。楊海艷為共同第一作者。通信作者：史正軍，男，博士，副教授。E-mail:shizhengjun1979@163.com

TQ35

A

2096-1359(2017)02-0064-06