張?zhí)K，李冀*，楊世林，李笑然，許瓊明

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

酸漿苦素抗日本血吸蟲(chóng)作用研究

張?zhí)K1，李冀1*，楊世林2，李笑然2，許瓊明2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

目的：考察酸漿苦素(Physalins)對(duì)日本血吸蟲(chóng)病的治療效果。方法：將ICR小鼠隨機(jī)分為11組，在感染后1天、14天、35天后采用灌胃法給予不同劑量(60，30，15 mg/kg)酸漿苦素治療，感染后第49天處死小鼠，觀察不同給藥組小鼠的總蟲(chóng)數(shù)、雌蟲(chóng)數(shù)、體質(zhì)量、脾指數(shù)及肝臟肉芽腫變化。結(jié)果：與對(duì)照組相比，在感染日本血吸蟲(chóng)1天給予低劑量酸漿苦素及35天給予高、中、低劑量酸漿苦素能明顯降低小鼠體內(nèi)總蟲(chóng)數(shù)及雌蟲(chóng)數(shù)(P<0.01)。在感染1天給予酸漿苦素治療能明顯增加小鼠體質(zhì)量，其中1天中劑量給藥組小鼠體質(zhì)量和脾指數(shù)明顯降低(P<0.01)。并且，在感染1天給予高、中、低劑量酸漿苦素治療及35天給予低劑量酸漿苦素能明顯降低小鼠肝臟中蟲(chóng)卵肉芽腫的直徑，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。結(jié)論：酸漿苦素對(duì)感染早期的日本血吸蟲(chóng)病有一定的治療效果。

酸漿苦素；日本血吸蟲(chóng)；總蟲(chóng)數(shù)；雌蟲(chóng)數(shù)；肉芽腫；殺蟲(chóng)效果

血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類健康、影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲(chóng)病，在全球76個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行[1]，它嚴(yán)重影響著人類的身體健康和國(guó)家、地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。血吸蟲(chóng)病目前仍然是困擾全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題，我國(guó)是日本血吸蟲(chóng)病流行的主要國(guó)家之一[2-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直在尋找一種能夠有效控制并消滅血吸蟲(chóng)的方法，目前而言，血吸蟲(chóng)病的治療藥物仍將會(huì)是控制血吸蟲(chóng)病的主要手段[4]。近年來(lái)，中草藥的抗血吸蟲(chóng)作用的研究在中國(guó)已取得一些進(jìn)展，在抗血吸蟲(chóng)病的工作中起到了一定的輔助作用。如紫草、金銀花、板藍(lán)根、防風(fēng)、五加皮、菊花、正柴胡飲等能明顯抑制血吸蟲(chóng)尾蚴鉆穿皮膚[5]，并且很多中草藥具有逆轉(zhuǎn)肝纖維化、緩解治療血吸蟲(chóng)病晚期肝硬化腹水等療效，如中藥軟肝散結(jié)湯治療血吸蟲(chóng)病肝纖維化患者，具有較好的阻止及逆轉(zhuǎn)肝纖維化和提高血漿白蛋白水平的作用[6]，溫陽(yáng)活血湯配合西藥治療治療晚期血吸蟲(chóng)病肝硬化患者也具有較好的療效[7]。

姑娘果(CalyxseuFructusPhysalis)，又叫錦燈籠，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為茄科多年生草本植物，野生于中國(guó)各地，尤為東北最多。據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》記載，其味酸、苦，性寒，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用，臨床可用于痰熱咳嗽、咽痛音啞、小便不利；外治天皰瘡、濕疹[8-9]。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道表明，錦燈籠中含有一系列酸漿苦素類化合物及其衍生物[10]，具有抗炎、抗癌和抑菌作用，但其抗日本血吸蟲(chóng)的作用尚未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)欲探究酸漿苦素的抗日本血吸蟲(chóng)活性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與釘螺

ICR小鼠，雌性，6～8 周齡，體質(zhì)量(25±5)g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于可控環(huán)境中，可自由獲取食物水。陽(yáng)性釘螺購(gòu)自江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

酸漿苦素粉劑，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院楊世林教授課題組提供。

1.3 儀器

電子天平FA2104S(上海精工產(chǎn)品)；數(shù)字式移液器槍(上海Finnpipette Thermo)；Olympus CX31顯微鏡(Olympus)；高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；YQ-DSX-280A型壓力蒸汽滅菌器(上海中安醫(yī)療器械廠)；超低溫冰箱(Sanyo產(chǎn)品)；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-927(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；解剖顯微鏡SZX12(Olympus)。

1.4 試劑

氯化鈉、二水合檸檬酸鈉、氫氧化鉀(KOH)、羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium,CMC)國(guó)藥分析純；0.9%氯化鈉注射液(0.9%NS)山東齊都藥業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 小鼠感染模型的建立及分組

采用腹部貼片法感染小鼠，每鼠(60±5)條日本血吸蟲(chóng)尾蚴，感染小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，每組10只，感染后第49天解剖。1D高中低劑量組分別于感染日本血吸蟲(chóng)后第1天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)5天；14D高中低劑量組分別于感染日本血吸蟲(chóng)后第14天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)5天；35 D高中低劑量組分別于感染日本血吸蟲(chóng)后第35天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg 灌胃，每日1次，連續(xù)5天[11]。

2.2 收集蟲(chóng)體，觀察殺蟲(chóng)效果

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均于感染后49天解剖小鼠，仔細(xì)檢查肝門(mén)靜脈和腸系膜靜脈，收集蟲(chóng)體計(jì)數(shù)，計(jì)算減蟲(chóng)率和減雌率[12-13]。

減蟲(chóng)率(%)=

減雌率(%)=

2.3 酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠體質(zhì)量和脾指數(shù)的影響

將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠于感染后49天(感染日本血吸蟲(chóng))稱取小鼠體質(zhì)量，剖殺小鼠，摘取脾臟，稱重，計(jì)算脾指數(shù)[14]。

2.4 酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝臟病理變化的影響

肝臟置于8%甲醛溶液內(nèi)固定，組織石蠟切片及蘇木素伊紅染色(hematoxylin and eosin staining，HE染色)操作觀察，測(cè)定小鼠肝臟中肉芽腫的平均直徑，隨機(jī)取3個(gè)肝臟切片，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照(×100倍)，通過(guò)圖像分析軟件(ImageJ-NIH，Bethesda)測(cè)量肉芽腫的平均直徑(μm)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 酸漿苦素對(duì)體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)的作用結(jié)果

感染日本血吸蟲(chóng)后1、14、35D給予60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg酸漿苦素，連續(xù)5天，灌胃治療。結(jié)果如下：感染血吸蟲(chóng)第1天，高中低劑量組減蟲(chóng)率分別為24.1%、26.5%、33.4%；減雌率分別為29.0%、27.9%、44.0%。感染血吸蟲(chóng)第14天高中低劑量組減蟲(chóng)率分別為27.8%、23.4%、25.1%；減雌率分別為23.3%、22.1%、20.3%。感染血吸蟲(chóng)第35天，高中低劑量組減蟲(chóng)率分別為37.8%、36.0%、36.6%；減雌率分別為48.7%、34.6%、34.6%(見(jiàn)表1)。在感染日本血吸蟲(chóng)第1天對(duì)低劑量酸漿苦素及第35天對(duì)高、中、低劑量酸漿苦素更為敏感，減蟲(chóng)率及減雌率均較第14天劑量組有所增加。體內(nèi)不同發(fā)育階段的日本血吸蟲(chóng)對(duì)酸漿苦素的敏感程度也具有一定差別，隨著發(fā)育進(jìn)程，不同劑量酸漿苦素治療組小鼠體內(nèi)總蟲(chóng)數(shù)及雌蟲(chóng)數(shù)如圖所示(見(jiàn)圖1、圖2)。感染血吸蟲(chóng)后，第1、14、35天給予酸漿苦素各劑量組其總蟲(chóng)數(shù)均有明顯差異(P<0.05)。感染血吸蟲(chóng)后，第1天和第35天給予酸漿苦素各劑量組其雌蟲(chóng)數(shù)均有明顯差異(P<0.05)。而感染第1天給予低劑量酸漿苦素以及感染35天給予高、中、低劑量酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲(chóng)總蟲(chóng)數(shù)及雌蟲(chóng)數(shù)的降低更為顯著(P<0.01)。

表1 不同濃度酸漿苦素對(duì)體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)的作用

圖1 不同劑量酸漿苦素對(duì)小鼠體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)作用后的作用效果 注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 不同劑量酸漿苦素對(duì)小鼠體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲(chóng)作用后的雌蟲(chóng)作用效果 注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2 酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠體質(zhì)量及脾指數(shù)的影響

肝脾腫大是日本血吸蟲(chóng)病的主要特征表現(xiàn)之一，偶見(jiàn)有脾臟寄生蟲(chóng)卵的報(bào)道，日本血吸蟲(chóng)可破壞脾臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞，前期研究發(fā)現(xiàn)酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲(chóng)造成的脾臟損傷有一定的治療效果，因此對(duì)其展開(kāi)研究。如圖3所示，與未給藥的對(duì)照組相比，在感染后第1天給予高、中、低劑量酸漿苦素(60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg)治療，小鼠體質(zhì)量均比對(duì)照組有很顯著升高(P<0.01)，感染第14天和第35天給予酸漿苦素各劑量組小鼠體質(zhì)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。與體質(zhì)量差異趨勢(shì)相似，感染后第1天給予高、中、低劑量酸漿苦素(60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg)治療，小鼠脾指數(shù)相較于對(duì)照組均有降低(P<0.05)，其中第1天的中劑量組有很顯著的差異(P<0.01)。感染后期其余組別小鼠脾指數(shù)比相較于對(duì)照組均無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在感染血吸蟲(chóng)1天后給予酸漿苦素對(duì)的小鼠體質(zhì)量和脾臟有一定的改善作用。

3.3 酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝臟病理變化的影響

感染日本血吸蟲(chóng)小鼠不同時(shí)期給予不同劑量酸漿苦素治療后于感染后第49天檢測(cè)的小鼠肝臟組織的病理學(xué)變化，如下圖5所示。正常小鼠肝小葉完整，肝細(xì)胞呈規(guī)則排列，可見(jiàn)中央靜脈及放射狀肝細(xì)胞索。未給藥組小鼠肝臟可見(jiàn)明顯的蟲(chóng)卵沉積，并有大量淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分蟲(chóng)卵聚集成簇，肝組織灶性壞死。感染第1天給予酸漿苦素低劑量組小鼠肝臟組織可見(jiàn)少量蟲(chóng)卵沉積，并且給予酸漿苦素治療后肝細(xì)胞呈規(guī)則排列形態(tài)接近于正常，出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。而感染第14天給藥組則出現(xiàn)嚴(yán)重的肉芽腫免疫反應(yīng)。感染第35天給予酸漿苦素治療后相比于未給藥對(duì)照組，蟲(chóng)卵較少并且僅匯管大量蟲(chóng)卵沉積，周?chē)写罅苛馨图?xì)胞浸潤(rùn)肉芽腫組織增生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸漿苦素對(duì)由日本血吸蟲(chóng)引起的早期和晚期肝臟病理變化有一定的改善。

由圖6可以看出，在第1天給予高、中、低劑量酸漿苦素及第35天給予低劑量組酸漿苦素，均能顯著的降低肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的平均直徑(P<0.01)。說(shuō)明酸漿苦素對(duì)抗血吸蟲(chóng)病的童蟲(chóng)期療效顯著，對(duì)于成蟲(chóng)期也有一定的療效。

圖5 酸漿苦素對(duì)感染日本血吸蟲(chóng)小鼠的肝臟肉芽腫形成影響(×100)(N: normal untreated group; NC: Negative control)

圖6 酸漿苦素對(duì)感染日本血吸蟲(chóng)小鼠的肝臟肉芽腫直徑的影響 注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)寄生于人體所引起的地方性疾病，主要流行于亞、非、拉美的73個(gè)國(guó)家，據(jù)記載，世界上共有76個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行這種寄生蟲(chóng)疾病，其中超過(guò)2億人已受感染，近8億人處在受感染的風(fēng)險(xiǎn)之中。經(jīng)過(guò)多年的積極防治，雖然我國(guó)血吸蟲(chóng)病防治工作已取得了一定的成績(jī)，但目前形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻。到了20世紀(jì)70年代中期，吡喹酮(praziquantel，PZQ)的問(wèn)世使血吸蟲(chóng)病化療達(dá)到了一個(gè)新的高度[15]。PZQ因其出色的療效和廣泛的適應(yīng)性在全球范圍內(nèi)成為抗血吸蟲(chóng)病藥物的首選(WHO，2002)[16]，具有適應(yīng)廣、療效高、毒性低、療程短、給藥方便等優(yōu)點(diǎn)。但隨著一種抗蠕蟲(chóng)藥物的過(guò)度使用，往往會(huì)使寄生蟲(chóng)產(chǎn)生一定的抗藥性[17]。在血吸蟲(chóng)重度流行區(qū)內(nèi)，PZQ的頻繁使用誘導(dǎo)血吸蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性的問(wèn)題已引起了國(guó)內(nèi)外眾多研究人員的關(guān)注，因此，尋找代替吡喹酮治療血吸蟲(chóng)病的備選藥物亟待解決。

酸漿苦素類化合物是酸漿屬植物的主要藥用成分，研究表明酸漿苦素類化合物有一定的抗炎作用，但其抗血吸蟲(chóng)作用尚未有研究[18]。在本研究中我們初步探討了酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)育不同時(shí)期的作用，觀察到酸漿苦素對(duì)小鼠體內(nèi)不同發(fā)育階段的日本血吸蟲(chóng)有一定程度的殺傷作用。酸漿苦素給藥后小鼠體內(nèi)血吸蟲(chóng)總蟲(chóng)數(shù)相較于未給藥對(duì)照組明顯減少，說(shuō)明其對(duì)各種發(fā)育階段的血吸蟲(chóng)均有一定的殺滅作用。其中以1D高中低劑量組給藥對(duì)于日本血吸蟲(chóng)的效果比較理想，由此可見(jiàn)，酸漿苦素對(duì)于日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)期比較敏感。35D高劑量組減雌率高于減蟲(chóng)率，說(shuō)明酸漿苦素對(duì)成蟲(chóng)期有一定效果。通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，酸漿苦素對(duì)肝臟的增殖性肉芽腫有一定的抑制作用，提示酸漿苦素可以拮抗日本血吸蟲(chóng)造成的肝臟損傷，但其確切殺蟲(chóng)和抗炎機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)期和成蟲(chóng)期具有一定的殺滅作用且對(duì)其產(chǎn)生的肝臟炎癥有一定的抑制作用。酸漿苦素有待成為治療日本血吸蟲(chóng)病的候選藥物，尤其是早期感染階段。

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Antischistosomal Activity of Physalins against Schistosomajaponicum

ZHANG Su1，LI Ji1，YANG Shi-lin2,LI Xiao-ran2,XU Qiong-ming2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.CollegeofPharmaceuticalSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,China)

Objective: To investigate the effect of Physalins on schistosomiasis. Methods ICR mice were randomly divided into eleven groups. We treated 1-day-old,14-day-old and 35-day-old Schistosoma japonicum infected mice with 60, 30, 15 mg/kg Physalins, respectively, with orally once a day for five consecutive days. The mice were sacrificed on the 49thday of post-infection. Observe the changes of the number of total worms, the number of female worms, body weight, spleen index and granuloma of different groups. Results:Administration of 15 mg/kg Physalins to the 1st day or administration of 60, 30 and 15 mg/kg Physalins to the 35th day post-infected mice could significantly reduce the total worms and female worms compared with those in the control group (P<0.01). Physalins for 1-day-old Schistosoma japonicam infected mice could significantly improve the body weight and reduce the spleen index (P<0.01). In addition, administration of 60, 30 and 15 mg/kg Physalins to the 1st day or administration of 15 mg/kg Physalins to the 35th day post-infected mice could significantly reduce the diameter of granuloma. Conclusion: Physalins has a therapeutic effect on early infectious schistosomiasis.

Physalins; Schistosoma japonicum; Total number of worms; Number of female worms; Granuloma; Schistosomicidal effect

2016-06-24

2016-11-09

張?zhí)K(1989-)，女，碩士研究生,主要研究方向：方劑配伍規(guī)律及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

*通訊作者：李冀(1960-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事方劑配伍規(guī)律及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0025-04