金弘,劉婷婷*,劉樹民,陳英華,孫曉偉,樸圣愛,祝鵬宇

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心，黑龍江 哈爾濱，150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱，150001)

電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊對CCI模型大鼠疼痛及脊髓組織GFAP表達(dá)的影響

金弘1,劉婷婷1*,劉樹民2,陳英華1,孫曉偉1,樸圣愛1,祝鵬宇3

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心，黑龍江 哈爾濱，150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱，150001)

目的：通過觀察電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊對CCI大鼠機(jī)械縮足反射閾值以及脊髓組織GFAP表達(dá)的影響，以期從抑制脊髓組織膠質(zhì)細(xì)胞活化角度揭示其作用機(jī)制。方法：將成年SD大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、電針組、中藥組和針?biāo)幗M，每組分為3 d，7 d和14 d三個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只大鼠。按照Bennett的方法建立CCI大鼠模型，電針組給予損傷側(cè)環(huán)跳、陽陵泉電針治療，每日1次，每次30 min。中藥組給予身痛逐瘀膠囊治療(1.64 g/kg)，灌胃給藥，給藥容積為15 mL/kg，每日1次。針?biāo)幗M給予電針和中藥聯(lián)合治療，方法及療程同上。假手術(shù)組和模型組給予等容積生理鹽水灌胃。采用機(jī)械縮足反射閾值進(jìn)行大鼠行為學(xué)檢測；采用RT-PCR法檢測CCI模型大鼠脊髓組織GFAP mRNA的表達(dá)。結(jié)果：MWT檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠MWT從術(shù)后3天即顯著降低，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比具有顯著差異(P<0.05)；電針組、中藥組、針?biāo)幗MCCI大鼠MWT有所上升，各時(shí)間點(diǎn)與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針?biāo)幗M大鼠MWT顯著上升，與電針組、中藥組相比，療效更加顯著(P<0.05)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織中GFAP mRNA的相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)。治療后電針組、中藥組、針?biāo)幗M脊髓組織中GFAP mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，與模型組相比差異顯著(P<0.05)。治療后針?biāo)幗MGFAP mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，與電針組、中藥組比較差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，電針組、中藥組、針?biāo)幗M均能抑制CCI模型大鼠脊髓組織GFAP mRNA的表達(dá)，尤以針?biāo)幗M療效更佳。結(jié)論：電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊能夠顯著改善CCI模型大鼠機(jī)械縮足反射閾值，其作用機(jī)制可能與其抑制脊髓組織中GFAP mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

神經(jīng)病理性疼痛；電針；身痛逐瘀膠囊；GFAP

神經(jīng)病理性疼痛由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床仍缺乏行之有效的治療方法[1]。既往研究認(rèn)為[2]，膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中僅具有對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行支持和保護(hù)的作用，其并不參與以神經(jīng)元之間信號傳遞為主要方式的痛覺傳導(dǎo)。然而，近年來有研究發(fā)現(xiàn)[3]，膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，因此，越來越多的研究開始關(guān)注神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制中膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用。有學(xué)者認(rèn)為，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中以星形膠質(zhì)細(xì)胞為代表的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行深入研究，有望為神經(jīng)病理性疼痛的治療揭開新的篇章。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)特有的中間絲蛋白，其表達(dá)量會隨著機(jī)體受到刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化而增加[4]。因此，GFAP的表達(dá)量顯著增加被認(rèn)為是神經(jīng)病理性疼痛病理機(jī)制中星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活最特異的標(biāo)志。

針灸和中藥治療以坐骨神經(jīng)痛為代表的神經(jīng)病理性疼痛取得滿意療效，其具有療效顯著且副作用小等優(yōu)點(diǎn)，逐漸得到廣泛認(rèn)可[5-7]。自2014年至今研究采用電針聯(lián)合身痛逐瘀湯治療坐骨神經(jīng)痛患者，臨床療效確切，然而其作用機(jī)制尚不明確。其抑制疼痛作用是否與影響膠質(zhì)細(xì)胞活化具有相關(guān)性目前尚無報(bào)道。據(jù)此，本課題組采用CCI模型大鼠為研究對象，觀察電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊對膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，以期從分子生物學(xué)角度揭示其治療神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選用清潔級健康成年雄性SD大鼠150只，體質(zhì)量(250±30)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供(動物合格證號SCXK(黑)2008004 )。動物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為5組，即假手術(shù)組、模型組、電針組、中藥組、針?biāo)幗M，每組各30只。每組又分為3 d，7 d，14 d三個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只大鼠。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

Von Frey Hairs(Stoeling，美國)；高速離心機(jī)(CS-15R，美國Beckman)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche 480 Ⅱ，羅氏)；華佗針灸針(蘇州醫(yī)療設(shè)備廠，中國)；電針儀(KWD-801，中國英迪)。Realtime PCR試劑盒(Takara，日本)；身痛逐瘀膠囊(規(guī)格：0.35 g/粒，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，批號:20110513)。

1.3 動物模型制備

按照Bennett的方法[8]建立CCI模型，大鼠稱體質(zhì)量后，腹腔注射水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉，俯臥，用橡皮筋固定四肢于自制的鼠板上，用彎剪刀將左側(cè)后肢大腿部剃毛后用碘伏消毒，在大鼠左側(cè)股骨中上1/3處行縱形切口，鈍性分離局部肌肉，暴露并分離坐骨神經(jīng)主干，選擇4-0號鉻制羊腸線在在坐骨神經(jīng)主干部位結(jié)扎4道，兩道之間間隔約1.0 mm，然后逐層縫合皮膚肌肉。假手術(shù)組大鼠暴露坐骨神經(jīng)主干后，不進(jìn)行結(jié)扎，逐層縫合皮膚肌肉。

1.4 治療方法

假手術(shù)組：術(shù)后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，其余未經(jīng)任何治療。

模型組：術(shù)后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，其余未經(jīng)任何治療。

電針組：選穴：環(huán)跳、陽陵泉(損傷側(cè))。操作：依據(jù)大鼠穴位圖譜確定環(huán)跳穴及陽陵泉穴定位，針具和穴位局部皮膚常規(guī)消毒后，選用華佗牌一次性針灸針(0.25 mm×25 mm)，快速進(jìn)針，同側(cè)環(huán)跳和陽陵泉穴接電針儀，上正下負(fù)，選擇疏密波[9]，頻率和電流為，以局部肌肉輕微顫動為度，每日1次，每次留針30 min。

中藥組[10]：取身痛逐瘀膠囊囊心藥粉1．64 g加生理鹽水溶解為100 mL，制成身痛逐瘀膠囊混懸液，灌胃給藥，給藥容積為15 mL/kg，每日1次，連續(xù)治療相應(yīng)療程。

針?biāo)幗M：給予電針和中藥聯(lián)合治療，方法及療程同上。

保證動物飼養(yǎng)室溫度為21～24℃，室內(nèi)濕度50%～70%，12 h交替照明，自由進(jìn)食和飲水。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只大鼠。各組分別于術(shù)后3 d，7 d，14 d進(jìn)行行為學(xué)檢測及取材。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 機(jī)械縮足反射閾值(Mechanical Withdrawal Threshold,MWT)的測定

用透明有機(jī)玻璃自制玻璃箱(22×12×22 cm3)，底部置一孔徑為0.5×0.5 cm2的鐵絲網(wǎng)，將大鼠置于透明的玻璃箱中，適應(yīng)15 min。實(shí)驗(yàn)前使之適應(yīng)15 min。然后從2.0 g開始分別以不同折力的von Frey細(xì)絲刺激大鼠的足底，運(yùn)用up and down法推測大鼠縮足反射閾值，然后在閾值上下分別刺激大鼠5次，用內(nèi)推法算出每只大鼠引起5次試驗(yàn)中2.5次反應(yīng)的值作為50%反應(yīng)閾值。每次刺激后間隔15 s，待大鼠行為反應(yīng)完全消失后再進(jìn)行下一次刺激[11]。

1.5.2 動物取材及檢測

各組大鼠分別在術(shù)后3 d、7 d和14 d行為學(xué)檢測后，用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 mg/kg)，迅速開胸，暴露心臟，將注射器針頭快速插入左心室，固定針頭后緩慢注入生理鹽水，直至清澈透亮的液體自右心耳流出，接著用注射器緩慢注入4%多聚甲醛溶液，直至大鼠出現(xiàn)四肢抽搐，皮膚、肺臟、肝臟及眼瞼變白等表現(xiàn)，迅速斷頭，取出大鼠腰膨大部位的脊髓(相當(dāng)于L4-L6脊髓)，長度大約1 cm，迅速置于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆?，每組取材6只。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR儀擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 40 s，46℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式2-ΔΔCt方法計(jì)算GFAP mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 機(jī)械縮足反射閾值檢測結(jié)果

結(jié)果表明，模型組大鼠MWT從術(shù)后3 d即顯著降低，術(shù)后7 d達(dá)到最低值，術(shù)后14 d有所升高，但仍顯著低于術(shù)前，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比具有顯著差異(P<0.05)；電針組、中藥組、針?biāo)幗MCCI大鼠機(jī)械縮足反射閾值有所上升，各時(shí)間點(diǎn)與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針?biāo)幗M大鼠機(jī)械縮足反射閾值顯著上升，與電針組、中藥組相比，療效更加顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組CCI大鼠機(jī)械縮足反射閾值檢測結(jié)果±s，n=6)

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與針刺組比較，▽P<0.05;與中藥組比較，#P<0.05

2.2 各組大鼠脊髓組織GFAP mRNA的表達(dá)

結(jié)果顯示，模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織中GFAP mRNA的相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)。治療后電針組、中藥組、針?biāo)幗M脊髓組織中GFAP mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，與模型組相比差異顯著(P<0.05)。治療后針?biāo)幗MGFAP mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，與電針組、中藥組比較差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，電針組、中藥組、針?biāo)幗M均能抑制CCI模型大鼠脊髓組織GFAP mRNA的表達(dá)，尤以針?biāo)幗M療效更佳。見表2。

表2 各組CCI大鼠脊髓組織GFAP mRNA的相對表達(dá)量

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與針刺組比較，▽P<0.05;與中藥組比較，#P<0.05

3 討論

CCI模型大鼠能夠較好的模擬臨床發(fā)病率較高的坐骨神經(jīng)痛，該病屬于祖國醫(yī)學(xué)“痹癥”和“腰腿痛”的范疇[12]，經(jīng)數(shù)據(jù)挖掘和文獻(xiàn)整理發(fā)現(xiàn)，針灸治療該病取穴較多的為環(huán)跳穴和陽陵泉穴，筆者在臨床運(yùn)用環(huán)跳和陽陵泉電針治療坐骨神經(jīng)痛取得較好療效?，F(xiàn)代研究表明，電刺激具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，其中，低頻率的電刺激能夠引起腦垂體釋放β內(nèi)啡肽和腦啡肽增多，兩者可以分別作用于μ和δ受體而起到鎮(zhèn)痛作用，但作用較為緩慢持久；而高頻率的電刺激能夠引起脊髓釋放強(qiáng)啡肽增多，從而作用于κ受體，產(chǎn)生即時(shí)的鎮(zhèn)痛作用[13]，因此本研究選擇疏密波治療，以最大程度的改善患者疼痛癥狀。既往研究也發(fā)現(xiàn)[9]，電針疏密波能夠顯著上調(diào)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠足踝關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)，達(dá)到減輕局部炎癥反應(yīng)、緩解疼痛的作用，療效優(yōu)于疏波和密波。身痛逐瘀膠囊是清代名醫(yī)王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中所載的身痛逐瘀湯制成的成方制劑，方中川芎、桃仁、當(dāng)歸和紅花具有活血化瘀之功效；地龍、牛膝、秦艽、羌活和五靈脂具有活血化瘀并能強(qiáng)筋止痛的作用；香附具有調(diào)經(jīng)活血、理氣疏肝之效；沒藥能夠消腫生肌并活血止痛；甘草調(diào)和諸藥，并能清熱解毒、祛痰止痛。諸藥合用，共奏活血化瘀、通絡(luò)止痛之功效[14]。現(xiàn)代研究表明，身痛逐瘀湯能夠顯著下調(diào)冰醋酸和福爾馬林誘導(dǎo)的疼痛小鼠血清中MDA、NO以及PGE2的水平，上調(diào)SOD的水平，從而發(fā)揮中樞和外周鎮(zhèn)痛作用[10]。

正常情況下，GFAP作為一種中間絲蛋白，僅存在與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中。其陽性表達(dá)量會隨著機(jī)體受到刺激后，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活而增多。Garrison等[15]在1991年即通過研究發(fā)現(xiàn)大鼠坐骨神經(jīng)損傷側(cè)脊髓組織中GFAP陽性表達(dá)較對側(cè)顯著增加，并且其表達(dá)量也與大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎疼痛模型的痛覺過敏程度呈正比。這一結(jié)果提示了GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活可能參與了神經(jīng)病理性疼痛的病理過程。此后，越來越多的研究關(guān)注星形膠質(zhì)細(xì)胞活化在神經(jīng)病理性疼痛模型中的重要作用[16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[17]，神經(jīng)病理性疼痛模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，分泌大量GFAP蛋白，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生相應(yīng)變化，常見的包括細(xì)胞變大，突起變長等。因此，GFAP目前已經(jīng)作為公認(rèn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記性蛋白。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織中GFAP mRNA的相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)，說明CCI后機(jī)體星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，從而使GFAP的陽性表達(dá)量增多。治療后電針組、中藥組、針?biāo)幗M脊髓組織中GFAP mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，與模型組相比差異顯著(P<0.05)。治療后針?biāo)幗MGFAP mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，與電針組、中藥組比較差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，電針組、中藥組、針?biāo)幗M均能抑制CCI模型大鼠脊髓組織GFAP mRNA的表達(dá)，尤以針?biāo)幗M療效更佳。

綜上所述，電針聯(lián)合身痛逐瘀膠囊能夠顯著改善CCI模型大鼠機(jī)械縮足反射閾值，其作用機(jī)制可能與其抑制脊髓組織中GFAP mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

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Effect of Electroacupuncture Combined with Shentong Zhuyu Capsuleon Pain and Expression of GFAP in CCI Model Rats

JIN Hong1,LIU Ting-ting1,LIU Shu-min2,CHEN Ying-hua1,SUN Xiao-wei1,

PIAO Sheng-ai1,ZHU Peng-yu3

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China；2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,ChineseAcademyofMedicalSciences,Harbin150040,China；3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective: To observe the effect of electroacupuncture combined with Shentong Zhuyu capsule on the threshold of mechanical compression and the expression of GFAP in spinal cord tissue of CCI rats in order to reveal its mechanism from the inhibition of glial cell activation in spinal cord tissue. Methods: Adult SD rats were randomly divided into sham operation group, model group, electroacupuncture group, traditional Chinese medicine group and acupuncture combined with Chinese medicine group. Each group was divided into three subgroups: 3 days, 7 days and 14 days,with 10 rats in each subgroup. According to Bennett method to establish CCI rat models, electroacupuncture group received Sunshang Cehuan Tiao therapy,Yanglingquan electroacupuncture treatment,once per day with 30min. Chinese medicine group received Shentong Zhuyu capsule treatment (1.64 g/kg), administered by intragastric administration, administration volume of 15 ml/kg, once per day. Acupuncture combined with Chinese medicine group received acupuncture and traditional Chinese medicine treatment,with the same methods and treatment above. Sham operation group and model group were given equal volume of saline. The expression of GFAP mRNA in the spinal cord of CCI model rats was detected by RT-PCR. The expression of GFAP mRNA was detected by RT-PCR. Results: The MWT test showed that the MWT of the model group was significantly decreased after operation of 3 days, and there was a significant difference between two groups (P<0.05). In the acupuncture group, the traditional Chinese of medicine group, the acupuncture combined with Chinese medicine group MWT of CCI rats was increased, and the difference was statistically significant (P<0.05) at each time point compared with that in the model group. The MWT of acupuncture combined with Chinese medicine group was significantly higher than that of the acupuncture group and the traditional Chinese medicine group (P<0.05). The relative expression of GFAP mRNA in the spinal cord tissue was significantly higher than that in the sham operation group (P<0.05), and the expression of GFAP mRNA in the model group was significantly higher than that in the sham operation group (P<0.05). The relative expression of GFAP mRNA in spinal cord tissue of acupuncture group, Chinese medicine group and acupuncture combined with Chinese medicine group was significantly lower than that of model group (P<0.05). The relative expression of GFAP mRNA in the acupuncture combined with Chinese medicine group was significantly lower than that in the acupuncture group and the traditional Chinese medicine group (P<0.05). The results showed that acupuncture group, traditional Chinese medicine group and acupuncture combined with Chinese medicine group could inhibit the expression of GFAP mRNA in spinal cord tissue of CCI model rats, especially in acupuncture combined with Chinese medicine group. Conclusion: Electroacupuncture combined with Shentong Zhuyu capsule can significantly improve the threshold of mechanical compression in CCI model rats, and its mechanism may be related to the inhibition of GFAP mRNA expression in spinal cord tissue.

Neuropathic pain; Electroacupuncture; Shentong Zhuyu capsule; GFAP

2016-12-20

2017-02-16

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2015034)；黑龍江省博士后基金項(xiàng)目(LBH-Z12264)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項(xiàng)目(035143)

金弘(1978-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事針刺對各種疼痛性疾病的臨床與機(jī)理研究。

*通訊作者：劉婷婷(1979-)，女，副教授，主要從事針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

R246.6;R741

A

1002-2392(2017)02-0033-04