韓雨，徐晶宇，李佐同，趙長江，賀林，楊克軍，谷英男，趙瑩，閆博巍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

玉米PLDs基因家族生物信息學(xué)分析

韓雨，徐晶宇，李佐同，趙長江，賀林，楊克軍，谷英男，趙瑩，閆博巍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

磷脂酶D（PLD）為植物中重要的一種水解酶，PLD在逆境下不僅參與細(xì)胞膜的老化過程和種子萌發(fā)的過程，還作為一個信號物質(zhì)響應(yīng)脫落酸的形成。為了進(jìn)一步明確玉米PLDs基因家族的功能，通過對玉米PLDs基因家族基本信息的預(yù)測，結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，染色體定位，基因結(jié)構(gòu)的分析，蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析以及鹽堿脅迫下的ZmPLDs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定出ZmPLDs15個，分布在α、β、ε、ζ四個亞家族中，且預(yù)測基因主要功能為響應(yīng)逆境信號和ABA誘導(dǎo)的氣孔開閉過程。通過對ZmPLDs生物信息學(xué)分析進(jìn)一步明確了ZmPLDs基因家族的生物學(xué)功能。

玉米；ZmPLDs；生物信息學(xué)

在細(xì)胞的生物過程中磷脂酶（PLD）是普遍存在于真核細(xì)胞中的酶。PLD有不同的反應(yīng)類型，其中主要的兩種分別是動物存在于哺乳類動物中的糖基磷脂酰激酶的蛋白（GPI-PLD）和卵磷脂蛋白（PCPLD）。兩種顯著的PC-PLD基因在動物中已經(jīng)被鑒定，他們參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和氣孔的呼吸。酵母（accharo-myces cerevisiae）中僅有PC-PLD基因家族中基因被鑒定。

植物中PLD也得到了廣泛的研究，特別是PLD的活性在植物中得到了首次研究[1]。 PLD基因在蓖麻中首次得到克隆[2-3]。逆境環(huán)境下PLD不僅在膜的老化和種子萌發(fā)的過程中起到重要的作用，也作為一個信號物質(zhì)響應(yīng)脫落酸的合成。在藥理學(xué)中已經(jīng)證明異元三聚體G-蛋白在PLD合成過程中起到了重要的作用[4]。最近的一項研究表明PLDα基因?qū)煵萆L發(fā)育起到了重要的作用[5]。PLD形成二酰甘油和磷脂酸（PA），他們是植物重要的信號分子，對于植物的生長發(fā)育起到至關(guān)重要的作用[6-7]。至今已有20多個PLD基因從植物中克隆出來。多種亞家族被發(fā)現(xiàn)使得PLD的研究復(fù)雜化。被子植物中PLD分為三個主要的亞家族，他們是C2-PLD，PXPH-PLD和SP-PLD。C2-PLD的主要結(jié)構(gòu)是N端有一個C2結(jié)構(gòu)域，在中間和C端各有一個HKD結(jié)構(gòu)域；其主要作用是將可溶性蛋白定位到細(xì)胞膜上，這一過程需要與Ga2+結(jié)合[8]；PXPH-PLD的主要結(jié)構(gòu)為在N端有PX和PH結(jié)構(gòu)域，在C端有HKD結(jié)構(gòu)域，其主要作用為參與聚磷酸肌醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[9]。SP-PLD在N端只有一個信號肽，沒有其他的結(jié)構(gòu)。亞組中的亞組α、β、γ、δ、ε屬于 C2-PLD，ζ屬于 PXPH-PLD，φ屬于SP-PLD。

PLD基因家族在擬南芥和水稻中研究的全面，但在玉米中的研究仍不多見。通過對玉米PLD基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析能夠進(jìn)一步明確玉米中PLD基因的功能。

1 材料與方法

1.1 ZmPLDs基因家族基因基本信息

利用已知的擬南芥PLD基因家族中的12個基因搜索 NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和玉米基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.maizegdb.org/）進(jìn)行比對；與 Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）中玉米數(shù)據(jù)庫中的基因進(jìn)行比對，獲得相應(yīng)的Pfam號，去除冗余基因。利用NCBI和SMART（http：// smart.embl-heidelberg.de/）對非冗余的蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。在玉米數(shù)據(jù)庫中獲得ZmPLDs基因的登錄號，編碼區(qū)長度，氨基酸數(shù)量。利用Expasy軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）獲得基因的分子式、分子量、跨膜螺旋、等電點、親水系數(shù)。利用HMMTOP（http：//www.enzim.hu/hmmtop/）、Wolfpsort（http：//wolfpsort.org/）、Signal P 4.1 Server（http：// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對蛋白的跨膜螺旋、亞細(xì)胞定位、信號肽進(jìn)行分析。

1.2 玉米PLD蛋白進(jìn)化分析

利用MEGA6.0對蛋白的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。

1.3 ZmPLDs基因結(jié)構(gòu)及染色體定位

利用GSDS對ZmPLDs基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過玉米數(shù)據(jù)庫MaizeGDB獲得染色體位置，利用Map Inspect對定位圖進(jìn)行繪制。

1.4 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

采用 Inter Pro Scan 5（http：//www.ebi.ac.uk/ Tools/pfa/iprscan5/）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的分析，應(yīng)用程序選擇HMMPfam、HMMSmart和Super Family。

1.5 玉米幼苗根系轉(zhuǎn)錄組分析

取100 mM NaHCO3處理0 h、12 h、24 h、72 h根系樣品按Trizol試劑盒 （天根）進(jìn)行總RNA提取，取500 ng進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測RNA并進(jìn)行RNA文庫構(gòu)建，運用Hiseq2 000（美國Illumnia公司）進(jìn)行高通量測序。差異轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量計算采用FPKM計算度量指標(biāo)（FPKM-Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）， 利用Cuffnorm程序計算樣本表達(dá)量，取log2在2倍以上且滿足P value＜0.05基因定義為差異基因。通過Blast2-GO軟件對 Cufflinks組裝得到的所有 unigenes與NCBI的nr蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比對，對unigenes進(jìn)行GO注釋和分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmPLDs基因鑒定和命名

根據(jù)比對結(jié)果獲得基因序列，提交Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗證，獲得含有PLD基因特有結(jié)構(gòu)域的非冗余蛋白序列15個，根據(jù)結(jié)構(gòu)域?qū)蜻M(jìn)行命名，分別為ZmPLDa1～7；ZmPLDβ1～4；ZmPLDε1～3；ZmPLDζ1。由表 1可知，ZmPLDs基因編碼序列長度介于 672（ZmPLDζ1）～3 147（ZmPLDβ2）之間，氨基酸個數(shù)介于223～1 048之間，蛋白分子量介于 43.712 8 KDa（ZmPLDβ1）～116.478 KDa（ZmPLDβ1）之間，平均蛋白分子量為 80.910 KDa， 均為親水性蛋白，ZmPLDα1、ZmPLDβ1、ZmPLDβ4呈堿性，其他基因呈酸性。ZmPLDs均不含跨膜螺旋結(jié)構(gòu)且均不含有信號肽。

定位于葉綠體中的基因有：ZmPLDa1～6，Zm－PLDβ1，ZmPLDβ3～4，ZmPLDε1～2，ZmPLDζ1；定位于線粒體中的基因有：ZmPLDβ1、ZmPLDβ4；定位于細(xì)胞核中的基因有：ZmPLDα6、ZmPLDβ3、ZmPLDε2；定位于細(xì)胞質(zhì)中的基因有：ZmPLDα2、ZmPLDα3、Zm－PLDα5、ZmPLDα6、ZmPLDα7、ZmPLDβ2、ZmPLDβ3、ZmPLDε1、ZmPLDε3、ZmPLDζ1。

表1 ZmPLDs基因的特征Table 1 Characters of ZmPLDs genes

2.2 ZmPLDs蛋白結(jié)構(gòu)域分析

由Inter ProScan分析發(fā)現(xiàn)可知（表1），大部分基因含有PLD基因家族中的C2（PF00168、SSF56024、SM00239）結(jié)構(gòu)域和PLD活性相關(guān)結(jié)構(gòu)域（PF00614、SM00155、PF12357）。含有PF00168的基因有Zm－PLDα1～7、ZmPLDβ2、ZmPLDβ3、ZmPLDε1、ZmPLDε2、ZmPLDε3；全部的基因都含有SSF56024結(jié)構(gòu)域，含有 SSF49562結(jié)構(gòu)域的基因有 ZmPLDα1～7、Zm－PLDβ2～3、ZmPLDε1～3；含有PF12357結(jié)構(gòu)域的基因有 ZmPLDα2～7、ZmPLDβ2～3、ZmPLDε1～2；含有PF00614結(jié)構(gòu)域的基因有：ZmPLDα2～7，ZmPLDβ1～4，ZmPLDε1～3，ZmPLDζ1；含有SM00239結(jié)構(gòu)域的有 ：ZmPLDα3、ZmPLDα6、ZmPLDα7，ZmPLDβ2 ～3，ZmPLDε1～3；含有SM00155結(jié)構(gòu)域的有：ZmPLDα3～7，ZmPLDβ2、ZmPLDε1～3、ZmPLDζ1；含有PF13091 PLD相關(guān)結(jié)構(gòu)域的有：ZmPLDβ2、ZmPLDε2、Zm－PLDζ1；ZmPLDζ1特有 PH型結(jié)構(gòu)域 PF00169、SSF50729、SM00233。

圖1 玉米、水稻、擬南芥PLDs蛋白進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of PLDs from maize，rice and arabidopsis

2.3 ZmPLDs蛋白進(jìn)化分析

通過鄰接法將擬南芥、水稻中所有PLDs與Zm－PLDs基因進(jìn)行蛋白聚類分析，擬南芥、水稻的基因情況均已鑒定?？芍衩譖LDs主要分布在PLDα、PLDβ、PLDε、PLDζ四個亞家族中，其中PLDα包含7個ZmPLDs蛋白，與5個擬南芥蛋白、8個水稻蛋白同組，PLDβ包含4個ZmPLDs，與2個擬南芥蛋白、2個水稻蛋白同組，PLDγ只有擬南芥，PLDε中包含3個ZmPLDs蛋白，與1個擬南芥蛋白、3個水稻蛋白同組。PLDζ中包含1個ZmPLDs蛋白，與2個擬南芥蛋白，2個水稻蛋白同組。由進(jìn)化分析可知，玉米PLD蛋白與水稻親緣關(guān)系更近。

2.4 ZmPLDs基因結(jié)構(gòu)分析

對玉米PLDs基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖2），可將ZmPLDs分為兩個組，第一組為PLDα，其他亞家族為第二組。PLDa中所有基因的外顯子個數(shù)均為2～4個，個數(shù)為3個的居多（ZmPLDα1、ZmPLDα2、ZmPLDα3、ZmPLDα6、ZmPLDα7），第二組中除ZmPLDζ1外其余基因外顯子個數(shù)為5～10個，ZmPLDζ1外顯子個數(shù)多達(dá)15個。第一組基因長度多集中在10 kb以內(nèi)，其中ZmPLDα1基因長度最短，為3 kb左右，而第二組基因長度多集中于12 kb左右，ZmPLDζ1基因長度最長，為46 kb左右。

圖2 ZmPLDs基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of ZmPLDs gene family

2.5 染色體定位分析

對ZmPLDs進(jìn)行染色體定位分析（圖3）可知，ZmPLDs基因分布在玉米10條染色體中的1～9號染色體上。染色體3、4、7、8上都只有1個ZmPLDs基因，6號和9號染色體上有2個ZmPLDs基因，1號和2號染色體上有3個ZmPLDs基因。多數(shù)基因位于染色體的兩端，遠(yuǎn)離中心粒，ZmPLDα5、ZmPLDβ3距離較近，靠近1號染色體中心位置，ZmPLDα1、ZmPLDα7距離較近，靠近9號染色體的中心粒。

圖3 ZmPLDs染色體定位Fig.3 Chromosomal distributions of ZmPLDs genes in the maize genome

2.6 ZmPLDs轉(zhuǎn)錄組測序分析

結(jié)合轉(zhuǎn)錄測序分析可知，鹽堿脅迫不同時間點可將ZmPLDs分為四大組，第一組為12 h、24 h、72 h表達(dá)量均上調(diào)的基因上調(diào)，第二大組為12 h、24 h、72 h表達(dá)量均下調(diào)的基因，第三大組為表達(dá)量在12 h、24 h、72 h呈上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)趨勢，第四大組為表達(dá)量在12 h、24 h、72 h呈下調(diào)-上升-下調(diào)趨勢。第一組中包括的基因有：ZmPLDα2、ZmPLDα6、Zm－PLDβ2、ZmPLDζ1；第二組包含ZmPLDα7、ZmPLDβ3、ZmPLDε1、ZmPLDα3、ZmPLDα4；第三大組包含Zm－PLDε2、ZmPLDε3；第四大組包含ZmPLDα1、ZmPLDα5。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)沒有覆蓋到ZmPLDβ1、ZmPLDβ4。

圖4 玉米根系轉(zhuǎn)錄組測序分析Fig.4 Transcriptome sequencing of roots of maize seedlings

3 結(jié)果與討論

PLD是普遍存在于植物中的磷脂酶基因家族，他能夠水解磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺，生成磷脂酸[11]，也在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜運輸、細(xì)胞骨架形成、膜降解等多種生物過程中起到重要的作用。多種作物PLDs已被研究，在擬南芥中也得到廣泛研究。但在玉米中PLDs還沒有得到研究。玉米為C4植物[12]，通過對ZmPLDs進(jìn)行結(jié)構(gòu)、功能上的分析，為C4植物中的PLDs功能進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

實驗共鑒定ZmPLDs基因15個，他們分別分布在α、β、ε、ζ四個亞家族中。擬南芥中PLDα、PLDβ[13]、PLDγ、PLDζ功能已被鑒定[14-17]。PLDα為PLDs基因家族中最常見的一類亞家族，本實驗中鑒定出7個PLDα基因，可見PLDα亞家族在玉米中也是最常見的一類亞家族。由他們的蛋白結(jié)構(gòu)域相似，ZmPLDα2、ZmPLDα3的親緣關(guān)系較近，ZmPLDα1、ZmPLDα5的親緣關(guān)系較近。PLDα的主要結(jié)構(gòu)域為C2結(jié)構(gòu)域，這也是PLDs基因家族中的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域。在擬南芥的PLDα亞家族的四個基因也十分相似，在C端含有ATG氨基酸序列，在N端含有TAA氨基酸序列。ZmPLDαs中外顯子的數(shù)量在2～4之間，在擬南芥PLDαs的四個基因中外顯子的個數(shù)均為4個[18]，由此可見ZmPLDαs與AtPLDαs具有相似的功能區(qū)域。PLDαs的活性是由GPA1蛋白控制的，GPA1調(diào)節(jié)由ABA誘導(dǎo)的氣孔開閉過程[19]，因此表明PLDαs在ABA誘導(dǎo)的氣孔開閉過程中起重要作用[20]。但是AtPLDα1功能缺失并沒有抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔開閉過程[21]，因此證明PLDαs并不是唯一調(diào)控此途徑的基因亞家族，其他的亞家族也有可能參與調(diào)控此過程。ZmPLDαs功能區(qū)與擬南芥具有高度的相似性，因此可推斷ZmPLDαs也有可能在ABA誘導(dǎo)的氣孔開閉過程中起作用。干旱脅迫下AtPLDαs轉(zhuǎn)錄組測序表達(dá)量上調(diào)，證明干旱脅迫下PLDαs調(diào)控氣孔開閉過程，保證植物正常生命活動，由此可見逆境脅迫下PLDαs起到重要作用。實驗對鹽堿脅迫不同時間點玉米根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，ZmPLDα2、ZmPLDα6在12 h、24 h、72 h均為上調(diào)，表明在鹽堿脅迫下基因參與植物的逆境調(diào)節(jié)途徑；表明ZmPLDαs在鹽堿脅迫下也起到重要的作用。ZmPLDα3、ZmPLDα4、ZmPLDα7這三個基因為適應(yīng)逆境對植物的損傷因此表達(dá)量上調(diào)；ZmPLDα1、ZmPLDα5的變化趨勢為下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)，在逆境脅迫下參與玉米體內(nèi)代謝平衡。ZmPLDαs在鹽堿脅迫下變化顯著，表明ZmPLDαs參與玉米體內(nèi)逆境調(diào)節(jié)。此外，ZmPLDαs在玉米的1號、3號6號8號9號染色體上均有分布，可見ZmPLDαs對于調(diào)節(jié)玉米生長發(fā)育至關(guān)重要。

實驗鑒定出4個ZmPLDβs基因，他們的主要結(jié)構(gòu)域為C2結(jié)構(gòu)域（PF00168）和PLD活性相關(guān)結(jié)構(gòu)域（PF00614）。有研究表明AtPLDβs依賴于多磷酸肌醇途徑、Ga2+的形成途徑、并且能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的PH。PLDβs的活性與脂類基質(zhì)囊泡中4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）途徑中的磷脂酰肌醇（PIP），PI，PG，PS，PE，PA有關(guān)。PIP能夠調(diào)節(jié)PLDβs的活性[22]。由此可見PLDβ主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。ZmPLDβ2、Zm－PLDβ3定位于細(xì)胞質(zhì)中，可知ZmPLDβ2、ZmPLDβ3在ZmPLDβs中起主要作用。蛋白進(jìn)化分析也表明ZmPLDβ2和ZmPLDβ3的親緣關(guān)系更近。ZmPLDβs的外顯子數(shù)量多于ZmPLDαs，可見ZmPLDβs的功能更為復(fù)雜。通過調(diào)節(jié)Ga2+濃度來驗證PLDs對PIP2途徑的影響，結(jié)果表明PLDβs對PIP2途徑的影響多于PLDαs。由此可見ZmPLDs也可能參與PIP2途徑。鹽堿脅迫下ZmPLDβ2表達(dá)上調(diào)，ZmPLDβ3表達(dá)下調(diào)，達(dá)到顯著變化，可知鹽堿逆境下ZmPLDβs也參與調(diào)控植物體內(nèi)平衡。

實驗中鑒定出ZmPLDεs為3個，他們主要定位在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。ZmPLDεs外顯子的數(shù)量為5～10個，定位在玉米2號、7號染色體上。ZmPLDεs共有的蛋白功能區(qū)是C2結(jié)構(gòu)域（SM00239）和PLD活性相關(guān)結(jié)構(gòu)域（PF00614）。有研究表明ZmPLDεs參與植物體內(nèi)ROS調(diào)控作用，ROS是植物氧化還原過程中的副產(chǎn)物，植物通過啟動體內(nèi)的ROS防御系統(tǒng)來緩解逆境對植物造成的傷害[23]。由此可知Zm－PLDεs也參與植物體內(nèi)的ROS調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得知ZmPLDεs變化顯著，可見ZmPLDεs參與植物的逆境調(diào)節(jié)。但ZmPLDεs的變化趨勢不一致，由此可以判斷ZmPLDεs不是單一的調(diào)控因子，是由于植物體內(nèi)環(huán)境變化還是外界因素干擾導(dǎo)致基因表達(dá)量發(fā)生變化需要通過實驗進(jìn)一步探討。

ZmPLDζ僅一個，且含有PH結(jié)構(gòu)域（PF00169）。PH結(jié)構(gòu)域也是PLDs特有的結(jié)構(gòu)域。ZmPLDζ1的基因長度達(dá)到46kb且外顯子數(shù)多達(dá)14個，可見Zm－PLDζ1功能復(fù)雜。ZmPLDζ1位于6號染色體上且遠(yuǎn)離中心粒。有研究表明PLDζs在植物的根系中有較高的表達(dá)量[24]。PLDζs也參與擬南芥體內(nèi)ABA保衛(wèi)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，且PLDζs轉(zhuǎn)錄水平高于PLDαs[25]。鹽堿脅迫下ZmPLDζ1的轉(zhuǎn)錄水平為上調(diào)，可見Zm－PLDζ1能夠調(diào)節(jié)植物對逆境脅迫下的響應(yīng)。

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Genome-wide Analysis of the ZmPLDs Gene Family in Maize（Zea mays）

Han Yu，Xu Jingyu，Li Zuotong，Zhao Changjiang，He Lin，Yang Kejun，Gu Yingnan，Zhao Ying，Yan Bowei
（College of Agronomy，Hei Longjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319）

Phospholipase D（PLD）was one of the most important hydrolase of plants，PLD was not only involved in the aging process of the cell membrane and the germination process of seeds under the stress environment，but also formed in response to ABA as a signal substance.In order to further clarify the function of ZmPLDs gene family，to predict the ZmPLDs basic information of maize，domain，the chromosomal localization，gene structure，the system protein evolution，and transcriptome analysis of ZmPLDs under salinity stress，15 ZmPLDs genes were identified，which distributed in α、β、ε、ζ subfamily.The main functions of the genes were the prediction signal in response to stress and ABA-induced stomatal closure.The ZmPLDs gene family biological function of maize could be clarified furtherly.

maize；ZmPLDs；bioinformatics

Q78

A

1002-2090（2017）02-0013-08

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.003

2016-03-12

教育部博士學(xué)科點博導(dǎo)類專項科研基金（201222305110001）；黑龍江省自然科學(xué)基金項目（C201324）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新項目（YJSCX2014-Y05）。

韓雨（1991-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院2013級碩士研究生。

楊克軍，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：byndykj@163.com。