黃翔杰+李宇超+蔣鵬+張昕+張欣怡+覃品燕+田薇

摘要：利用GC-MS，比對(duì)植物體莖葉、根系分泌物、植物根際土壤3個(gè)醇提取物中共有成分，以確定出野菊（Chrysanthemum indicum）根系分泌物所產(chǎn)生的主效化感物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用外源法測(cè)定2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二乙酯在4個(gè)不同濃度下對(duì)油菜（Brassica napus L.）、生菜（Lactuca sativa var. ramosa Hort.）、萵苣（L. sativa L.）3種化感敏感植物種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，野菊根系分泌的主要化感物質(zhì)有2，4-二叔丁基苯酚和鄰苯二甲酸二乙酯，且2，4-二叔丁基苯酚對(duì)3種植物的抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)；鄰苯二甲酸二乙酯在0.05 mmol/L濃度下對(duì)油菜有明顯的促進(jìn)作用，在0.05 mmol/L和0.10 mmol/L濃度時(shí)，對(duì)生菜鮮重、萵苣和油菜胚根生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：野菊（Chrysanthemum indicum）；根系分泌物；化感效應(yīng)；2，4-二叔丁基苯酚；鄰苯二甲酸二乙酯

中圖分類號(hào)：S154.3；S312 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）06-1061-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.018

Abstract： The three extract of aerial parts plants，root exudates and plant rhizosphere soil was analyzed by GC/MS，to determine the main allelochemicals produced from root exudates of Chrysanthemum indicum. By using seed germination methods in culture dish，exogenous application were used to test the allelopathic effect of 2，4-Ditertbutyl phenol and diethyl phthalate on the seed germination and seedling growth of lettuce（Lactuca sativa var. ramosa Hort.），romaine lettuce （L. sativa L.） and rape（Brassica napus L.）. The results showed that the main allelochemicals produced from root exudates of C. indicum were 2，4-Ditertbutyl phenol and diethyl phthalate. And the inhibition of 2，4-Ditertbutyl phenol to three plants increased with increasing the concentration of 2，4-Ditertbutyl phenol； Diethyl phthalate had obvious effect on promoting the rape under the concentration of 0.05 mmol/L， in the 0.05 mmol/L and 0.10 mmol/L concentration on the growth of lettuce， fresh weight of rape，lettuce and radicle had promoting effect.

Key words： Chrysanthemum indicum； root exudates； allelopathy； 2，4-Ditertbutyl phenol； diethyl phthalate

野菊（Chrysanthemum indicum L.）為菊科菊屬植物。廣泛分布于全國(guó)，以及周邊各個(gè)國(guó)家，如蘇聯(lián)、朝鮮、日本等。野菊的花、葉均可入藥，有抗菌抑菌、消炎及抗病毒活性等作用，具有極高的藥用價(jià)值[1]。但其在生態(tài)防治方面的功效較少涉及。植物化感作用在農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中是一種普遍存在的現(xiàn)象，化感作用明顯影響著群落的結(jié)構(gòu)、演替和農(nóng)作物的產(chǎn)量[2]，目前，化感作用在對(duì)農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中植物病害和雜草的防治方面顯示出較大的應(yīng)用潛力。同時(shí)，由于化感作用機(jī)理獨(dú)特，有害生物不易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，對(duì)植物化感物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用可減少人類對(duì)化學(xué)藥品的依賴，進(jìn)而從中尋找出有生物活性的化合物，為農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治、抑制雜草提供科學(xué)依據(jù)。

根系分泌是植物化感作用的一條重要途徑，也是化感物質(zhì)的一個(gè)重要來(lái)源。同一地塊連續(xù)種植同種植物后，上茬植物可以通過(guò)殘枝降解、根系分泌等方式將化感物質(zhì)釋放到土壤中。一方面，許多植物的植物體提取物具有顯著的殺菌抑菌作用[3-6]，前期試驗(yàn)也曾發(fā)現(xiàn)野菊莖葉醇提液對(duì)白術(shù)及其病原菌有顯著的化感作用[7]，另一方面，很多植物具有通過(guò)根系分泌物抑制雜草的化感作用[8-10]，這些化感物質(zhì)是天然的除草劑，若被合理利用將有可能減少化學(xué)除草劑的施用量。

考慮到野菊有較強(qiáng)的化感作用，而根系分泌是植物化感作用的重要途徑和來(lái)源。因此，本試驗(yàn)利用氣相色譜-譜聯(lián)用儀（GC-MS）技術(shù)對(duì)野菊根系分泌物中的化感物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)鑒定，以期確定出其中的主要化感物質(zhì)。并選取常見(jiàn)化感敏感植物油菜、生菜和萵苣，研究不同化感物質(zhì)的作用潛力，為進(jìn)一步研究野菊根系分泌物的化感作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二乙酯購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司（純度≥98%）。

油菜種子（浙油18）購(gòu)自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；萵苣種子（春秋青葉尖）購(gòu)自四川種都種業(yè)有限公司；生菜種子（意大利耐抽薹生菜）購(gòu)自河北青縣純豐蔬菜良種繁育場(chǎng)。野菊采集于浙江省麗水市遂昌縣。

儀器主要有5975C-7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）、Milli-Q超純水裝置、索氏提取器（北京宏達(dá)化學(xué)儀器有限公司）、R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠）、凍干機(jī)（德國(guó)CHRIST公司）。

1.2 方法

1.2.1 供試提取液的制備 野菊莖葉提取液（LOE）：取野菊莖葉部分，洗凈，置烘箱內(nèi)60 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)篩（80目），精密稱定0.2 g野菊莖葉粉末于10 mL容量瓶中，甲醇定容超聲30 min，得到野菊莖葉提取液。

野菊根際土壤提取液（SOE）：挖出野菊植株，選取健康根系，抖落根系2 mm處泥土并收集，60 ℃烘干，稱取208.58 g干土樣，使用甲醇超聲提取30 min，過(guò)濾后取濾液，濾液蒸干后得干燥物，使用甲醇定容至1.5 mL，得到野菊根際土壤提取液。

野菊根系分泌物提取液（ROE）：使用浸根法[11]收集野菊根系物。采用扦插法種植野菊，待野菊長(zhǎng)出健康根系后，挖出野菊使用去離子水沖洗干凈，將野菊置于去離子水中培養(yǎng)，每隔24 h收集培養(yǎng)用水，連續(xù)收集兩次得根系分泌物的水溶液。將根系分泌物水溶液-20 ℃冷凍，使用凍干機(jī)冷凍干燥后得野菊根系分泌物固體，取21.3 mg加入甲醇，超聲提取后濃縮至2 mL得野菊根系分泌物提取液。

1.2.2 色譜條件 GC-MS系統(tǒng)色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（純度>99.999%），程序升溫，初始溫度為60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，然后以10 ℃/min升至300 ℃，總時(shí)間43 min，進(jìn)樣量1 μL，不設(shè)分流比。

GC-MS系統(tǒng)質(zhì)譜條件：連接處溫度280 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，通過(guò)Nist 08譜庫(kù)檢索，采用峰面積歸一法計(jì)算各成分相對(duì)含量。

1.2.3 根系分泌物的鑒定 采用Xcalibur 1.2版本軟件、NIST98譜圖庫(kù)兼顧色譜保留時(shí)間對(duì)野菊不同部位組分定性，并以標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行驗(yàn)證，以各類物質(zhì)的峰面積進(jìn)行定量。

1.2.4 含藥培養(yǎng)基的制備 外源化感物質(zhì)選擇了在LOE、ROE、SOE中的共有物質(zhì)2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二乙酯。先使用去離子水配制瓊脂含量為0.7%的瓊脂培養(yǎng)基，取50 mL分裝于150 mL錐形瓶中。分別精密稱定2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二乙酯適量，使用400 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解，加入到70 ℃左右瓊脂培養(yǎng)基中，搖勻后倒入直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中放置凝固，使每種物質(zhì)的含藥培養(yǎng)基終濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00 mmol/L。50 mL培養(yǎng)基中加入400 μL DMSO作為對(duì)照組。該濃度下DMSO對(duì)受體植物的生長(zhǎng)無(wú)影響。

1.2.5 化感效應(yīng)的測(cè)定 挑選無(wú)損壞、飽滿、大小一致的種子，進(jìn)行發(fā)芽預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3種植物的發(fā)芽率均達(dá)到95%以上。將受體種子使用0.2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，用去離子水沖洗干凈。將受試種子整齊擺放于培養(yǎng)基表面，每個(gè)處理20粒，重復(fù)3次。3種受體種子，2種物質(zhì)，4個(gè)濃度處理，共24個(gè)處理。

將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中避光24 ℃恒溫培養(yǎng)，待胚芽突破種皮達(dá)到種子1/2長(zhǎng)度時(shí)視為發(fā)芽，種子全部發(fā)芽或無(wú)種子發(fā)芽時(shí)記錄種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率GR（Germination rate）。種子完成發(fā)芽48 h后每處理選取10株長(zhǎng)勢(shì)相近的幼苗測(cè)量其胚芽長(zhǎng)度SL（Shoot length）、胚根長(zhǎng)度RL（Radicle length）和芽苗鮮重SFW（Sprout fresh weight）等指標(biāo)。

其中，發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

化感效應(yīng)指數(shù)T≥C時(shí)，RI=1-C/T；T

化感綜合效應(yīng)指數(shù)SE=（RIGI+RIRL+RISL+RISFW）/4，即各化感效應(yīng)指數(shù)的平均值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2007軟件處理原始數(shù)據(jù)和繪圖，采用SPSS 13.0（SPSS Inc，USA）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物的化學(xué)組分鑒定

2.1.1 GC-MS結(jié)果 通過(guò)GC-MS分析得到LOE、ROE、SOE的總離子流圖見(jiàn)圖1，并利用峰面積歸一化法確定各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其中，匹配度大于70%的成分列于表1。LOE、ROE、SOE中共鑒定出47種物質(zhì)，經(jīng)查閱，二十烷不是共有物。因此，共有的物質(zhì)有2種：2，4-二叔丁基苯酚和鄰苯二甲酸二乙酯，見(jiàn)表2和圖2。

由表1可以看出，LOE、ROE、SOE中有機(jī)物種類豐富，含有酮、醇、酯、醛、烴、有機(jī)酸等物質(zhì)。其中，鄰苯二甲酸酯類[14]、2，4-二叔丁基苯酚[15]、SOE中的香蘭素[16]和棕櫚酸[17]、LOE中的葉綠醇[18]、亞麻酸[19]、亞油酸和硬脂酸[20]等是被報(bào)道過(guò)的化感物質(zhì)。

本試驗(yàn)GC-MS結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)大部分是植物次生代謝產(chǎn)物，一般相對(duì)分子量較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，包括水溶性有機(jī)酸、脂肪族醛和酮、直鏈醇、不飽和內(nèi)酯、多炔、長(zhǎng)鏈脂肪酸、內(nèi)萜、生物堿、氨基酸、苯甲酸及其衍生物等。

2.2 二種化感物質(zhì)對(duì)三種植物的化感作用

2.2.1 2，4-二叔丁基苯酚對(duì)三種植物的化感效應(yīng) 由圖3可知，與對(duì)照相比，2，4-二叔丁基苯酚在4個(gè)濃度下對(duì)油菜均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，由化感綜合效應(yīng)指數(shù)（SE）可以看出，隨著處理濃度的增加，化感作用也逐漸增強(qiáng)；其對(duì)生菜均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，化感綜合效應(yīng)顯示，隨著處理濃度的增加，化感作用逐漸增強(qiáng)；其對(duì)萵苣均表現(xiàn)出抑制作用，并達(dá)到極顯著差異。并且隨著處理濃度的增加，化感抑制作用逐漸增強(qiáng)。

2.2.2 鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)三種植物的化感效應(yīng) 由圖4可知，在0.05 mmol/L濃度下鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)油菜胚根、胚芽和鮮重產(chǎn)生了促進(jìn)作用，并達(dá)到極顯著差異。在0.10、0.50、1.00 mmol/L濃度下，開(kāi)始表現(xiàn)為抑制作用，化感綜合效應(yīng)指數(shù)（SE）顯示，隨著處理濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。綜合表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制；在0.05和0.10 mmol/L濃度下，鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)生菜鮮重有顯著的促進(jìn)作用，而在0.50和1.00 mmol/L濃度下，對(duì)生菜鮮重則有明顯的抑制作用?；芯C合效應(yīng)指數(shù)顯示，4個(gè)濃度下鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)生菜均表現(xiàn)為抑制作用；在0.05和0.10 mmol/L濃度下，萵苣芽苗生長(zhǎng)與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，在0.50和1.00 mmol/L濃度下，鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)萵苣胚芽、胚根和芽苗鮮重表現(xiàn)出顯著的抑制作用。由化感綜合效應(yīng)指數(shù)可以看出，不同濃度下，萵苣芽苗生長(zhǎng)均受到了抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)（圖4）。

3 小結(jié)與討論

在自然條件下，植物化感物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境主要有4種途徑：①植物體釋放揮發(fā)性物質(zhì)；②雨水從植物體淋溶；③植物根系分泌；④植物殘枝敗葉腐解。這4種途徑之間往往存在著交叉關(guān)系，其中土壤是植物產(chǎn)生化感作用的媒介，化感物質(zhì)在土壤中通過(guò)遷移、轉(zhuǎn)化、滯留等途徑逐漸富集，達(dá)到活性濃度，產(chǎn)生自毒作用、連作障礙等化感現(xiàn)象?；形镔|(zhì)種類繁多，Rice[21]將其分為14類，以往的報(bào)道大多針對(duì)植物根際土壤化學(xué)成分、植物體浸提物、根系分泌物中的一項(xiàng)，鑒定出較多的疑似化感物質(zhì)。而根系分泌物和殘枝敗葉腐解這兩個(gè)途徑涉及到土壤和微生物的作用，因此很難斷定化感物質(zhì)是植物所產(chǎn)生還是微生物作用的結(jié)果[22]，無(wú)法準(zhǔn)確得出哪種物質(zhì)才是該植物體本身所產(chǎn)生并能產(chǎn)生主要化感作用。本試驗(yàn)使用GC-MS，比對(duì)植物莖葉、根系分泌物、植物根際土壤醇提取物主要成分，確定出野菊所產(chǎn)生的主效的穩(wěn)定的化感物質(zhì)，為植物化感主效成分的鑒定提供了新的方法。

酚類物質(zhì)和鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)是典型化感物質(zhì)。周寶利等[13]對(duì)番茄施用2，4-二叔丁基苯酚進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)低濃度處理下，2，4-二叔丁基苯酚可以促進(jìn)番茄種子的萌發(fā)，增加幼苗株高和鮮重，提高番茄體內(nèi)葉綠素含量和幼苗體內(nèi)保護(hù)酶活性。張新慧等[15]報(bào)道對(duì)啤酒花用適量的2，4-二叔丁基苯酚處理，可以促進(jìn)它的生長(zhǎng)和光合能力。王玉潔等[23]研究了2，6-二叔丁基苯酚和鄰苯二甲酸二甲酯對(duì)茄子生長(zhǎng)和幼苗生理特性的影響，發(fā)現(xiàn)兩種物質(zhì)在0.05～0.50 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)茄子株高、鮮重和根系活力均有明顯的抑制作用。本試驗(yàn)應(yīng)用外源法選擇野菊根系分泌物中的2，4-二叔丁基苯酚和鄰苯二甲酸二乙酯兩種化感物質(zhì)進(jìn)行化感效應(yīng)測(cè)定，明確了其對(duì)生菜鮮重、萵苣和油菜胚根生長(zhǎng)具有化感作用。此外，兩種化感物質(zhì)對(duì)同一種植物的化感作用存在差異，同一化感物質(zhì)對(duì)不同植物的化感作用也不盡相同，其正負(fù)效應(yīng)及其強(qiáng)度與其濃度和受試植物種類有關(guān)。在田間，野菊根系分泌物對(duì)不同植物呈現(xiàn)的化感效應(yīng)是其各種化感物質(zhì)的綜合結(jié)果。

化感作用是影響植物生長(zhǎng)的重要因素，一些植物的生長(zhǎng)發(fā)育好壞與化感作用的關(guān)系密切。本試驗(yàn)結(jié)果表明，野菊能通過(guò)化感物質(zhì)的釋放作用于環(huán)境中的其他植物，可為野菊的合理利用及通過(guò)化感作用開(kāi)發(fā)新型除草劑等提供參考。

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