LC-MS/MS快速測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛燃捌渖锏刃匝芯?/h1>
2017-04-26 11:55張全英宗順麟
實(shí)用藥物與臨床 2017年4期
黃 明，張全英，宗順麟
LC-MS/MS快速測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛燃捌渖锏刃匝芯?/p>
黃 明，張全英*，宗順麟
目的 建立人血漿中氯沙坦LC-MS/MS測(cè)定方法，計(jì)算氯沙坦人體藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并評(píng)價(jià)兩制劑生物等效性。方法 采用單劑量雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，完成試驗(yàn)的23例受試者空腹口服受試或參比制劑氯沙坦鉀片100 mg后，用甲醇一步沉淀血漿蛋白，并用LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛?。用DAS 3.2.3軟件計(jì)算氯沙坦人體藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并評(píng)價(jià)兩制劑生物等效性。結(jié)果 服用受試和參比制劑后，血漿中氯沙坦的Cmax分別為(697.3±301.7)和(674.1±350.5) ng/mL，AUC0-12 h分別為(994±240)和(1 005±287)ng·h/mL，tmax分別為(1.23±0.38)和(1.37±0.75) h，t1/2分別為(2.04±0.28)和(2.00±0.40)h，生物利用度為102.4%±21.1%。結(jié)論 建立的分析測(cè)試方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，受試制劑與參比制劑生物等效。
氯沙坦；高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜方法；藥動(dòng)學(xué)；生物等效性
0 引言
氯沙坦鉀(Losartan potassium)是非肽類血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制AT1受體，降低血管阻力，具有良好的抗高血壓作用，主要用于高血壓的治療[1]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛鹊姆椒ㄓ蠬PLC法、LC-MS法和LC-MS/MS法。血漿樣品前處理方法有：①液液萃取法[2-7]：樣品經(jīng)提取、吹干、復(fù)溶等步驟后測(cè)定，操作繁瑣且提取回收率不高。②在線固相萃取法[8]：可獲得更干凈的樣品，但是流動(dòng)相中含有的三乙胺具有離子淬滅作用，且整套系統(tǒng)價(jià)格昂貴。③蛋白沉淀法[9]：樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白，檢測(cè)方法最低定量限為3.000 ng/mL。本研究建立了甲醇一步沉淀蛋白法處理氯沙坦血漿樣品，檢測(cè)方法最低定量限為1.000 ng/mL，低于文獻(xiàn)報(bào)道[2-10]，可用于氯沙坦鉀片一致性評(píng)價(jià)研究。
1 材料
1.1 儀器與試劑 液質(zhì)聯(lián)用儀：API-4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)AB Sciex公司；Agilent1200高效液相色譜儀，主要包含真空脫氣機(jī)、四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫器和柱溫箱，美國(guó)Agilent公司；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Analyst 1.4.2，AB Sciex公司。分析天平：XS 105DU型(Max2=41 g，d2=0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機(jī)：Heraeus Biofuge Stratos，德國(guó)Thermo公司。渦旋混合器：Vortex Genie-2，美國(guó)Scientific Industries公司。純水機(jī)：Milli-Q，美國(guó)MILLIPORE公司。甲醇和甲酸：HPLC級(jí)，TEDIA COMPANY。乙酸銨：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水：滅菌注射用水，安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。空白血漿來(lái)自健康志愿者。
1.2 試驗(yàn)藥物和對(duì)照品 氯沙坦鉀片(受試制劑，批號(hào)：31112002，規(guī)格100 mg/片)由浙江某制藥有限公司生產(chǎn)。氯沙坦鉀片(參比制劑，科素亞?，批號(hào)：120281，規(guī)格100 mg/片)由杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。氯沙坦鉀對(duì)照品(批號(hào)：100597-200501，分子量461.01，氯沙坦分子量422.91，純度100.0%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦對(duì)照品(批號(hào)：201111-8，純度100.0%)由浙江某制藥有限公司生產(chǎn)。
2 方法
2.1 色譜、質(zhì)譜條件 色譜條件：保護(hù)柱：Phenomenex Security GuardTMC18(4 mm×3.0 mm)；色譜柱：WATERS公司Xterra?RP18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-10 mmoL/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)=66∶34(v/v)；流速900 μL/min；分析時(shí)間7.0 min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃。
質(zhì)譜條件:電噴霧(ESI)離子源，正離子電離模式，霧化氣50 psi，加熱輔助氣60 psi，離子源溫度650 ℃，噴霧電壓4 500 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，氯沙坦檢測(cè)離子對(duì)m/z423.2→207.0，去簇電壓(DP) 60 V，射入電壓(EP) 10 V，碰撞能量(CE) 31 V，碰撞室射出電壓(CXP) 5 V。內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦檢測(cè)離子對(duì)m/z429.3→207.0，去簇電壓(DP) 70 V，射入電壓(EP) 10 V，碰撞能量(CE) 30 V，碰撞室射出電壓(CXP) 15 V。
2.2 工作液配制 氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液及工作液：稱量氯沙坦鉀對(duì)照品10.90 mg(相當(dāng)于氯沙坦 10.00 mg)于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋，得濃度為0.020 00、0.060 00、0.200 0、0.600 0、2.000、6.000、20.00、30.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液。
氯沙坦質(zhì)控儲(chǔ)備液及工作液：稱量氯沙坦鉀對(duì)照品10.90 mg(相當(dāng)于氯沙坦10.00 mg)于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的氯沙坦質(zhì)控儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋得濃度為0.040 00、1.200、24.00 μg/mL的質(zhì)控工作液。
內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦儲(chǔ)備液及工作液：稱量厄貝沙坦對(duì)照品10.00 mg于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦儲(chǔ)備液，并于100 mL量瓶用甲醇稀釋得0.100 0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦工作液。
2.3 血漿樣品前處理 取血漿樣品200 μL置1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦工作液50 μL，混勻，加甲醇600 μL沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，于4 ℃、23 755×g高速離心10 min。離心完畢后取上清液400 μL置進(jìn)樣瓶中，加入水相200 μL，混勻后，置于自動(dòng)進(jìn)樣器中進(jìn)樣測(cè)定氯沙坦?jié)舛取?/p>
2.4 人體藥代動(dòng)力學(xué)與生物等效性臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì) 臨床試驗(yàn)方案經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。24例男性受試者均簽署知情同意書，體重指數(shù)均在19～24 kg/m2范圍內(nèi)，心電圖正常，肝、腎功能正常，均符合受試者入選標(biāo)準(zhǔn)。采用隨機(jī)、雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。參加試驗(yàn)的24位受試者隨機(jī)分成2組，每組12例，分別于2個(gè)周期試驗(yàn)當(dāng)日空腹口服受試或參比制劑1片，250 mL溫開(kāi)水送服，清洗期為1周。于服藥前和服藥后0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h由肘靜脈取血3 mL。所有血漿樣品置肝素化采血管中，離心(2 304×g，4 ℃，5 min)，分離上層血漿，于-30 ℃冰箱中保存，待測(cè)。用DAS 3.2.3軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并評(píng)價(jià)受試與參比制劑的生物等效性。
3 結(jié)果
3.1 特異性 分別取氯沙坦對(duì)照品溶液、厄貝沙坦對(duì)照品溶液、空白血漿按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品，空白血漿190 μL和氯沙坦對(duì)照品溶液(2.000 μg/mL)10 μL混勻后按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品，受試者口服氯沙坦鉀片100 mg后 0.5 h的血漿按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，氯沙坦的保留時(shí)間約3.59 min，內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦的保留時(shí)間為4.34 min左右，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦的測(cè)定，見(jiàn)圖1。
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限 取空白血漿190 μL，分別加入氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液10 μL，制備成血漿中氯沙坦?jié)舛葹?.000、3.000、10.00、30.00、100.0、300.0、1 000、1 500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)方法操作，進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以氯沙坦?jié)舛菴為橫坐標(biāo)，氯沙坦峰面積As與內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦峰面積Ai比值f為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸(權(quán)重系數(shù)為1/C2)。回歸方程為f=0.009 1 C-0.000 011 3，r=0.999 4。結(jié)果表明，氯沙坦線性范圍為1.000～1 500 ng/mL，最低定量限LLOQ為1.000 ng/mL。
圖1 血漿中氯沙坦的LC-MS/MS圖
注：A.氯沙坦對(duì)照品溶液(100.0 ng/mL),B.厄貝沙坦對(duì)照品溶液(25.00 ng/mL),C.空白血漿,D.空白血漿190 μL和氯沙坦對(duì)照品溶
液(2.000 μg/mL)10 μL混勻后按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品(血漿含氯沙坦100.0 ng/mL),E.受試者口服氯沙坦鉀片100 mg后0.5 h的
血漿按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品(血漿含氯沙坦262.4 ng/mL)
3.3 精密度與準(zhǔn)確度 取空白血漿190 μL，分別加入氯沙坦最低定量限和質(zhì)控工作液10 μL，制備成血漿中氯沙坦?jié)舛确謩e為1.000 ng/mL的最低定量限樣品和2.000、60.00、1 200 ng/mL的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6個(gè)樣品，按“2.3”項(xiàng)方法操作，測(cè)定3批，根據(jù)每批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)樣品的實(shí)測(cè)濃度，用Excel軟件單因素方差分析計(jì)算批內(nèi)和批間精密度，同時(shí)計(jì)算每個(gè)樣品的相對(duì)偏差，結(jié)果顯示，最低定量限樣品批內(nèi)和批間RSD均小于20%，RE均在±20%范圍內(nèi)。低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品批內(nèi)和批間RSD均<15%，RE均在±15%范圍內(nèi)。
3.4 提取回收率 按精密度與準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)方法制備含氯沙坦?jié)舛确謩e為2.000、60.00、1 200 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)操作，以其進(jìn)樣得到的峰面積除以空白血漿經(jīng)蛋白沉淀后，直接加入低、中、高氯沙坦質(zhì)控系列工作液及內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦工作液后進(jìn)樣得到的峰面積，計(jì)算血漿中氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦的提取回收率。血漿中氯沙坦低、中、高濃度的提取回收率分別為107.8%±5.5%、103.1%±3.0%和103.5%±4.2%；厄貝沙坦的提取回收率為101.2%±1.7%。
3.5 基質(zhì)效應(yīng) 取6個(gè)不同來(lái)源的空白血漿190 μL置1.5 mL離心管中，分別加入甲醇600 μL沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，4 ℃離心(23 755×g)10 min，取空白上清液700 μL作為血漿基質(zhì)；另取純化水190 μL置離心管中，同法處理得對(duì)照基質(zhì)。分別取血漿基質(zhì)和對(duì)照基質(zhì)700 μL，加入氯沙坦質(zhì)控工作液10 μL和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦工作液50 μL，混勻，吸取400 μL該混勻溶液樣品置進(jìn)樣瓶中，加入水相200 μL，混勻。上述樣本每個(gè)濃度取6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及質(zhì)譜條件測(cè)定，獲得氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦峰面積，根據(jù)每一濃度樣本2種基質(zhì)中的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。血漿中氯沙坦低、中、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為97.6%±3.7%、97.0%±1.1%和100.2%±4.2%；厄貝沙坦的基質(zhì)效應(yīng)為98.2%±2.0%。
3.6 穩(wěn)定性 按“3.3”項(xiàng)下方法，分別制備低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控血漿樣品，各15份，每個(gè)濃度各取3份分別進(jìn)行如下考察：①-30 ℃反復(fù)凍融3次；②-30 ℃冰凍保存35 d；③室溫放置6 h；④待測(cè)樣品于自動(dòng)進(jìn)樣器4 ℃放置22 h；⑤血漿蛋白沉淀離心后，上清液樣品室溫放置6 h。按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定(除條件④直接進(jìn)樣測(cè)定，條件⑤吸取上清液400 μL和水相200 μL混勻)。所有血漿樣品實(shí)測(cè)濃度的RE均在±15%范圍內(nèi)，RSD≤15%。結(jié)果顯示，氯沙坦血漿樣品-30 ℃反復(fù)凍融3次、-30 ℃冰凍保存35 d和室溫放置6 h，待測(cè)樣品于自動(dòng)進(jìn)樣器4 ℃放置22 h，血漿蛋白沉淀離心后,上清液樣品室溫放置6 h情況下均穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)亦考察了氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，室溫放置6 h和2～8 ℃冷藏9 d情況下，氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦儲(chǔ)備液均穩(wěn)定。
3.7 生物等效性評(píng)價(jià) 完成試驗(yàn)的23例受試者口服受試和參比制劑氯沙坦鉀片后氯沙坦的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。Cmax幾何均值比90%置信區(qū)間為88.6%～128.0%，AUC0-12 h為95.1%～106.1%，AUC0-∞為95.0%～105.9%。以上結(jié)果符合《中華人民共和國(guó)藥典(2010版)》相關(guān)要求(Cmax在75%～133%范圍，且AUC在80%～125%范圍)，因此，判定受試制劑氯沙坦鉀片(100 mg)與參比制劑氯沙坦鉀片(科素亞?，100 mg)生物等效。
圖2 單劑量分別口服受試和參比制劑后氯沙坦的平均 血藥濃度-時(shí)間曲線表1 單劑量口服受試和參比制劑后氯沙坦的主要 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)
藥動(dòng)學(xué)參數(shù)受試制劑參比制劑t1/2(h)2.04±0.282.00±0.40tmax(h)1.23±0.381.37±0.75Cmax(ng/mL)697.3±301.7674.1±350.5AUC0-12h(ng·h/mL)994±2401005±287AUC0-∞(ng·h/mL)1002±2401014±289CL/F(L/h)104.7±22.4107.0±33.5Vd(L)308.9±87.3306.0±103.1F(%)102.4±21.1
4 討論
本研究對(duì)色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化考察，水相中加入乙酸銨，有利于氯沙坦和內(nèi)標(biāo)峰形的改善，未加入醋酸銨，色譜峰拖尾嚴(yán)重。另外,選擇0.2%甲酸時(shí),待測(cè)物的響應(yīng)較高且保留時(shí)間適中。血漿樣品沉淀蛋白，離心后，取上清液400 μL，并加入水相200 μL，是為了將進(jìn)樣樣品中水的比例提高至接近流動(dòng)相的比例，防止發(fā)生二次化學(xué)平衡現(xiàn)象，改善峰形。同時(shí)，上清液中加入水相，進(jìn)樣測(cè)定樣品含有的血漿內(nèi)源性基質(zhì)相對(duì)減少，避免了基質(zhì)效應(yīng)。
本研究建立的LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛?，特異性高，測(cè)定時(shí)間短，另外采用甲醇一步沉淀蛋白的血漿樣品前處理方法，操作簡(jiǎn)單快捷，發(fā)揮了LC-MS/MS法的快速定量?jī)?yōu)勢(shì)，可用于氯沙坦鉀片一致性評(píng)價(jià)研究。
本研究中，受試和參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2和tmax與文獻(xiàn)[2-7,10]基本一致，Cmax、AUC0-∞與文獻(xiàn)[7,10]基本一致。Cmax90%置信區(qū)間為88.6%～128.0%，不在2015版藥典要求的80.00%～125.00%范圍內(nèi)。若以2015版藥典為判定標(biāo)準(zhǔn)，則無(wú)法判定兩制劑生物等效，由此看來(lái)，我國(guó)生物等效性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)提高，與歐美國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)同步。
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Rapid determination of losartan in human plasma by LC-MS/MS and study on its bioequivalence
HUANG Ming,ZHANG Quan-ying*,ZONG Shun-lin
(Clinical Pharmacology Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China)
Objective To establish an LC-MS/MS method for the determination of losartan in human plasma,and evaluate the bioequivalence of losartan potassium tablet in healthy volunteers.Methods A single oral dose of test and reference formulations was given to 23 healthy male volunteers according to a randomized crossover design.Plasma concentration was determined by LC-MS/MS after deproteinized with methanol.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.2.3.Results The main pharmacokinetic parameters of losartan in test and reference preparations were as follows:Cmax(697.3±301.7) and (674.1±350.5) ng/mL,AUC0-12 h(994±240) and (1 005±287) ng·h/mL,tmax(1.23±0.38) and (1.37±0.75) h,t1/2(2.04±0.28) and (2.00±0.40) h,respectively.The relative bioavailability of test formulations was 102.4%±21.1%.Conclusion LC-MS/MS method is proved to be sensitive,convenient and accurate.Losartan potassium tablet is bioequivalent to the reference tablet.
Losartan;LC-MS/MS;Pharmacokinetics;Bioequivalence
2016-08-17
蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215004
*通信作者
10.14053/j.cnki.ppcr.201704021
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黃 明，張全英，宗順麟
LC-MS/MS快速測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛燃捌渖锏刃匝芯?/p>
黃 明，張全英*，宗順麟
目的 建立人血漿中氯沙坦LC-MS/MS測(cè)定方法，計(jì)算氯沙坦人體藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并評(píng)價(jià)兩制劑生物等效性。方法 采用單劑量雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，完成試驗(yàn)的23例受試者空腹口服受試或參比制劑氯沙坦鉀片100 mg后，用甲醇一步沉淀血漿蛋白，并用LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛?。用DAS 3.2.3軟件計(jì)算氯沙坦人體藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并評(píng)價(jià)兩制劑生物等效性。結(jié)果 服用受試和參比制劑后，血漿中氯沙坦的Cmax分別為(697.3±301.7)和(674.1±350.5) ng/mL，AUC0-12 h分別為(994±240)和(1 005±287)ng·h/mL，tmax分別為(1.23±0.38)和(1.37±0.75) h，t1/2分別為(2.04±0.28)和(2.00±0.40)h，生物利用度為102.4%±21.1%。結(jié)論 建立的分析測(cè)試方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，受試制劑與參比制劑生物等效。
氯沙坦；高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜方法；藥動(dòng)學(xué)；生物等效性
0 引言
氯沙坦鉀(Losartan potassium)是非肽類血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制AT1受體，降低血管阻力，具有良好的抗高血壓作用，主要用于高血壓的治療[1]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛鹊姆椒ㄓ蠬PLC法、LC-MS法和LC-MS/MS法。血漿樣品前處理方法有：①液液萃取法[2-7]：樣品經(jīng)提取、吹干、復(fù)溶等步驟后測(cè)定，操作繁瑣且提取回收率不高。②在線固相萃取法[8]：可獲得更干凈的樣品，但是流動(dòng)相中含有的三乙胺具有離子淬滅作用，且整套系統(tǒng)價(jià)格昂貴。③蛋白沉淀法[9]：樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白，檢測(cè)方法最低定量限為3.000 ng/mL。本研究建立了甲醇一步沉淀蛋白法處理氯沙坦血漿樣品，檢測(cè)方法最低定量限為1.000 ng/mL，低于文獻(xiàn)報(bào)道[2-10]，可用于氯沙坦鉀片一致性評(píng)價(jià)研究。
1 材料
1.1 儀器與試劑 液質(zhì)聯(lián)用儀：API-4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)AB Sciex公司；Agilent1200高效液相色譜儀，主要包含真空脫氣機(jī)、四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫器和柱溫箱，美國(guó)Agilent公司；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Analyst 1.4.2，AB Sciex公司。分析天平：XS 105DU型(Max2=41 g，d2=0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機(jī)：Heraeus Biofuge Stratos，德國(guó)Thermo公司。渦旋混合器：Vortex Genie-2，美國(guó)Scientific Industries公司。純水機(jī)：Milli-Q，美國(guó)MILLIPORE公司。甲醇和甲酸：HPLC級(jí)，TEDIA COMPANY。乙酸銨：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水：滅菌注射用水，安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。空白血漿來(lái)自健康志愿者。
1.2 試驗(yàn)藥物和對(duì)照品 氯沙坦鉀片(受試制劑，批號(hào)：31112002，規(guī)格100 mg/片)由浙江某制藥有限公司生產(chǎn)。氯沙坦鉀片(參比制劑，科素亞?，批號(hào)：120281，規(guī)格100 mg/片)由杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。氯沙坦鉀對(duì)照品(批號(hào)：100597-200501，分子量461.01，氯沙坦分子量422.91，純度100.0%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦對(duì)照品(批號(hào)：201111-8，純度100.0%)由浙江某制藥有限公司生產(chǎn)。
2 方法
2.1 色譜、質(zhì)譜條件 色譜條件：保護(hù)柱：Phenomenex Security GuardTMC18(4 mm×3.0 mm)；色譜柱：WATERS公司Xterra?RP18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-10 mmoL/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)=66∶34(v/v)；流速900 μL/min；分析時(shí)間7.0 min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃。
質(zhì)譜條件:電噴霧(ESI)離子源，正離子電離模式，霧化氣50 psi，加熱輔助氣60 psi，離子源溫度650 ℃，噴霧電壓4 500 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，氯沙坦檢測(cè)離子對(duì)m/z423.2→207.0，去簇電壓(DP) 60 V，射入電壓(EP) 10 V，碰撞能量(CE) 31 V，碰撞室射出電壓(CXP) 5 V。內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦檢測(cè)離子對(duì)m/z429.3→207.0，去簇電壓(DP) 70 V，射入電壓(EP) 10 V，碰撞能量(CE) 30 V，碰撞室射出電壓(CXP) 15 V。
2.2 工作液配制 氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液及工作液：稱量氯沙坦鉀對(duì)照品10.90 mg(相當(dāng)于氯沙坦 10.00 mg)于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋，得濃度為0.020 00、0.060 00、0.200 0、0.600 0、2.000、6.000、20.00、30.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液。
氯沙坦質(zhì)控儲(chǔ)備液及工作液：稱量氯沙坦鉀對(duì)照品10.90 mg(相當(dāng)于氯沙坦10.00 mg)于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的氯沙坦質(zhì)控儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋得濃度為0.040 00、1.200、24.00 μg/mL的質(zhì)控工作液。
內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦儲(chǔ)備液及工作液：稱量厄貝沙坦對(duì)照品10.00 mg于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦儲(chǔ)備液，并于100 mL量瓶用甲醇稀釋得0.100 0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦工作液。
2.3 血漿樣品前處理 取血漿樣品200 μL置1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦工作液50 μL，混勻，加甲醇600 μL沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，于4 ℃、23 755×g高速離心10 min。離心完畢后取上清液400 μL置進(jìn)樣瓶中，加入水相200 μL，混勻后，置于自動(dòng)進(jìn)樣器中進(jìn)樣測(cè)定氯沙坦?jié)舛取?/p>
2.4 人體藥代動(dòng)力學(xué)與生物等效性臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì) 臨床試驗(yàn)方案經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。24例男性受試者均簽署知情同意書，體重指數(shù)均在19～24 kg/m2范圍內(nèi)，心電圖正常，肝、腎功能正常，均符合受試者入選標(biāo)準(zhǔn)。采用隨機(jī)、雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。參加試驗(yàn)的24位受試者隨機(jī)分成2組，每組12例，分別于2個(gè)周期試驗(yàn)當(dāng)日空腹口服受試或參比制劑1片，250 mL溫開(kāi)水送服，清洗期為1周。于服藥前和服藥后0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h由肘靜脈取血3 mL。所有血漿樣品置肝素化采血管中，離心(2 304×g，4 ℃，5 min)，分離上層血漿，于-30 ℃冰箱中保存，待測(cè)。用DAS 3.2.3軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并評(píng)價(jià)受試與參比制劑的生物等效性。
3 結(jié)果
3.1 特異性 分別取氯沙坦對(duì)照品溶液、厄貝沙坦對(duì)照品溶液、空白血漿按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品，空白血漿190 μL和氯沙坦對(duì)照品溶液(2.000 μg/mL)10 μL混勻后按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品，受試者口服氯沙坦鉀片100 mg后 0.5 h的血漿按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，氯沙坦的保留時(shí)間約3.59 min，內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦的保留時(shí)間為4.34 min左右，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦的測(cè)定，見(jiàn)圖1。
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限 取空白血漿190 μL，分別加入氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液10 μL，制備成血漿中氯沙坦?jié)舛葹?.000、3.000、10.00、30.00、100.0、300.0、1 000、1 500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)方法操作，進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以氯沙坦?jié)舛菴為橫坐標(biāo)，氯沙坦峰面積As與內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦峰面積Ai比值f為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸(權(quán)重系數(shù)為1/C2)。回歸方程為f=0.009 1 C-0.000 011 3，r=0.999 4。結(jié)果表明，氯沙坦線性范圍為1.000～1 500 ng/mL，最低定量限LLOQ為1.000 ng/mL。
圖1 血漿中氯沙坦的LC-MS/MS圖
注：A.氯沙坦對(duì)照品溶液(100.0 ng/mL),B.厄貝沙坦對(duì)照品溶液(25.00 ng/mL),C.空白血漿,D.空白血漿190 μL和氯沙坦對(duì)照品溶
液(2.000 μg/mL)10 μL混勻后按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品(血漿含氯沙坦100.0 ng/mL),E.受試者口服氯沙坦鉀片100 mg后0.5 h的
血漿按“2.3”項(xiàng)方法操作后樣品(血漿含氯沙坦262.4 ng/mL)
3.3 精密度與準(zhǔn)確度 取空白血漿190 μL，分別加入氯沙坦最低定量限和質(zhì)控工作液10 μL，制備成血漿中氯沙坦?jié)舛确謩e為1.000 ng/mL的最低定量限樣品和2.000、60.00、1 200 ng/mL的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6個(gè)樣品，按“2.3”項(xiàng)方法操作，測(cè)定3批，根據(jù)每批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)樣品的實(shí)測(cè)濃度，用Excel軟件單因素方差分析計(jì)算批內(nèi)和批間精密度，同時(shí)計(jì)算每個(gè)樣品的相對(duì)偏差，結(jié)果顯示，最低定量限樣品批內(nèi)和批間RSD均小于20%，RE均在±20%范圍內(nèi)。低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品批內(nèi)和批間RSD均<15%，RE均在±15%范圍內(nèi)。
3.4 提取回收率 按精密度與準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)方法制備含氯沙坦?jié)舛确謩e為2.000、60.00、1 200 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)操作，以其進(jìn)樣得到的峰面積除以空白血漿經(jīng)蛋白沉淀后，直接加入低、中、高氯沙坦質(zhì)控系列工作液及內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦工作液后進(jìn)樣得到的峰面積，計(jì)算血漿中氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦的提取回收率。血漿中氯沙坦低、中、高濃度的提取回收率分別為107.8%±5.5%、103.1%±3.0%和103.5%±4.2%；厄貝沙坦的提取回收率為101.2%±1.7%。
3.5 基質(zhì)效應(yīng) 取6個(gè)不同來(lái)源的空白血漿190 μL置1.5 mL離心管中，分別加入甲醇600 μL沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，4 ℃離心(23 755×g)10 min，取空白上清液700 μL作為血漿基質(zhì)；另取純化水190 μL置離心管中，同法處理得對(duì)照基質(zhì)。分別取血漿基質(zhì)和對(duì)照基質(zhì)700 μL，加入氯沙坦質(zhì)控工作液10 μL和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦工作液50 μL，混勻，吸取400 μL該混勻溶液樣品置進(jìn)樣瓶中，加入水相200 μL，混勻。上述樣本每個(gè)濃度取6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及質(zhì)譜條件測(cè)定，獲得氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦峰面積，根據(jù)每一濃度樣本2種基質(zhì)中的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。血漿中氯沙坦低、中、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為97.6%±3.7%、97.0%±1.1%和100.2%±4.2%；厄貝沙坦的基質(zhì)效應(yīng)為98.2%±2.0%。
3.6 穩(wěn)定性 按“3.3”項(xiàng)下方法，分別制備低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控血漿樣品，各15份，每個(gè)濃度各取3份分別進(jìn)行如下考察：①-30 ℃反復(fù)凍融3次；②-30 ℃冰凍保存35 d；③室溫放置6 h；④待測(cè)樣品于自動(dòng)進(jìn)樣器4 ℃放置22 h；⑤血漿蛋白沉淀離心后，上清液樣品室溫放置6 h。按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定(除條件④直接進(jìn)樣測(cè)定，條件⑤吸取上清液400 μL和水相200 μL混勻)。所有血漿樣品實(shí)測(cè)濃度的RE均在±15%范圍內(nèi)，RSD≤15%。結(jié)果顯示，氯沙坦血漿樣品-30 ℃反復(fù)凍融3次、-30 ℃冰凍保存35 d和室溫放置6 h，待測(cè)樣品于自動(dòng)進(jìn)樣器4 ℃放置22 h，血漿蛋白沉淀離心后,上清液樣品室溫放置6 h情況下均穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)亦考察了氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，室溫放置6 h和2～8 ℃冷藏9 d情況下，氯沙坦和內(nèi)標(biāo)厄貝沙坦儲(chǔ)備液均穩(wěn)定。
3.7 生物等效性評(píng)價(jià) 完成試驗(yàn)的23例受試者口服受試和參比制劑氯沙坦鉀片后氯沙坦的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。Cmax幾何均值比90%置信區(qū)間為88.6%～128.0%，AUC0-12 h為95.1%～106.1%，AUC0-∞為95.0%～105.9%。以上結(jié)果符合《中華人民共和國(guó)藥典(2010版)》相關(guān)要求(Cmax在75%～133%范圍，且AUC在80%～125%范圍)，因此，判定受試制劑氯沙坦鉀片(100 mg)與參比制劑氯沙坦鉀片(科素亞?，100 mg)生物等效。
圖2 單劑量分別口服受試和參比制劑后氯沙坦的平均 血藥濃度-時(shí)間曲線表1 單劑量口服受試和參比制劑后氯沙坦的主要 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)
藥動(dòng)學(xué)參數(shù)受試制劑參比制劑t1/2(h)2.04±0.282.00±0.40tmax(h)1.23±0.381.37±0.75Cmax(ng/mL)697.3±301.7674.1±350.5AUC0-12h(ng·h/mL)994±2401005±287AUC0-∞(ng·h/mL)1002±2401014±289CL/F(L/h)104.7±22.4107.0±33.5Vd(L)308.9±87.3306.0±103.1F(%)102.4±21.1
4 討論
本研究對(duì)色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化考察，水相中加入乙酸銨，有利于氯沙坦和內(nèi)標(biāo)峰形的改善，未加入醋酸銨，色譜峰拖尾嚴(yán)重。另外,選擇0.2%甲酸時(shí),待測(cè)物的響應(yīng)較高且保留時(shí)間適中。血漿樣品沉淀蛋白，離心后，取上清液400 μL，并加入水相200 μL，是為了將進(jìn)樣樣品中水的比例提高至接近流動(dòng)相的比例，防止發(fā)生二次化學(xué)平衡現(xiàn)象，改善峰形。同時(shí)，上清液中加入水相，進(jìn)樣測(cè)定樣品含有的血漿內(nèi)源性基質(zhì)相對(duì)減少，避免了基質(zhì)效應(yīng)。
本研究建立的LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中氯沙坦?jié)舛?，特異性高，測(cè)定時(shí)間短，另外采用甲醇一步沉淀蛋白的血漿樣品前處理方法，操作簡(jiǎn)單快捷，發(fā)揮了LC-MS/MS法的快速定量?jī)?yōu)勢(shì)，可用于氯沙坦鉀片一致性評(píng)價(jià)研究。
本研究中，受試和參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2和tmax與文獻(xiàn)[2-7,10]基本一致，Cmax、AUC0-∞與文獻(xiàn)[7,10]基本一致。Cmax90%置信區(qū)間為88.6%～128.0%，不在2015版藥典要求的80.00%～125.00%范圍內(nèi)。若以2015版藥典為判定標(biāo)準(zhǔn)，則無(wú)法判定兩制劑生物等效，由此看來(lái)，我國(guó)生物等效性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)提高，與歐美國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)同步。
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Rapid determination of losartan in human plasma by LC-MS/MS and study on its bioequivalence
HUANG Ming,ZHANG Quan-ying*,ZONG Shun-lin
(Clinical Pharmacology Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China)
Objective To establish an LC-MS/MS method for the determination of losartan in human plasma,and evaluate the bioequivalence of losartan potassium tablet in healthy volunteers.Methods A single oral dose of test and reference formulations was given to 23 healthy male volunteers according to a randomized crossover design.Plasma concentration was determined by LC-MS/MS after deproteinized with methanol.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.2.3.Results The main pharmacokinetic parameters of losartan in test and reference preparations were as follows:Cmax(697.3±301.7) and (674.1±350.5) ng/mL,AUC0-12 h(994±240) and (1 005±287) ng·h/mL,tmax(1.23±0.38) and (1.37±0.75) h,t1/2(2.04±0.28) and (2.00±0.40) h,respectively.The relative bioavailability of test formulations was 102.4%±21.1%.Conclusion LC-MS/MS method is proved to be sensitive,convenient and accurate.Losartan potassium tablet is bioequivalent to the reference tablet.
Losartan;LC-MS/MS;Pharmacokinetics;Bioequivalence
2016-08-17
蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215004
*通信作者
10.14053/j.cnki.ppcr.201704021
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