胡蓉花，程淑君，王建峰，羅建軍，劉瓊光

（1.江西省吉安市煙草公司，江西 吉安 343009；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

不同培養(yǎng)條件對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響

胡蓉花1，程淑君2，王建峰1，羅建軍2，劉瓊光2

（1.江西省吉安市煙草公司，江西 吉安 343009；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

比較了9種陽(yáng)離子、碳源、氮源和pH值對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，不同陽(yáng)離子對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的影響具有差異，在1 mmol/L濃度條件下，Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+等離子間對(duì)青枯菌生長(zhǎng)影響差異較小，而與Cu2+、Al3+差異較大；在10 mmol/L濃度條件下，Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Al3+等離子顯著抑制青枯菌生長(zhǎng)；在30 mmol/L濃度條件下，Ca2+、K+明顯抑制青枯菌生長(zhǎng)，而Mg2+在60 mmol/L濃度下，仍青枯菌生長(zhǎng)良好。此外，研究結(jié)果還表明，青枯菌生長(zhǎng)最適宜的pH值為7，最適宜的碳源為蔗糖，最適宜的氮源為蛋白胨，硝態(tài)氮氮源不利于青枯菌生長(zhǎng)。

煙草青枯病菌；陽(yáng)離子；碳氮源；pH值

由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum，俗稱(chēng)青枯菌）引起的煙草青枯病，是煙草的毀滅性病害之一，也是典型的土傳病害。作物青枯病在我國(guó)華東、西南和華南地區(qū)發(fā)生尤為嚴(yán)重，目前尚未有理想的防治藥劑和有效措施［1-2］。植物抵抗病害的能力與其營(yíng)養(yǎng)水平密切相關(guān)，平衡施肥技術(shù)從植物保護(hù)的角度來(lái)講，既要保證作物的最佳生長(zhǎng)，又要兼顧使作物獲得最大抗性［3］。礦質(zhì)元素是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，包括大量元素和微量元素，其中有些礦質(zhì)元素對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒等病原物引起的侵染性病害有顯著影響［4］。礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)以多種不同的方式影響土傳病害的發(fā)生和病原菌的生長(zhǎng)［5］。無(wú)論是在室內(nèi)還是在田間條件下，礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)對(duì)各種植物病害的發(fā)生發(fā)展均有一定影響［6］，但其作用機(jī)理尚不十分清楚。。

目前，關(guān)于營(yíng)養(yǎng)與青枯病關(guān)系方面的研究主要集中在有機(jī)肥或有機(jī)土壤改良劑［7-8］，單從某種或幾種礦質(zhì)元素與青枯病發(fā)生關(guān)系的研究相對(duì)較少，盡管也有少量文獻(xiàn)報(bào)道某些元素對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的影響［9］，但是研究還不完善和深入。況且，來(lái)自不同地域的青枯菌，對(duì)一些營(yíng)養(yǎng)元素的利用能力和敏感水平可能存在差異。本研究分析了不同的碳源、氮源及9種陽(yáng)離子對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響，以期為青枯病防治的新型植物保護(hù)劑的研發(fā)和生產(chǎn)上青枯病的有效防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：煙草青枯病菌菌株Tb590，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)菌研究室保存提供。測(cè)定時(shí)，先將菌株活化，取單菌落接種到LB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)24 h，用于各項(xiàng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、氯化鈉 5 g/L，pH7.0。

不同陽(yáng)離子培養(yǎng)基配制：在LB培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上分別加入CaCl2、KCl、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、AlCl3、FeCl3、MnSO4等試劑，每種陽(yáng)離子各自配制成終濃度為1、10、30、60、90 mmol/L的LB培養(yǎng)液，用HCl或NaOH調(diào)整pH值為7，試管分裝，每管5 mL，消毒滅菌。所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母膏 10 g/L、NaH2PO40.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.1 g/L。

氮源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、Na2HPO42.13 g/L、KH2PO41.36 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.005 g/L、FeSO4·7H2O 0.5 mg/L。

1.2 不同陽(yáng)離子對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的影響測(cè)定方法

取培養(yǎng)24 h的新鮮Tb590菌液50 μL，分別接種到陽(yáng)離子培養(yǎng)液中，每種陽(yáng)離子每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，30℃搖床培養(yǎng)24h。以接種和不接種培養(yǎng)0 h的LB培養(yǎng)基為對(duì)照，用分光亮度計(jì)測(cè)定λ = 600 nm的光吸收值（OD600）。

1.3 不同pH對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響

在LB培養(yǎng)基中，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)其pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10。接種青枯菌和測(cè)定方法同1.2。

1.4 不同碳、氮源對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響

以1%的量分別將葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油加入碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制成不同碳源培養(yǎng)基；以1%的量分別加入NaNO3、NH4H2PO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等制成不同氮源培養(yǎng)基。接種青枯菌和測(cè)定方法同1.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同陽(yáng)離子對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響

不同濃度Ca2+對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的影響具有明顯差異。Ca2+濃度為1 mmol/L和10 mmol/L時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)較好，OD600均為1.0左右。當(dāng)Ca2+濃度≥30 mmol/L時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)受到明顯抑制，OD600降為0.0805，且Ca2+濃度為90 mmol/L時(shí)，完全抑制了青枯菌的生長(zhǎng)（表1）。

從表1可以看出，K+濃度為10 mmol/L和1 mmol/L時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)較好，當(dāng)K+濃度≥30 mmol/L時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。當(dāng)Mg2+濃度≤60 mmol/L時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)較好，且它們之間的OD600值差異不明顯；只有當(dāng)Mg2+濃度≥90 mmol/L時(shí)，青枯菌的生長(zhǎng)才受到明顯的抑制。

表1 不同離子濃度對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響

不同濃度的Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的測(cè)定結(jié)果（表1）表明，當(dāng)濃度為1 mmol/L時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)較好，而當(dāng)其濃度≥10 mmol/L時(shí)，青枯菌的生長(zhǎng)則受到明顯抑制。但Fe2+濃度為60 mmol/L和90 mmol/L，其OD值稍高于30 mmol/L時(shí)，可能是實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致，有待進(jìn)一步研究。

不同濃度Al3+對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的測(cè)定結(jié)果（表1）表明，Al3+濃度為10 mmol/L時(shí)，其生長(zhǎng)明顯比在1 mmol/L和30 mmol/L濃度下要好，當(dāng)Al3+濃度≥60 mmol/L時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。

此外，從表1還可以看出，濃度為1 mmol/L時(shí)不同陽(yáng)離子對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的影響具有明顯差異，且在此濃度下，Mg2+、 Fe3+、Fe2+對(duì)青枯菌生長(zhǎng)較好。Ca2+、K+、Mn2+和Zn2+對(duì)青枯菌生長(zhǎng)受到一定影響，且與Mg2+、 Fe3+、Fe2+差異顯著。Cu2+和 Al3+對(duì)青枯菌生長(zhǎng)受到明顯抑制，與其他各離子均有顯著差異。

當(dāng)陽(yáng)離子濃度為10 mmol/L時(shí)，Mg2+對(duì)青枯菌生長(zhǎng)最好，其次是Ca2+和K+，Cu2+、Mn2+、Al3+、 Fe3+、Fe2+和Zn2+對(duì)青枯菌生長(zhǎng)受到明顯抑制，與Ca2+、K+差異顯著。當(dāng)陽(yáng)離子濃度為30 mmol/L時(shí)，除了Mg2+對(duì)青枯菌生長(zhǎng)影響較小外，其他離子均明顯抑制青枯菌生長(zhǎng)，且與10 mmol/L濃度的生長(zhǎng)差異顯著。

綜合分析以上結(jié)果，表明煙草青枯菌能在1 mmol/L和10 mmol/L 的Ca2+、K+、Mg2+離子條件下較好地生長(zhǎng)，其中Mg2+對(duì)青枯菌生長(zhǎng)影響較小；9種陽(yáng)離子在較高濃度（90 mmol/L）下對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)均具有抑制作用，其中Ca2+和Cu2+抑菌作用最明顯。在同一濃度10 mmol/L下，Mg2+對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)最好，其次是Ca2+和K+離子，Cu2+、Zn2+和Fe2+離子對(duì)青枯菌抑菌作用較明顯。研究結(jié)果還表明，1mmol/L濃度的不同陽(yáng)離子對(duì)青枯菌生長(zhǎng)影響較小，青枯菌生長(zhǎng)較好，但1 mmol/L的Cu2+和Al3+離子對(duì)青枯菌生長(zhǎng)有抑制作用。

2.2 不同pH對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響

煙草青枯病菌在pH3～9條件下均能生長(zhǎng)，pH6～8生長(zhǎng)較好，其中pH7生長(zhǎng)最好，為最適宜pH，pH6較pH8生長(zhǎng)好（表2）。

2.3 不同碳、氮源對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響

測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草青枯菌在不同碳源培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)差異不顯著，但在以蔗糖和甘露醇為唯一碳源的條件下生長(zhǎng)較好（表2）。

測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草青枯菌在不同的氮源條件下生長(zhǎng)存在差異，在NaNO3條件下生長(zhǎng)受到抑制，而在蛋白胨和牛肉膏條件下生長(zhǎng)較好，其中蛋白胨中生長(zhǎng)最好。NaNO3和NH4Cl等無(wú)機(jī)氮對(duì)其生長(zhǎng)不利（表2）。

3 結(jié)論與討論

以往研究表明，鈣營(yíng)養(yǎng)對(duì)番茄青枯病具有較好的控病效果，增加營(yíng)養(yǎng)液中鈣濃度可減輕青枯病嚴(yán)重度［10］。低、中、高鈣濃度處理番茄，青枯病的嚴(yán)重度分別為100%、77.1%和56.8%，表明鈣能降低青枯病的發(fā)生［11］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ca2+濃度≥30 mmol/L時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)受到明顯抑制，與濃度為10 mmol/L的差異顯著。且Ca2+濃度為90 mmol/L時(shí)，完全抑制了青枯菌的生長(zhǎng)。由此推測(cè)，高濃度鈣能降低青枯病的發(fā)生可能與其具有抑制青枯菌生長(zhǎng)有關(guān)，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 不同pH值、碳源和氮源對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的影響

鄭世燕等［12］室內(nèi)試驗(yàn)表明，在保證煙株正常生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ)上增施Ca、B、Mg、Mo 等4種礦質(zhì)元素對(duì)煙草青枯病均有一定的控病效果。吳衛(wèi)玲［13］研究表明，硼酸鈉對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌效果與其濃度呈正相關(guān)，當(dāng)硼酸鈉濃度≥0.5 mmol/L時(shí)，對(duì)煙草青枯病菌的生長(zhǎng)有顯著影響，本研究也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象（結(jié)果未顯示）。

譚軍等［9］研究指出，在添加有微量元素的培養(yǎng)基中，鋅和銅對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)影響較大，當(dāng)鈣濃度為 2 mmol/L 時(shí)，青枯菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制。本研究的9種陽(yáng)離子對(duì)青枯菌生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果表明，在1 mmol/L濃度條件下，Ca2+、Zn2+、Cu2+、Al3+等離子對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的抑制作用最明顯，基本上支持譚軍等［9］的研究結(jié)果。然而，譚軍等［9］設(shè)定的離子濃度范圍較小，最高濃度只有2 mmol/L，不能真實(shí)反映影響青枯菌停止生長(zhǎng)的最大濃度，而本研究測(cè)定的離子濃度范圍較大，能較好反映隨著離子濃度升高，明顯抑制青枯菌生長(zhǎng)的真實(shí)情況。如Mg2+只有在較高濃度（90 mmol/L）時(shí)，青枯菌生長(zhǎng)才明顯受到抑制，而在1～60 mmol/L范圍內(nèi)，Mg2+對(duì)青枯菌生長(zhǎng)并無(wú)明顯抑制作用。綜合本研究結(jié)果表明，不同陽(yáng)離子影響青枯菌生長(zhǎng)的濃度范圍不完全一致，這為生產(chǎn)上植物的平衡施肥提供了有價(jià)值的參考。

本研究在測(cè)定不同陽(yáng)離子對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的抑制作用時(shí)，所使用的化學(xué)試劑分別為CaCl2、KCl、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、AlCl3、FeCl3和MnSO4等，其中的陰離子均為Cl-和SO42-。譚軍等［9］通過(guò)在培養(yǎng)基中加入Na2SO4并設(shè)置培養(yǎng)基終濃度為0.5～5 g/L等6個(gè)濃度梯度時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同濃度SO42-對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的影響不明顯。而關(guān)于氯離子對(duì)青枯菌的影響也較少［14］，因此，我們認(rèn)為，本研究不同陽(yáng)離子對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的測(cè)定結(jié)果真實(shí)可靠，Cl-和SO42-對(duì)煙草青枯菌生長(zhǎng)的影響不大，對(duì)本研究結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生較大影響。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是微生物新陳代謝和一切生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，失去這個(gè)基礎(chǔ)，生命將停止。本研究結(jié)果表明，煙草青枯菌最適生長(zhǎng)的pH為7，相對(duì)來(lái)說(shuō)，青枯菌在堿性條件下比在酸性條件下生長(zhǎng)更差，抑制作用更明顯，這與生產(chǎn)上通過(guò)增施石灰、提高土壤堿性［15］抑制青枯菌數(shù)量，達(dá)到減輕青枯病目的相符合。此外，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，煙草青枯菌在蛋白胨和牛肉膏等有機(jī)氮中生長(zhǎng)較好，而在以NH4Cl和NaNO3為氮源的無(wú)機(jī)氮中生長(zhǎng)明顯受抑制，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中，可通過(guò)施用硝態(tài)氮，控制煙草青枯病的發(fā)生。

本研究結(jié)果為煙葉生產(chǎn)上的青枯病防治提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)，生產(chǎn)上可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控措施，較大限度地抑制病原菌的生長(zhǎng)，從而達(dá)到控制作物青枯病的目的。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Influence of different culture conditions on Ralstonia solanacearum growth

HU Rong-hua1，CHENG Shu-jun2，WANG Jian-feng1，LUO Jian-jun2，LIU Qiong-guang2
（1.Ji’an Municipal Tobacco Company，Ji’an 343009，China；2. College of Agriculture， South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Tobacco bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is a widespread and serious disease in China and is difficult to control. Nutrition is the material basis of microbial metabolism and all life activities. Analyzing the effects of nutrition elements on the growth of R. solanacearum is important for inhibiting the growth of pathogenic bacteria through nutrition regulation measures so as to the bacterial wilt disease control. The growth of R. solanacearum under nine kinds of cations，carbon source，nitrogen source and pH were compared in this study. The results showed that R. solanacearum growth under different cations was different. Under the concentration of 1 mmol/L，little influence of Ca2+，K+，Mg2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+were observed on R. solanacearum growth，and their effects were different from Cu2+and Al3+. Under the conditions of 10 mmol/L of Mn2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Cu2+and Al3+respectively，the R. solanacearum growth was inhibited significantly. When the concentration of Ca2+and K+was 30 mmol/L，the R. solanacearum growth was inhibited，while the concentration of Mg2+was 60 mmol/L，R. solanacearum grew well. In addition，the results also showed that pH value 7，sucrose and peptone were the best for R. solanacearum growth. Nitrate nitrogen source was against R. solanacearum growth.

Ralstonia solanacearum；cation；carbon and nitrogen sources；pH

S432.4+2

A

1004-874X（2017）02-0124-05

2016-09-15

中國(guó)煙草總公司江西省公司科技項(xiàng)目（贛煙司［2015］7 號(hào)，贛煙司［2016］81 號(hào)）；江西省吉安市煙草專(zhuān)賣(mài)局（公司）科技項(xiàng)目（吉煙科［2014］3 號(hào)）；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303015-07）

胡蓉花（1970-），女，高級(jí)農(nóng)藝師，E-mail：1908479316@qq.com

劉瓊光（1964-），男，博士，副教授，E-mail：qgliu@scau.edu.

胡蓉花，程淑君，王建峰，等. 不同培養(yǎng)條件對(duì)煙草青枯病菌生長(zhǎng)的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（2）：124-128.