李凌云，吳 華，許曉敏，林 桓，黃曉冬，鄭姝寧，劉新艷，徐東輝*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.安捷倫科技(中國)有限公司，北京 100102)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測花生中36種農(nóng)藥及其代謝物殘留

李凌云1，吳 華2，許曉敏1，林 桓1，黃曉冬1，鄭姝寧1，劉新艷1，徐東輝1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.安捷倫科技(中國)有限公司，北京 100102)

建立了花生中36種農(nóng)藥及其代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)快速檢測技術(shù)。采用乙腈提取，增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化劑(EMR-Lipid)凈化，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式測定。結(jié)果表明，所有農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.994，在0.005，0.01，0.10 mg/kg 3個加標(biāo)水平下，36種農(nóng)藥的平均回收率為70.4%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為1.3%～19.4%，方法的定量下限為0.002 5～0.05 mg/kg。該方法簡便、快速，靈敏度高、凈化效果好，適用于花生中農(nóng)藥多殘留的快速檢測分析。

農(nóng)藥殘留；花生；脂質(zhì)去除；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)

花生是我國重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物，在人們的日常生活中具有不可忽略的作用。由于花生在種植過程中易受多種病蟲害的侵襲，需使用大量的農(nóng)藥加以防治，因此造成花生中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的現(xiàn)象日益嚴(yán)重?；ㄉ某煞址浅?fù)雜，除了多糖、蛋白質(zhì)和色素等物質(zhì)外，還包含豐富的油脂[1]。這些油脂可與許多親脂性農(nóng)藥互溶，嚴(yán)重干擾了目標(biāo)農(nóng)藥與基質(zhì)的有效分離，給農(nóng)藥的殘留分析帶來了很大的困難。因此，去除油脂，消除基質(zhì)干擾，是建立花生基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留分析技術(shù)的關(guān)鍵。

目前用于高油脂樣品分析的前處理方法主要有固相萃取[2-5]、液液萃取[6]、凝膠色譜[7-10]和基質(zhì)固相分散萃取[11]等。但這些方法溶劑消耗量大，且后續(xù)仍需繁瑣的凈化步驟，耗時長，不利于農(nóng)殘樣品的大批量處理和農(nóng)藥事件的應(yīng)急處理。近年來廣泛應(yīng)用的QuEChERs方法[12-14]，在處理含油脂樣品時多采用PSA+C18混合吸附劑去除油脂，但是PSA對酸類農(nóng)藥有吸附，易造成這些農(nóng)藥的測定結(jié)果偏低。增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化劑(Enhanced matrix removal-lipid，EMR-Lipid)是一種新型高聚物吸附劑，可以有效吸附各類脂類化合物。吳巖等[15]曾將EMR-Lipid用于玉米中三嗪類除草劑的凈化，發(fā)現(xiàn)EMR-Lipid能有效去除玉米基質(zhì)對農(nóng)藥殘留的干擾。EMR-Lipid在油脂含量更高的花生中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了44種農(nóng)藥在花生中的最大殘留限量，但針對這些農(nóng)藥在花生中的多殘留快速檢測方法尚未建立。本研究選擇具有最大殘留限量的36 種農(nóng)藥及其代謝物作為研究對象，通過使用EMR-Lipid材料改進(jìn)QuEChERs凈化步驟，建立了花生中36種農(nóng)藥多殘留的UHPLC-MS/MS快速檢測技術(shù)。該方法操作簡單、省時、去脂效果好、回收率高，適用于大批量花生樣品中農(nóng)藥殘留的快速檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-30A超高效液相色譜儀，LC-MS/MS-8050三重四極桿質(zhì)譜儀均購自日本Shimadzu公司。

乙腈、甲醇、丙酮(HPLC級，美國JT Baker公司)；乙酸銨(HPLC級，美國Fluka公司)；甲酸(HPLC級，Dikma科技)；水(純凈水，Milli-Q超純水儀制備)；增強(qiáng)型脂質(zhì)去除分散劑(Agilent Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid，美國安捷倫公司)；36種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度>96%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；其他試劑均為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)農(nóng)藥的溶解度選用甲醇或丙酮進(jìn)行溶解，定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。準(zhǔn)確量取一定體積的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇定容，得到含36種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，-20 ℃保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品制備與提取 將花生仁粉碎，過20目篩，混勻，作為試樣。精確稱取5.00 g樣品于100 mL離心管中，分別加入3 mL水和25 mL乙腈，使用勻漿機(jī)高速勻漿2 min后，加入2 g氯化鈉和2 g無水硫酸鎂，劇烈振搖1 min，5 000 r/min離心3 min，上清液待凈化。

1.3.2 樣品凈化 加入3 mL水活化EMR-Lipid除脂分散劑，混合搖勻，然后加入上清液5.00 mL，劇烈振搖1 min，5 000 r/min 離心3 min，離心后的全部溶液轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入1 g 氯化鈉和1 g無水硫酸鎂的15 mL離心管中，劇烈振搖1 min，5 000 r/min離心3 min，上層乙腈相過0.22 μm濾膜，供UHPLC-MS/MS測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH HSS C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相：A相為甲醇；B相為0.1%甲酸乙酸銨水溶液(1 mmol/L)；梯度洗脫條件：0 min，20%；0～2 min，20%～60% A；2～14 min，60%～85% A；14～14.1 min，85%～95% A；14.1～17 min，95% A；17～17.1 min，95%～20% A；17.1～22 min，20% A；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

ESI離子源；接口電壓4 000 V；正離子掃描；MRM監(jiān)測模式；霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量10 L/min，以上2種氣體均為氮?dú)?，加熱氣流?0 L/min，該氣體為空氣；接口溫度300 ℃；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；碰撞氣壓力2.7×105Pa，該氣體為氬氣。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將36種農(nóng)藥分別配制成100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。不接色譜柱，標(biāo)準(zhǔn)溶液通過液相色譜注入質(zhì)譜，進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描確定各農(nóng)藥的準(zhǔn)分子離子峰。利用儀器自動優(yōu)化功能，優(yōu)化二級碎片離子信息，獲得定量和定性離子及質(zhì)譜參數(shù)Q1(Quadrupole 1),Q3(Quadrupole 3)和碰撞能量(CE)，相關(guān)參數(shù)見表1。

2.2 流動相的優(yōu)化

以乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸銨水溶液和甲醇-甲酸乙酸銨水溶液分別作為流動相，考察了其對花生仁空白基質(zhì)中36種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果。結(jié)果表明，甲醇-水作流動相時，敵百蟲、高效氟吡甲禾靈等農(nóng)藥的靈敏度明顯優(yōu)于乙腈-水流動相。體系中加入乙酸胺，農(nóng)藥的靈敏度會進(jìn)一步提高。另外由于36種農(nóng)藥均采用正離子掃描模式，流動相中加入少量甲酸有助于化合物電離，從而提高分析靈敏度。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-0.1%甲酸乙酸銨水溶液(1.0 mmol/L)作為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，36種農(nóng)藥得到了最佳分離(見圖1)。

圖1 花生仁空白基質(zhì)中36種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM總離子流圖(0.05 mg/kg)Fig.1 Total ion chromatogram of peanut blank matrix spiked with 36 pesticides mixed standard solution at 0.05 mg/kg in MRM mode the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.3 乙腈用量的優(yōu)化

比較了乙腈用量對農(nóng)藥提取效率的影響。稱取5 g樣品，分別用5，10，20，25 mL乙腈進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，在36種農(nóng)藥中，多菌靈的測定受乙腈用量的影響較大，5 mL乙腈提取時，多菌靈的回收率只有50%，而使用25 mL乙腈提取時，回收率則提高至82.9%。因此本實(shí)驗(yàn)初步確定乙腈提取液的體積為25 mL。研究發(fā)現(xiàn)，僅用乙腈作為提取劑，噻吩磺隆的回收率不足70.0%，嘗試向花生中加入一定量的水，再用乙腈提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噻吩磺隆的提取效率得到明顯改善。這可能是由于水分子占據(jù)了噻吩磺隆在花生中的吸附位點(diǎn)，從而使噻吩磺隆更易被提取出。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)對花生中水的加入量進(jìn)行了優(yōu)化，比較了分別加入3，5，10 mL水對農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加水量為3 mL時，噻吩磺隆的回收率為85%，此時，其它農(nóng)藥的回收率無明顯變化。但隨著加水量的進(jìn)一步增大，弱極性農(nóng)藥毒死蜱的回收率明顯降低。所以本實(shí)驗(yàn)最終選擇加水量為3 mL。

2.4 EMR-Lipid活化水用量的優(yōu)化

與傳統(tǒng)吸附劑不同，EMR-Lipid需要額外加入水進(jìn)行活化。本實(shí)驗(yàn)對活化EMR-Lipid的水量進(jìn)行了優(yōu)化，比較了加水量3，5，10 mL時對測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，加水量對保留時間較大的化合物影響明顯大于保留時間較小的化合物，如保留時間較小的3-羥基克百威，在3種不同加水量下的回收率分別為98.3%，97.5%和98.6%，保留時間較大的毒死蜱回收率分別為85.8%，76.8%和42%。由此可見，加水量過大，會導(dǎo)致弱極性農(nóng)藥的回收率降低，因此本實(shí)驗(yàn)最終使用3 mL水活化EMR-Lipid。

圖2 36種農(nóng)藥在花生基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects of 36 pesticides in peanut matrix the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

本文采用較為常用的相對響應(yīng)值法評價基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)=(B/A-1)×100%[16]，A為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應(yīng)值；B為花生基質(zhì)中添加相同濃度農(nóng)藥的響應(yīng)值。正數(shù)表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，負(fù)數(shù)表示基質(zhì)抑制效應(yīng)。研究結(jié)果見圖2，除了烯草酮和精吡氟禾草靈的基質(zhì)效應(yīng)分別為13.6%和17.4%以外，其它34種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)絕對值均在0%～10%之間，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。由此可見，EMR-Lipid 能有效去除花生中的油脂，消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 方法的線性范圍、線性關(guān)系與定量下限

采用空白的花生基質(zhì)溶液，準(zhǔn)確配制含量分別為0.50，1.0，2.5，5.0，10，25，50，100，250 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行LC-MS/MS測定，以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x,μg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到36種農(nóng)藥的線性回歸方程，各農(nóng)藥的線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表1。所有農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)(r)為0.994 2～0.999 9。其中甲基異柳磷的線性范圍為5～250 μg/L，特丁硫磷、甲草胺和乙草胺的線性范圍為1.0～250 μg/L，其余32種農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的線性范圍均為0.5～250 μg/L。

定量下限采用加標(biāo)回收進(jìn)行驗(yàn)證，符合一定的準(zhǔn)確度和精密度要求的最低加標(biāo)濃度，確定為定量下限。結(jié)果顯示，36種農(nóng)藥的LOQs為0.002 5～0.05 mg/kg(見表1)，其中克百威、甲霜靈等13種農(nóng)藥的LOQ為0.002 5 mg/kg，噻吩磺隆、丙線磷等22種農(nóng)藥的LOQ為0.005 mg/kg，甲基異柳磷的LOQ為0.05 mg/kg。所有農(nóng)藥的LOQ均低于GB 2763-2014最大殘留限量要求。

2.7 方法的回收率與精密度

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-外標(biāo)法定量，在花生基質(zhì)中添加36種農(nóng)藥及其代謝物進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為0.005，0.01，0.1 mg/kg，每個加標(biāo)水平重復(fù)6次。36種農(nóng)藥在3個加標(biāo)水平下的平均回收率為70.4%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～19.4%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表1 36種農(nóng)藥的保留時間、MRM離子對、碰撞能量、定量下限(LOQs)以及花生基質(zhì)中的加標(biāo)平均回收率(0.1 mg/kg)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)(n=6)Table 1 Retention times(tR),MRM transitions,collision energies,LOQs,average recoveries and RSDs of 36 pesticides in peanut spiked at 0.1 mg/kg(n=6)

(續(xù)表1)

No.PesticidetR(min)MRMtransition(m/z)Collisionenergy(V)Linearrange(μg/L)rLOQ(mg/kg)Recovery(%)RSD(%)24Pyraclostrobin(吡唑醚菌酯)9.469388.10/194.05*,388.10/163.05-13,-240.5～2500.99870.00251023.425Phoxime(辛硫磷)9.581299.10/129.10*,299.10/77.10-11,-520.5～2500.99860.00251042.926Phorate(甲拌磷)9.746261.00/75.00*,261.00/199.10-9,-70.5～2500.99860.00599.35.827Difenoconazole(苯醚甲環(huán)唑)10.491406.10/251.00*,406.10/337.10-26,-170.5～2500.99990.00596.61.428Haloxyfop-P(高效氟吡甲禾靈)10.64376.1/315.59*,376.1/91.15-18,-330.5～2500.99900.002591.76.229Clethodim(烯草酮)11.111360.20/164.10*,360.20/268.10-19,-110.5～2500.99960.00594.96.330Quizalofop-ethyl(喹禾靈)11.441373.10/299.10*,373.10/91.10-19,-320.5～2500.99820.002592.75.631Fenoxaprop-p-ethyl(精唑禾草靈)11.488361.90/288.10*,361.90/119.15-18,-260.5～2500.99920.00598.23.332Fluazifop-p-butyl(精吡氟禾草靈)11.517384.20/282.20*,384.20/328.10-21,-170.5～2500.99890.00251033.333Terbufos(特丁硫磷)12.008289.00/103.20*,289.00/57.10-9,-241.0～2500.99580.00595.39.934Piperonylbutoxide(增效醚)12.258356.3/177.1*,356.3/119.0-13,-370.5～2500.99900.002599.82.435Oxadiazon(草酮)12.472345.1/219.9*,345.1/303.05-14,-210.5～2500.99560.00597.52.236Chlorpyrifos(毒死蜱)13.094351.90/199.90*,351.90/97.00-20,-320.5～2500.99580.002589.95.1

* quantitative ion

2.8 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用所建立的方法對超市和市場上購買的7個花生樣品進(jìn)行快速檢測。其中4個花生樣品被檢測出含有毒死蜱殘留(0.062,0.013,0.006 2,0.007 3 mg/kg),1個花生樣品檢出多效唑殘留(0.002 7 mg/kg)，但兩種農(nóng)藥的檢出量均未超出GB 2763-2014中規(guī)定的MRLs值。

3 結(jié) 論

本文采用UHPLC-MS/MS技術(shù)建立了花生中36種農(nóng)藥及其代謝物殘留的定性、定量快速檢測技術(shù)。樣品經(jīng)乙腈提取，EMR-Lipid除脂凈化，最后經(jīng)鹽析萃取后上機(jī)分析。該方法簡便、快速、靈敏，凈化效果好，適用于花生樣品中農(nóng)藥多殘留的快速檢測。

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Rapid Detection of 36 Pesticide Residues in Peanut by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LI Ling-yun1,WU Hua2,XU Xiao-min1,LIN Huan1,HUANG Xiao-dong1,ZHENG Shu-ning1,LIU Xin-yan1,XU Dong-hui1*

(1.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops,Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Quality & Safety Control for Vegetable Products,Ministry of Agriculture，Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;2.Agilent Technologies,Beijing 100102,China)

A multiresidue analytical method was developed for the rapid detection of 36 pesticides in peanut using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric technique(UHPLC-MS/MS).Peanut samples were extracted with acetonitrile,and then cleaned up with QuEChERS EMR-Lipid.The extract was detected by UHPLC-MS/MS.The positive ion mode and multiple reaction monitoring(MRM) mode were used to identify and quantify 36 pesticide residues in peanut.All pesticides had good linearity with correlation coefficients above 0.994.The average recoveries of the 36 pesticides ranged from 70.4% to 119% with relative standard deviations(RSDs) of 1.3%-19.4% at spiked levels of 0.005,0.01,0.10 mg/kg.The quantitation limits of this method were in the range of 0.002 5-0.05 mg/kg. With the advantages of simplicity,rapidness,sensitivity and good purifying effect,the method was suitable for the rapid determination of pesticide residues in peanut.

pesticide residues;peanut;enhanced matrix removal;ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UHPLC-MS/MS)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.010

2016-10-24；

2016-11-30

國家蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估項(xiàng)目(GJFP2017002)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0200200)

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2017)04-0502-05

*通訊作者：徐東輝，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，Tel:010-82106963，E-mail:xudonghui@caas.cn