張建瑩,岳振峰，蔡伊娜，吳衛(wèi)東，陳 波，王宏菊，趙瓊暉

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局 食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定復(fù)雜基質(zhì)食品中二硝基苯胺類除草劑殘留量

張建瑩*,岳振峰，蔡伊娜，吳衛(wèi)東，陳 波，王宏菊，趙瓊暉

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局 食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

建立了測定茶葉、大豆和雞肝等復(fù)雜基質(zhì)食品樣品中8種二硝基苯胺類除草劑(氟樂靈、二甲戊樂靈、仲丁靈、異樂靈、磺樂靈、氨基乙氟靈、氨磺樂靈和氨基丙氟靈)殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。分析物采用電噴霧電離，正離子掃貓，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，外標(biāo)法定量。8種二硝基苯胺類除草劑的定量下限均為0.010 mg/kg。在0.010～0.100 mg/kg加標(biāo)范圍內(nèi)，回收率為75.9% ～113%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7% ～19.0%。該方法高效、靈敏，適用于茶葉、大豆和雞肝等復(fù)雜基質(zhì)食品中二硝基苯胺類除草劑多殘留的測定。

二硝基苯胺類除草劑；復(fù)雜基質(zhì)食品；超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜

二硝基苯胺類除草劑主要包括氟樂靈、二甲戊樂靈、仲丁靈、異樂靈、磺樂靈、氨基乙氟靈、氨磺樂靈和氨基丙氟靈等。此類除草劑作為一種選擇性芽前土壤處理劑，具有殺草譜廣、除草效果穩(wěn)定、高效低毒等特點(diǎn)，在化學(xué)除草劑的應(yīng)用中占有很高比例。鑒于土壤對二硝基苯胺類除草劑具有強(qiáng)吸附作用，其殘留會(huì)對后茬作物產(chǎn)生藥害，對人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞也具有基因毒性，我國、歐盟和日本等很多國家對二硝基苯胺類除草劑制定了最高殘留限量，其中包括茶葉、大豆和雞肝等復(fù)雜基質(zhì)食品。

二硝基苯胺類除草劑殘留的主要檢測方法有GC/ECD,GC-MS和GC-MS/MS，檢測對象主要是土壤、水、果蔬、大豆及糧谷[1-15]，標(biāo)準(zhǔn)檢測方法包括GB/T 19426-2006，GB/T 19648-2006，GB/T 20769-2008，GB/T 20770-2008，GB/T 20771-2008，SN/T 0712-2010，SN/T 0600-1996。但上述方法用于測定二硝基苯胺類除草劑殘留存在以下問題：或不能覆蓋大部分二硝基苯胺類除草劑，或需大量樣品、消耗大量有機(jī)試劑，或不適用于茶葉和雞肝等復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測。目前尚未有茶葉、大豆和雞肝等復(fù)雜基質(zhì)食品中二硝基苯胺類除草劑多殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測報(bào)道。茶葉、大豆、雞肝等樣品含有大量的色素、蛋白質(zhì)和脂肪等干擾基質(zhì)，成分多、含量差異性大，這些干擾基質(zhì)成分包括無機(jī)物、有機(jī)物，離子型、強(qiáng)極性化合物和非極性化合物[16]。這些基質(zhì)組分的存在，使得食品中二硝基苯胺類除草劑的痕量分析甚至超痕量分析變得更為困難，最終影響分析測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇有效的前處理技術(shù)和高靈敏度、高分辨的分析儀器手段是建立茶葉、大豆、雞肝等復(fù)雜基質(zhì)食品中的二硝基苯胺類除草劑多殘留檢測方法的關(guān)鍵。本研究采用乙腈提取目標(biāo)化合物，經(jīng)HLB和Envi-carb固相萃取柱凈化，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了茶葉、大豆和雞肝等復(fù)雜食品基質(zhì)中的氟樂靈、二甲戊樂靈、仲丁靈、異樂靈、磺樂靈、氨基乙氟靈、氨磺樂靈和氨基丙氟靈多殘留檢測的分析方法。本方法快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏，完全可以滿足國內(nèi)外法規(guī)的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜(美國Waters公司)，Xevo-TQS四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)，超純水儀(美國Millipore公司)，均質(zhì)器(德國Heidolph公司)，旋渦振蕩儀(德國Heidolph公司)，離心機(jī)(德國Sigma公司)，Oasis HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL，美國Waters公司)，Envi-carb 固相萃取柱(0.25 g，3 mL，Supelco公司)，0.22 μm有機(jī)濾膜。

甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸銨(色譜純，Merck公司)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水，二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer 公司)。二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：用丙酮配制為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。

1.2 樣品前處理

稱取5 g(精確至0.01 g)樣品，加入10 mL水，混勻后靜置1 h。加入4 g 氯化鈉，以25 mL正己烷飽和乙腈溶液分兩次高速均質(zhì)提取，9 500 r/min 離心5 min。合并兩次提取液，混勻。吸取10.0 mL提取液，40 ℃水浴氮?dú)獯抵良s2.0 mL。

將濃縮液轉(zhuǎn)入活化后的HLB 固相萃取柱中，5 mL 乙腈淋洗，收集全部流出液，氮?dú)獯抵两?，?.0 mL丙酮-正己烷混合溶液(8∶2)溶解，轉(zhuǎn)入Envi-carb 固相萃取柱中，再用5.0 mL 丙酮-正己烷混合溶液淋洗并抽干，收集全部流出液，氮?dú)獯抵两?，?0%乙腈-水溶液定容至1.0 mL，旋渦混勻后過濾膜，測定。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；單位分辨率；電噴霧電壓：3 000 V；輔助氣流速：850 L/h；幕簾氣流速：50 L/h；離子源溫度：105 ℃；輔助氣溫度：450 ℃；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8種二硝基苯胺類除草劑殘留測定的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters for the detection of 8 dinitroaniline herbicides

*quantitative ion

1.4 色譜條件

色譜柱：Acquity BEH C18(1.7 μm，50 mm×2.1 mm,i.d.,美國Waters公司)。流動(dòng)相：0.05 mol/L 乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(A)-甲醇(B)。梯度洗脫程序：0～5 min，50%～80%B；5～8 min，80%～100%B;8～8.1 min，100%～50%B；8.1～9.5 min,50%B。流速：0.3 mL/min。進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

二硝基苯胺類除草劑易揮發(fā)、易光解、水溶性極小，易溶于有機(jī)溶劑，在植物中與脂質(zhì)結(jié)合[1]。在針對此類除草劑殘留的測定中，提取溶劑需滲入組織內(nèi)部才能得到良好的提取效果。利用有機(jī)溶劑提取目標(biāo)物是一種經(jīng)典方法，溶劑多采用乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等單一或混合溶劑。正己烷飽和的乙腈、丙酮和乙酸乙酯均能對此類農(nóng)藥充分提取，但丙酮和乙酸乙酯提取的共萃取物中油脂含量較高，不利于凈化；而正己烷飽和的乙腈溶液不但能沉淀蛋白質(zhì)，而且脂肪提出物和溶出雜質(zhì)很少，有利于后續(xù)的鹽析和凈化。因此，本研究采用正己烷飽和的乙腈溶液作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

由于茶葉、大豆、雞肝和豬肉等樣品中含有大量油脂、色素，肉類樣品中含有脂肪及脂溶性雜質(zhì)，采用正己烷飽和的乙腈溶液進(jìn)行提取有可能將這些化合物同時(shí)提取出來，在測定前需對提取液進(jìn)行除油、脫色凈化。二硝基苯胺類除草劑能溶于正己烷，不能采用正己烷萃取以達(dá)到除去油脂或色素的目的。為了達(dá)到理想的凈化效果，提取溶液需進(jìn)一步采用固相萃取柱凈化。Oasis HLB固相萃取柱可吸附部分脂肪、脂溶性雜質(zhì)、色素；Envi-Carb石墨碳固相萃取柱凈化色素和吸附油脂效果好。兩種固相萃取柱結(jié)合使用，可較好的去除脂溶性雜質(zhì)和色素干擾，達(dá)到極佳的凈化效果。本方法選用Oasis HLB(6 mL，200 mg)固相萃取柱結(jié)合Envi-Carb(3 mL，0.25 g)固相萃取柱進(jìn)行凈化。

進(jìn)一步對Envi-Carb固相萃取柱的洗脫溶劑進(jìn)行選擇。試驗(yàn)了不同淋洗強(qiáng)度(丙酮-正己烷混合溶劑，其中丙酮含量分別為10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%)后發(fā)現(xiàn)，回收率隨丙酮含量增加到80%時(shí)達(dá)到最大，但同時(shí)洗脫下來的雜質(zhì)也增多，當(dāng)丙酮含量大于80%后，個(gè)別被測物回收率逐漸降低。為保證洗脫完全，且避免雜質(zhì)干擾過大，故選擇丙酮-正己烷(體積比8∶2)配成混合溶劑。洗脫曲線試驗(yàn)結(jié)果表明，洗脫劑體積大于5 mL時(shí)，各被測物的回收率隨洗脫劑體積增大基本變化不大，但洗脫體積過大會(huì)使下一步的濃縮時(shí)間延長，導(dǎo)致個(gè)別易揮發(fā)性被測物損失較大，為避免濃縮時(shí)間過長造成損失及節(jié)省試劑，最終選擇洗脫體積為5 mL。

圖1 0.010 mg/L二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of 0.010 mg/L dinitroaniline herbicides standard solution1.oryzalin(氨磺樂靈)，2.trifluralin(氟樂靈)，3. dinitramine(氨基乙氟靈)，4. prodiamine(氨基丙氟靈)，5. pendimethalin(二甲戊樂靈)，6. trifluralin(氟樂靈)，7. butralin(仲丁靈)，8. isopropalin(異樂靈)

2.3 LC-MS/MS條件的優(yōu)化

對比了甲醇+5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05%甲酸，pH 3.0)、甲醇+5mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)、甲醇+0.1%乙酸水溶液、甲醇+水溶液、乙腈+0.05%甲酸水溶液作流動(dòng)相的色譜效果。結(jié)果表明，選擇甲醇+5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相并采用梯度洗脫時(shí)，8種二硝基苯胺類除草劑的分離度和靈敏度較高。0.01 mg/L二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見圖1。

分別取5.0 mg/L二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，以30 μL/min流速注入離子源。在正離子檢測方式下分別對各待測物進(jìn)行一級質(zhì)譜分析得到分子離子峰，選擇合適的錐孔電壓。再對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩對子離子為定性離子，對各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.4 線性范圍、定量下限與回收率

用空白樣品提取液配成二硝基苯胺類除草劑的質(zhì)量濃度分別為0，0.010,0.020，0.050，0.100，0.200 mg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以各被測物的峰面積(y)對濃度(x,mg/L)繪制工作曲線。8種二硝基苯胺類除草劑的濃度在0.010～0.200 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)和回歸方程見表2。

方法基于回收率和RSD滿足歐盟SANTE/11945/2015及國內(nèi)外殘留限量要求的最低試驗(yàn)添加水平，加標(biāo)樣品定量離子對色譜信號10倍信噪比(S/N=10)要求，確定8種二硝基苯胺類除草劑的定量下限均為0.010 mg/kg。在茶葉、雞蛋、雞肝和肉類空白樣品中添加3個(gè)濃度水平的二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測定6次，由表2結(jié)果可知，在0.010～0.100 mg/kg加標(biāo)水平范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為75.9%～113%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～19.0%，方法的回收率和精密度良好。

表2 二硝基苯胺類除草劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及回收率(n=6)Table 2 Regression equations,correlation coefficients,recoveries and relative standard deriations of 8 dinitroaniline herbicides(n=6)

3 結(jié) 論

本文采用正己烷飽和的乙腈提取目標(biāo)物，經(jīng)Oasis HLB柱和Envi-Carb柱凈化后，提取效率高、凈化效果好，方法具有較高的回收率、良好的精密度和較低的定量下限，適用于對茶葉、大豆和雞肝等復(fù)雜基質(zhì)食品中的8種二硝基苯胺類除草劑的同時(shí)測定。

[1] GB/T 19426-2006.Determination of 497 Kinds of Pesticide Residues and Related Chemicals in Honey，F(xiàn)ruit Juice and Wine.National Standards of the People's Republic of China(蜂蜜、果汁和果酒中497種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).

[2] GB/T 19648-2006.Determination of 500 Pesticides and Related Chemicals Residues in Fruits and Vegetables.National Standards of the People's Republic of China(水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留的測定.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).

[3] GB/T 19649-2006.Determination of 475 Pesticides and Related Chemicals Residues in Grains.National Standards of the People's Republic of China(糧谷中475種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).

[4] GB/T 20769-2008.Determination of 405 Pesticides and Related Chemicals Residues in Fruits and Vegetables.National Standards of the People's Republic of China(水果和蔬菜中405種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).

[5] GB/T 20770-2008.Determination of 372 Pesticides and Related Chemicals Residues in Grains.National Standards of the People's Republic of China(糧谷中372種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).

[6] GB/T 20771-2008.Determination of 420 Kinds of Pesticide Residues and Related Chemicals in Honey，F(xiàn)ruit Juice and Wine.National Standards of the People's Republic of China(蜂蜜、果汁和果酒中420種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).

[7] SN 0712-2010.The Method for Determination of Esprocarb,Pendimethalin,Pretilachlor,Flutolanil,Mebenil and Mefenacet Residues for Export Grains.Inspection and Quarantine Industry Standards of the People's Republic of China.(出口糧谷中戊草丹、二甲戊靈、丙草胺、氟酰胺、滅銹胺、苯噻酰草胺殘留量檢驗(yàn)方法.中華人民共和國檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)).

[8] SN 0600-1996.Method for the Inspection of the Residual Amount of Fluorine in the Grain for Export.Inspection and Quarantine Industry Standards of the People's Republic of China.(出口糧谷中氟樂靈殘留量檢驗(yàn)方法.中華人民共和國檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)).

[9] Huo J L，Yu J，Chu X G，Li J，F(xiàn)u J，Ge Y Q，Li Y，Wang B N.FoodSci.(霍江蓮，于靜，儲(chǔ)曉剛，李軍，付佳，葛毅強(qiáng),李妍，王碧娜.食品科學(xué))，2009,20(30)：299-302.

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Simultaneous Determination of Dinitroaniline Herbicides in Complex Matrix by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Jian-ying*，YUE Zhen-feng，CAI Yi-na，WU Wei-dong，CHEN Bo，WANG Hong-ju，ZHAO Qiong-hui

(Food Inspection and Quarantine Center,Shenzhen Exit-Entry Inspection & Quarantine Bureau，Shenzhen 518045，China)

A method was developed for the determination of 8 kinds of dinitroaniline herbicides,including trifluralin,pendimethalin,butralin,isopropalin,dinitramine,nitralin,oryzalin and prodiamine in complex matrices(tea,soybean and chicken livers) by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).Qualification and confirmation were achieved by electro-spray ionization(ESI) in positive mode using multiple reaction monitoring(MRM),and the external standard method was uesd for quantitation.The limits of quantitation were all 0.010 mg/kg.The recoveries of dinitroaniline herbicide residues were between 75.9% and 113% at spiked levels of 0.010-0.100 mg/kg.The RSDs of the method were between 1.7% and 19.0%.The method is precise and sensitive,and is suitable for both confirmation and quantification of trifluralin,pendimethalin,butralin,isopropalin,dinitramine,nitralin,oryzalin,prodiamine in tea,soybean and chicken livers.

dinitroaniline herbicides;complex matrix;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.019

2016-11-01；

2016-11-24

國家質(zhì)檢總局項(xiàng)目(2016IK240)

O657.63；S482.4

A

1004-4957(2017)04-0550-05

*通訊作者：張建瑩，碩士，高級工程師，研究方向：農(nóng)獸藥殘留分析，Tel:0755-26881671，E-mail:zhangjianying1001@163.com