袁愛國，李 斌，陳健平，肖麗杰，晉冠平*

(1．合肥工業(yè)大學 化學與化工學院,安徽 合肥 230009；2．汕頭市佳禾生物科技有限公司，廣東 汕頭 515021)

L-蘇氨酸分子印跡傳感器的制備及應(yīng)用

袁愛國1,2，李 斌1，陳健平2，肖麗杰1，晉冠平1*

(1．合肥工業(yè)大學 化學與化工學院,安徽 合肥 230009；2．汕頭市佳禾生物科技有限公司，廣東 汕頭 515021)

采用電化學方法制備了納米銀/聚槲皮素修飾充蠟石墨電極(Ag/Qu/WGE)。以L-蘇氨酸(L-Thr)為模板分子，將一定量的殼聚糖,L-Thr和Nafion的混合液涂布在Ag/Qu/WGE上，采用恒電位法電化學清洗除去模板分子L-Thr，得到基于殼聚糖/納米銀/聚槲皮素的L-Thr分子印跡復(fù)合膜修飾電極(TMIP/WGE)。采用場發(fā)射掃描電鏡、紅外光譜分析、X射線光電子能譜和電化學技術(shù)表征了TMIP/WGE的形成。TMIP/WGE對L-Thr具有良好的電催化氧化作用，可用于L-Thr的快速、靈敏檢測，L-Thr的氧化峰電流(1.45 V)和其濃度在0.1～1.0 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限(3σ)為0.01 μmol/L。該電極已成功用于蘇氨酸發(fā)酵液中L-Thr的檢測。

L-蘇氨酸(L-Thr)；分子印跡膜；納米銀

L-蘇氨酸(L-Thr，α-氨基-β-羥基丁酸，C4H9NO3)是一種人與動物體內(nèi)必需的氨基酸，具有抗?jié)?、防輻射、恢?fù)體力和促進生長發(fā)育的作用，但動物自身不能合成，必須從食物中攝取[1-2]。目前國內(nèi)外主要通過發(fā)酵法獲取蘇氨酸，蘇氨酸發(fā)酵液中主要包含蘇氨酸和其它雜質(zhì)氨基酸(谷氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等)，以及菌體、殘?zhí)?、色素、膠體物質(zhì)及其它發(fā)酵副產(chǎn)物[3-4]。靈敏快速地檢測發(fā)酵液中蘇氨酸含量具有重要的工業(yè)價值。

現(xiàn)有的測定蘇氨酸的分析方法有氨基酸分析儀測定法[4]、凱氏定氮法[4]、高效液相色譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、液相色譜-紫外光譜聯(lián)用法[7]、氣相色譜法[8]、毛細管電泳法[9]、離子交換色譜法[7]和薄層色譜法[10]等。但上述方法存在樣品前處理復(fù)雜，氨基酸衍生化時間長，或?qū)嶒瀮x器價格昂貴等問題。電化學法因成本低、靈敏度高、簡便快速，已受到了廣泛關(guān)注。但是蘇氨酸分子無電化學活性，且常與其它氨基酸共存，目前為止，尚無檢測蘇氨酸的電化學傳感器報道。

圖1 L-蘇氨酸(A，L-Thr)和槲皮素(B，Qu)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure formules of L-threonine(A) and quercetin(B)

L-Thr分子結(jié)構(gòu)中存在羥基和胺基兩個活性基團(圖1A)。研究顯示：一定條件下，納米金屬修飾電極可電催化氧化含羥基和胺基的有機小分子[11-12]。殼聚糖和納米銀均具有良好的生物兼容性，且納米銀兼具優(yōu)良的電催化活性[11]。研究采用電化學法在充蠟石墨電極上，制備了以L-Thr為模板印跡分子的殼聚糖/納米銀/聚槲皮素分子印跡復(fù)合膜修飾充蠟石墨電極(TMIP/WGE)。采用多種方法表征了電極的特性，考察了L-Thr在該電極上的電化學行為，并將該電極成功用于發(fā)酵液中L-Thr的檢測。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

所有電化學實驗在CHI660B(上海辰華儀器有限公司)上進行。電化學實驗采用常規(guī)的三電極系統(tǒng)，包括工作電極，鉑絲輔助電極，參比電極(飽和甘汞電極(SCE)或Ag/AgCl電極)。除非特別標明，本文的電位均相對于SCE?；w工作電極為本實驗室自制的充蠟石墨電極(WGE)，幾何面積為0.125 cm2。JSM-600型場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM,日本，JEOL)；ESCALAB MK2型X-射線光電子能譜儀(XPS，美國，Vg Corporation)；IR 200型紅外光譜儀(IR，美國，Nicolet),H835-50 高效液相色譜(HPLC，日本日立公司)。

殼聚糖(Ch)購于上海源聚生物科技有限公司。L-蘇氨酸(L-Thr)、D-蘇氨酸、槲皮素(Qu)、硝酸銀、殼聚糖等其它試劑均購于上?；瘜W試劑公司。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)作為電化學實驗的支持電解質(zhì)，由一定比例的磷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀溶液混合配制。實驗中所用藥品均為分析純。所有水溶液均用二次蒸餾水配制。實驗均在氮氣氛和室溫下進行。

1.2 Ag/Qu復(fù)合修飾電極的制備

將WGE電極依次在400，2 000及4 000目金相砂紙上研磨拋光如鏡面，然后分別在無水乙醇和二次水中超聲清洗10 min。將清潔后的WGE置于1.0 mmol/L Qu/0.1 mol/L PBS(pH 7.0)溶液中，通過循環(huán)伏安法(CV)修飾，得到聚槲皮素修飾充蠟石墨電極(Qu/WGE)[12]。將Qu/WGE電極界面在1.0 mmol/L AgNO3/0.1 mol/L LiNO3溶液中浸泡30 min后，取出在0.1 mol/L LiNO3溶液中進行CV還原，得到納米銀/聚槲皮素修飾充蠟石墨電極(Ag/Qu/WGE)。修飾好的電極保存在4 ℃水中。

1.3 TMIP/WGE的制備

將殼聚糖溶解在甲酸中制備成15 g/L的殼聚糖溶液；然后將L-Thr溶液(2 mmol/L)、殼聚糖溶液(15 g/L)和H2SO4溶液(2 mmol/L)按1∶3∶5的比例混合均勻，添加5%全氟磺酸樹脂(Nafion)10 μL，將混合溶液超聲振蕩均勻40 min。取20 μL懸濁液直接滴加在Ag/Qu/WGE電極界面上，在室溫下自然干燥，形成包含L-Thr模板分子的復(fù)合膜(MIP-Thr/WGE)。其后，將MIP-Thr/WGE在1.45 V下恒電位10 min，以洗脫L-Thr分子，得到分子印跡膜修飾電極[12]，記為TMIP/WGE，保存在4 ℃的0.1 mol/L PBS(pH 7.0)溶液中。

1.4L-Thr測定

以TMIP/WGE為工作電極，鉑絲為對電極，甘汞電極為參比電極，在0.1 mol/L PBS(pH 7.0)中，電位范圍為0.9～1.5 V，掃速為50 mV/s，進行循環(huán)伏安掃描。記錄L-Thr樣品添加前后在1.45 V處的峰電流值。每次測定后，將L-Thr置于0.1 mol/L PBS(pH 7.0)溶液中，1.45 V下恒電位降解10 min以去除吸附的L-Thr。

圖2 Ch/Ag/Qu/WGE(a)，L-Thr(b)，MIP-Thr/WGE(c)和TMIP/WGE(d)的紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of Ch/Ag/Qu/WGE(a),L-Thr(b),MIP-Thr(c) and TMIP/WGE(d)

2 結(jié)果與討論

2.1 TMIP/WGE表征

2.1.2 FE-SEM圖 圖3A顯示電極界面上(Ag/Qu/WGE)存在大量的納米Ag粒子。將20 μL由L-蘇氨酸、殼聚糖、H2SO4和Nafion組成的懸濁液直接滴加在Ag/Qu/WGE界面上，室溫下自然干燥，制成含蘇氨酸印跡分子復(fù)合膜。圖3B為包含L-Thr模板分子的復(fù)合膜(MIP-Thr/WGE)，和圖3A相比，該膜是致密和粗糙的。圖3C顯示，1.45 V下的恒電位洗脫10 min后，可使L-Thr分子從復(fù)合膜上脫落，從而形成多孔膜電極(TMIP/WGE)。

圖3 Ag/Qu/WGE(A)，MIP-Thr/WGE(B)和TMIP/WGE(C)的FE-SEM圖Fig.3 FE-SEM images of Ag/Qu/WGE(A),MIP-Thr/WGE(B) and TMIP/WGE(C)

2.1.3 電化學表征 圖4A顯示了Qu在WGE上的循環(huán)伏安行為(CV)，可觀察到在0.15/0.14 V處有1對氧化還原峰，其對應(yīng)于 C環(huán)，而在0.78 V和1.1 V 處的兩個不可逆氧化還原峰則對應(yīng)于A環(huán)中兩個羥基的氧化，在電極上產(chǎn)生的羥基自由基可進一步聚合成膜。隨著循環(huán)伏安的持續(xù)進行，0.78 V和1.1 V 處的兩個峰電流下降，這是由于電極上聚合物膜使傳質(zhì)阻力增大所致。這一過程和酚類化合物的電化學聚合類似[11-12]。Qu兩個重要作用(圖1B)：與裸WGE對Ag+的微弱吸附作用相比，可富集較多的Ag+，并得到均勻分散的納米Ag粒子；通過氫鍵吸附Ch，使Ch與膜緊密結(jié)合。圖4B為WGE(a)，Qu/WGE(b)和Ag/Qu/WGE(c)在0.1 mol/L PBS(pH 7.0)溶液中的CV曲線。與曲線a相比，曲線b上0.15 V和1.10 V 處有兩個氧化峰，表明了聚槲皮素的存在。曲線c中0.15 V氧化峰明顯升高，這是由于納米銀對Qu的催化氧化。此外，在1.45 V 處出現(xiàn)1個氧化峰，對應(yīng)于Ag→AgO→Ag2O的氧化過程[11]。表明Ag/Qu/WGE電極已形成。

圖5 0.9 μmol/L L-Thr在WGE(a)、Qu/WGE(b)和TMIP/WGE(c)上的CV曲線，以及TMIP/WGE在PBS中的CV曲線(d)Fig.5 CVs of 0.9 μmol L-Thr at WGE(a),Qu/WGE(b)，TMIP/WGE(c)，and CV of TMIP/WGE in PBS buffer(d)scan rate：50 mV/s；buffer：0.1 mol/L PBS(pH 7.0)

2.2 蘇氨酸的測定

2.2.1 催化氧化機理 圖5為WGE(a)，Qu/WGE(b)，TMIP/WGE(c)在0.9 μmol/LL-Thr+0.1 mol/L PBS(pH 7.0)溶液中的CV曲線，曲線d為Ag/Qu/WGE在0.1 mol/L PBS(pH 7.0)中的CV曲線。可觀察到，L-Thr在WGE(a)和Qu/WGE(b)上均未出現(xiàn)氧化還原峰；相比于曲線d，當L-Thr存在時，0.15 V處氧化峰增高，1.45 V處氧化峰顯著升高(c)，表明TMIP/WGE對L-Thr的氧化有較強的電催化作用，這為L-Thr的電化學檢測提供了依據(jù)。其可能的催化氧化機理為：L-Thr穿過印跡膜后被吸附富集在納米銀表面，納米銀降低了L-Thr分子中—NH2的活化能，在一定電位下，胺基易被催化氧化去氫[11-12]，使其在1.45 V處的氧化峰升高。

2.2.2 富集時間的影響 以0.9 μmol/L的L-Thr為探針，考察了富集時間對L-Thr峰電流(1.45 V)的影響。結(jié)果顯示，隨著富集時間從0增加到120 s，L-Thr在TMIP/WGE上1.45 V處的峰電流差值(ΔI=IThr-I0)明顯增加，在200 s時達最大值，此后趨于平緩，表明吸附達到平衡。因此，本實驗選擇最佳富集時間為200 s。

2.2.3 方法的標準曲線 考察了不同濃度L-Thr在TMIP/WGE上的CV曲線。結(jié)果顯示，隨著L-Thr濃度的升高，L-Thr在1.45 V處的峰電流逐漸增大。當L-Thr的濃度為0.1～1.0 μmol/L時，其在1.45 V處的氧化峰電流差值(ΔI)與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI(μA)=43.15+116.5c(μmol/L)，r=0.996 1，檢出限(3σ)為0.01 μmol/L。

2.2.4 選擇性與穩(wěn)定性 以0.9 μmol/L的L-Thr為探針，研究了L-蘇氨酸發(fā)酵母液中可能共存的氨基酸[3-4]，如D-蘇氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和脯氨酸對其測定的影響。結(jié)果顯示，100倍的干擾物在和L-Thr兩兩共存的情況下，L-Thr的回收率分別為8.8%，9.9 %，6.7%，3.5%，9.1%，8.0%和7.4%，L-Thr在1.45 V的峰電流回收率均小于10%，表明100倍的上述氨基酸均不干擾L-Thr的測定，即TMIP/WGE對L-Thr測定具有良好的選擇性。

以0.9 μmol/L的L-Thr為探針，研究了TMIP/WGE的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。在冰箱保存7 d后，L-Thr在該電極上的電流響應(yīng)為初始電流響應(yīng)的96%，保存30 d后，其電流響應(yīng)為初始電流響應(yīng)的85%。表明TMIP/WGE具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。每次測定后，將L-Thr置于0.1 mol/L PBS(pH 7.0)溶液中，1.45 V下恒電位降解10 min以去除吸附的L-Thr，其后置于4 ℃冰箱中保存。

2.3 實際樣品中L-Thr的測定

采用標準曲線法進行測定。取200 mL蘇氨酸發(fā)酵液，用陶瓷膜過濾去除較大顆粒雜質(zhì)，用粒徑為0.45 μm的濾網(wǎng)膜過濾去除小顆粒雜質(zhì)，取10.0 mL獲得的溶液，用0.1 mol/L PBS(pH 7.0)定容至500 mL(近似0.016 mol/L)，作為母液。同法操作，逐步稀釋溶液，使其中L-Thr濃度約為0.5 μmol/L時，再進行電化學測定(EC)，記錄1.45 V處L-Thr的峰電流差值(ΔI)。將不同體積的1.0 mol/LL-Thr標準液直接加入10.0 mL 蘇氨酸發(fā)酵液樣品中，通過標準加入法計算其中L-Thr的濃度，以計算加標回收率。結(jié)果顯示，L-Thr的氧化峰電流差值的回收率均在(100±3.0)%以內(nèi)。

為了進一步驗證方法的準確性，實驗采用高效液相色譜(HPLC)[5]對蘇氨酸母液中L-Thr的含量進行檢測。由表1可見，本方法的測定結(jié)果可靠，可用于實際樣品的測定。

表1 電化學法測定L-Thr的回收率以及與HPLC法測定的比較Table 1 Spiked recoveries for electrochemical detection of L-Thr and comparison with method of HPLC

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Preparation of a Molecularly Imprinted Film Modified Electrochemical Sensor forL-threonine Determination

YUAN Ai-guo1,2,LI Bin1,CHEN Jian-ping2,XIAO Li-jie1，JIN Guan-ping1*

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China;2.Shantou City Jiahe Biologic Technology Co.Ltd.,Shantou 515021,China)

A nano-silver/poly quercetin composites modified paraffin-impregnated graphite electrode was prepared by electrochemical method(Ag/Qu/WGE).A mixture ofL-Thr,chitosan and Nafion was coated on the surface of Ag/Qu/WGE,L-Thr(template molecule) was removed by electrochemical cleaning using potentiostatic method.As a result,a molecular imprinted polymer modified electrode based on chitosan/nano-silver/poly quercetin composites could be obtained forL-Thr detection(TMIP/WGE).The characteristics of the modified electrode were investigated by means of field emission scanning electron microscope technique,X-ray photoelectron spectroscopy,infrared spectra and electrochemical technique.The result indicated that the TMIP/WGE displayed a good electro-catalysis towards the oxidation ofL-Thr,which could be used for sensitive and quick detection ofL-Thr.The differences of oxidation peak current ofL-Thr(1.45 V) showed a good linearity in the concentration range of 0.1-1.0 μmol/L with a detection limit(3σ) of 0.01 μmol/L.The electrode was successfully applied in the determination ofL-Thr in fermentation broth.

L-threonine(L-Thr);molecular imprinted polymer;nano-silver

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.013

2016-10-09；

2016-12-30

2014廣東省協(xié)同創(chuàng)新與平臺環(huán)境建設(shè)專項及公益研究與能力建設(shè)專項資金(2014B0901010)

O657.1;O629.7

A

1004-4957(2017)04-0519-05

*通訊作者：晉冠平，博士，教授，研究方向：應(yīng)用電化學，Tel：0551-62901450，E-mail：jgp@hfut.edu.cn