劉洪巖，趙彥華，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

蝸牛消化酶提取河蟹微孢子蟲基因組反應(yīng)條件的優(yōu)化

劉洪巖，趙彥華，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

PCR是目前能夠特異地檢測河蟹微孢子蟲的最靈敏的方法。河蟹微孢子蟲孢子壁堅厚不易破碎，對許多化學(xué)物質(zhì)有很強的抵抗性，常規(guī)的核酸抽提方法效果不夠理想。本文通過對比PCR的結(jié)果，研究蝸牛消化酶對DNA抽提效果的影響，確定了酶作用的最佳反應(yīng)條件，提高了PCR檢測河蟹微孢子蟲的靈敏性。結(jié)果顯示:蝸牛消化酶提取微孢子蟲DNA的酶促反應(yīng)溫度為37℃，底物濃度為20 mg，酶的使用濃度為酶/底物重量比400 mg/g，酶促反應(yīng)時間為4 h。實驗表明，使用蝸牛消化酶處理樣品，有助于更加靈敏地檢測出微孢子蟲。該研究結(jié)果將有助于提高河蟹微孢子蟲病的檢驗檢測能力，對河蟹微孢子蟲的檢疫和防治具有積極意義。

河蟹微孢子蟲;DNA抽提方法;PCR

2015年大規(guī)模發(fā)病于江蘇的河蟹微孢子蟲病對江蘇省的河蟹產(chǎn)業(yè)造成了重大損傷，致死率約為40%～50%[1]。微孢子蟲（Microsporidia）是一類專性細胞內(nèi)寄生的單細胞真核生物，有著寄主廣泛，能感染許多經(jīng)濟動物，如家蠶（Bombyxmori）、蜜蜂（Apis mellifera），河蟹（Eriocheir sinensis）等節(jié)肢動物以及魚類，給生產(chǎn)者造成不同程度的經(jīng)濟損失[2]；還能感染嚙齒類動物、皮毛動物、靈長類動物及人類，引起動物和人類的疾病[3]。

目前對于河蟹微孢子蟲的檢測方法普遍采用PCR技術(shù)[4]。微孢子蟲孢子具有蛋白性孢子外壁和含幾丁質(zhì)的孢子內(nèi)壁。微孢子蟲的孢子壁能夠維持形態(tài)和抵抗外界不利環(huán)境。但是由于孢子壁的堅韌，給微孢子蟲基因組DNA提取增加了難度。制備河蟹微孢子蟲基因組DNA是后續(xù)實驗?zāi)軌蝽樌M行的關(guān)鍵，提高基因組提取的完整性，是提高河蟹微孢子蟲分子檢測靈敏度的有效手段。

蝸牛消化酶是一種復(fù)合酶系，由幾丁質(zhì)酶、葡萄糖酶、甘露聚糖酶和纖維素酶構(gòu)成[5]，其中的幾丁質(zhì)酶可以特異性的水解幾丁質(zhì)，從而瓦解微孢子蟲的孢子壁，提取微孢子蟲的基因組DNA。由于沒有純化的河蟹微孢子蟲，提取的基因組為河蟹與微孢子蟲基因組的混合物，因此不能使用瓊脂糖凝膠電泳直接檢測基因組提取的情況。為了能夠反映基因組提取的情況，實驗采用了PCR的方法，特異性擴增微孢子蟲基因組的片段，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的濃度，間接反映出微孢子蟲基因組的濃度，檢測微孢子蟲基因組提取的完整性。

為了優(yōu)選靈敏的微孢子蟲基因組DNA抽提方法。該研究將評價蝸牛消化酶作用于河蟹微孢子蟲基因組提取過程中，消化時間，酶濃度，底物濃度和反應(yīng)溫度四種因素對PCR檢測河蟹微孢子蟲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

中華絨螯蟹病蟹由興化水產(chǎn)站提供；蝸牛消化酶購于上海生工；β-巰基乙醇，山梨醇購于Sigma；組織提取試劑盒購于TAKARA；Taq酶購于TAKARA。

1.2 中華絨螯蟹微孢子蟲基因組提取

取5 mg病變的河蟹肝胰腺，加入終濃度10% SDS 50 μL，終濃度1 mg/mL蛋白酶K 25 μL，37℃水浴消化2 h，95℃處理10 min，加入不同濃度的蝸牛消化酶，處理相應(yīng)時間，加入550 μL飽和酚，顛倒混勻，靜置2 min，4℃12 000 r/min離心5 min，取上清加入等量的酚/氯仿（25∶24，v/v）抽提（4℃12 000 r/min離心5 min），重復(fù)1次，再加等量氯仿抽提1次（4℃12 000 r/min離心5 min），取上清，并加入上清1/10體積3 mol/L NaAc（pH值5.4）及2倍體積（20℃預(yù)冷的無水乙醇），充分混合后（20℃沉淀3 h，12 000 r/min）離心10 min，去上清，加入75%乙醇洗鹽，干燥10 min，加入10 μL TE溶解。

1.3 蝸牛消化酶水解條件優(yōu)化

影響酶活的因素主要有酶促反應(yīng)時間，酶濃度和底物濃度。因此，實驗研究了反應(yīng)時間（1、4、8 h），酶濃度（酶/組織重量比為40 mg/g、400 mg/g、4 g/ g），底物濃度（10、20、40 mg），反應(yīng)溫度（34、37、40℃），測定各單因素條件下蝸牛消化酶對基因組提取的影響[6]。

1.4 正交實驗設(shè)計

在上述單因素實驗基礎(chǔ)上，研究時間，酶濃度，底物濃度三種因素對蝸牛消化酶對基因組提取的作用，從而選出最佳作用條件[7]，見表1。

表1 正交實驗因素及水平

1.5 PCR和熒光定量PCR反應(yīng)

中華絨螯蟹微孢子蟲核糖體18 sRNA具有高度的特異性，根據(jù)序（GenBank accession No. HE584635.1），據(jù)此設(shè)計普通PCR和實時熒光定量PCR的引物。引物序列為：上游引物5'-AGTAGTGATGGCGATTAGAGACCG-3'，下游引物5'-TGAGTCAAATTAAGC-3'，均由上海生工公司合成。普通PCR結(jié)束后進行凝膠成像，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc2000，Bio-Rad Co.）拍照成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時間對提取結(jié)果的影響

反應(yīng)時間是酶促反應(yīng)優(yōu)化的一個重要因素[8]。反應(yīng)時間短，酶促反應(yīng)不能完全進行，從而影響基因組提取的效果；反應(yīng)時間過長，實驗過程變得拖沓，浪費時間，而且增加交叉污染的機會。因此，要確定酶促反應(yīng)的時間，從而優(yōu)化反應(yīng)條件。反應(yīng)樣品取樣為5 mg，酶添加量為酶底物重量比為40 mg/ g，反應(yīng)溫度為35℃情況下進行。

圖1 反應(yīng)時間對提取結(jié)果的影響

由圖1可以看出，隨著反應(yīng)時間的增加，PCR產(chǎn)物的亮度增加，但是4 h和8 h處理的結(jié)果相差不大。從節(jié)約時間和充分反應(yīng)的角度，選取4 h為最佳消化時間。

2.2 酶濃度對提取結(jié)果的影響

酶促反應(yīng)中酶的使用濃度是影響酶促反應(yīng)的關(guān)鍵因素[9]。酶的濃度在較低的時候，是酶促反應(yīng)的限制因素；而酶濃度較高時，再增加酶濃度不能提高反應(yīng)速率，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。所以，實驗中要確定酶促反應(yīng)酶的使用濃度，從而對基因組提取的條件進行優(yōu)化。反應(yīng)在樣品取樣為5 mg，消化時間為4 h，反應(yīng)溫度為35℃情況下進行。

根據(jù)圖2結(jié)果顯示，酶濃度為400 mg/g的時候，反應(yīng)最充分，增加反應(yīng)的酶濃度不再能夠使反應(yīng)更加充分。據(jù)此，選取400 mg/g為最佳反應(yīng)酶濃度。

圖2 酶濃度對基因組提取的影響

圖3 底物濃度對基因組提取的影響

2.3 底物濃度對提取結(jié)果的影響

當酶濃度不變時，底物濃度可以影響反應(yīng)速率[10]。當?shù)孜餄舛鹊蜁r，底物濃度是酶促反應(yīng)的限制因素，隨著底物濃度的增加，酶的催化速率增加；當?shù)孜餄舛冗_到相當高時，底物濃度對反應(yīng)速率影響變小，最后反應(yīng)速率與底物濃度幾乎無關(guān)，反應(yīng)達到最大速率。由此得知，當?shù)孜餄舛冗_到最大時，蝸牛消化酶活力將不受底物的影響，從而選出最優(yōu)的樣品使用量。反應(yīng)時間為4 h，酶添加量為酶底物重量比為400 mg/g，反應(yīng)溫度為35℃情況下進行。

底物濃度實驗結(jié)果如圖3。增加底物濃度，可以增加反應(yīng)速率，但是當?shù)孜餄舛冗_到最大值之后，增加底物濃度，由于反應(yīng)不充分，會使得基因組提取的靈敏性受到限制，因此，選擇20 mg肝胰腺為一個反應(yīng)的最佳底物濃度。

2.4 反應(yīng)溫度對提取結(jié)果的影響

酶促反應(yīng)受溫度的影響較大[8]。酶是蛋白質(zhì)，反應(yīng)溫度低于最佳溫度的時候，溫度是反應(yīng)的限制因素，隨著溫度的提高，酶促反應(yīng)速率加快；隨著溫度繼續(xù)升高，溫度到達最佳反應(yīng)溫度以后，酶促反應(yīng)的效率隨著溫度的升高急速降低，最終會導(dǎo)致酶失活。為了確定酶促反應(yīng)的最佳溫度，提高基因組提取的效果而進行了溫度優(yōu)化實驗。反應(yīng)在樣品取樣為20 mg，酶添加量為酶底物重量比為400 mg/g，消化時間為4 h。

由圖4可知，反應(yīng)的溫度在6℃范圍內(nèi)變化，對酶的消化作用影響不大。

圖4 反應(yīng)溫度對基因組提取的影響

2.5 正交實驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交實驗的方法，研究酶促反應(yīng)時間、底物濃度、酶濃度和酶促反應(yīng)時間四個因素對中華絨螯蟹微孢子蟲基因組提取的影響。確定影響蝸牛消化酶作用的主次因素及相互關(guān)系。實驗結(jié)果及統(tǒng)計分析見表2。

表2 蝸牛消化酶L9（34）正交實驗結(jié)果

從表2可知，以PCR結(jié)果的灰度值為衡量指標時，各因素的最優(yōu)組合為：A2B2C2D2[7]。由極差R可知，B因素（蝸牛消化酶的濃度）對蝸牛消化酶酶活力的影響最大，其次為A因素（消化反應(yīng)時間），D因素（反應(yīng)溫度）影響最小。

3 結(jié)論

結(jié)合單因素實驗和正交實驗確定蝸牛消化酶作用于中華絨螯蟹基因組提取的最佳條件。并通過方差分析和單因素多重比較得到的最佳條件為：酶促反應(yīng)溫度為37℃，底物濃度為20 mg，酶的使用濃度為酶底物重量比400 mg/g，酶促反應(yīng)時間為4 h。

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Optimizing condition of extracting genomic DNA on Hepatospora eriocheir by snail digestive enzyme

Liu Hongyan，Zhao Yanhua，Sun Mengling，Xue Hui（Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

PCR is the most sensitive and specific method to detect Microsporidia ofEriocheir sinensis（Hepatospora eriocheir）at present.Hepatospora eriocheirhas solid spore wall，which could resist to many chemicals. As a result，the effect of conventional methods for DNA extracting was not ideal.In order to improve the sensitivity of PCR detection ofHepatospora eriocheir，the experimental conditions of snail digestive enzyme activity assaywere researched.Four influencing factors enzymatic reaction time，reaction-temperature，substrate concentration，and enzyme concentration were studied by a single factor test.Finally，orthogonal experiment，variance analysis and multiple comparisons were combined together，and the optimum conditions of determination of snail digestive enzyme activity were determined.The results showed that：when the enzyme concentration was 4 000 mg/g and substrate were 20 mg，enzymatic reaction time was 37℃，reaction time was 4 hours，the effect of DNA extraction was best.

Microsporidia；Eriocheir sinensis；extraction of DNA；PCR

Q173

A

1004-2091（2017）04-0035-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.008

2016-12-16）

江蘇省科技計劃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項目（BE2016392）

劉洪巖（1986-），女，研究實習(xí)員，主要從事水產(chǎn)病害研究.E-mail：njsfdxliuhongyan@163.com

薛暉（1968-），男，高級工程師.E-mail：jsxuehui@163.com