許貴軍，車明徽，隋金婷，張哲源，齊 威，孫忠人△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱 150025；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

實驗研究

針?biāo)幗Y(jié)合對失眠大鼠血液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

許貴軍1，車明徽1，隋金婷2，張哲源1，齊 威3，孫忠人3△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱 150025；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究針?biāo)幗Y(jié)合方法對失眠模型大鼠血液中5-HT、5-HIAA、NE、DA等4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法：50只健康Wistar大鼠，隨機分為5組，每組10只。分別為空白對照組、失眠模型組、五加棗仁膏滋組、電針組和針?biāo)幗Y(jié)合組，除空白組外，其他各組采用PCPA腹腔注射造失眠模型。針刺采用電針儀對大鼠百會與左神聰穴，電壓9 V，選疏密波，留針30 min，連續(xù)7天；膏滋以1.35 g/(kg·d)劑量灌胃，連續(xù)7天，末次針刺或灌胃后，眼球取血，采用HPLC-熒光檢測法，色譜條件為C18反相色譜柱，甲醇：檸檬酸-乙酸鈉緩沖液(13∶87，v/v)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；發(fā)射波長為330 nm，激發(fā)波長為280 nm，同時測定大鼠血漿中5-HT、5-HIAA、NE、DA。結(jié)果：針?biāo)幗Y(jié)合組NE含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，并顯著低于失眠模型組(P<0.05)，分別與五加棗仁膏滋組和電針組進(jìn)行比較，無顯著性差異。針?biāo)幗Y(jié)合組DA含量極顯著低于失眠模型組(P<0.01)，分別與五加棗仁膏滋組和電針組進(jìn)行比較，均具有極顯著性差異(P<0.01)。針?biāo)幗Y(jié)合組5-HT轉(zhuǎn)換率分別與五加棗仁膏滋組和電針組進(jìn)行比較，數(shù)值較低，均具有極顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論：針?biāo)幗Y(jié)合組與五加棗仁膏滋組和電針組進(jìn)行療效比較，具有顯著促眠優(yōu)勢,說明針?biāo)幗Y(jié)合對失眠大鼠的促眠作用具有協(xié)同增效性。

針?biāo)幗Y(jié)合；失眠；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；協(xié)同增效;大鼠

百會穴和神聰穴是針灸治療失眠癥的經(jīng)典穴位，五加棗仁膏滋為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院的特色制劑，按照傳統(tǒng)膏方制備工藝精制而成，健脾補腎、寧心安神,用于體虛乏力、食欲不振、虛煩不眠多夢等癥。腦組織或血液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量變化，都可反映神經(jīng)系統(tǒng)功能的變化[1-2],對睡眠產(chǎn)生影響。本研究通過對失眠模型大鼠針刺結(jié)合灌胃給藥，測定血漿中5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量，得到其變化規(guī)律。證實針?biāo)幗Y(jié)合治療失眠癥的協(xié)同增效作用。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀(Waters 2695型、2475型熒光檢測器、3.2色譜工作站)；高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司KDC-160HR)；超低溫冰箱(賽默飛 Thermo HFU586 Basic)；電針儀(江蘇武進(jìn)市長城醫(yī)療器械有限公司KWD-808 I)；針灸針(蘇州醫(yī)療儀器廠0.30 mm×25 mm)；肝素納采血管(VACUETTE)；渦旋混合器(蘇州江東精密精密儀器有限公司)。

1.2 試劑試藥

五加棗仁膏滋(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑室，20131001)；5-HT(Maya Reagent)；5-HIAA(上海源葉生物科技有限公司)；NE(Maya Reagent)；DA(Aladdin Industrial Corporation)；鹽酸(哈爾濱市化工試劑廠,20120115)；檸檬酸(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠,20121203)；冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,20120502)；無水醋酸鈉(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司,20111201)；EDTA- 2Na(天津市華真特種化學(xué)試劑廠,20120104)；1-庚烷磺酸鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,20110309)；三乙胺(天津市富宇精細(xì)化工有限公司,20130403)；甲醇(色譜純DikmaPure LOT：5305915)；PCPA(北京百靈威科技有限公司)；高氯酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,20120502)。

1.3 實驗動物

健康Wistar大鼠50只，雄性，體質(zhì)量200～250 g(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK黑2013-004，使用許可證：SYXK黑2013-012)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件與檢測方法

2.1.1 色譜條件和熒光檢測參數(shù) 色譜柱：Kromasil C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 um)。流動相為甲醇：檸檬酸-乙酸鈉緩沖液(13：87，v/v)(pH3.8)，緩沖液按照50 mmol/L檸檬酸、50 mmol/L乙酸鈉、0.5 mmol/L1-庚烷磺酸鈉、5 mmol/L 三乙胺、0.5 mmol/L EDTA-2Na比例配制；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；發(fā)射波長為330 nm，激發(fā)波長為280 nm[3-4]。

2.1.2 血漿中5-HT、5-HIAA、NE、DA含量測定 各組大鼠于末次針刺或給藥后，禁食8 h對大鼠作相應(yīng)處理，對各組動物按照相應(yīng)順序取眼球血，置于肝素鈉管內(nèi)，放置于高速冷凍離心機中以4800轉(zhuǎn)/min，4℃離心15 min，離心后取上清液置于-84℃超低溫冰箱中冷凍待測。血漿樣本處理：指標(biāo)測試之前將血漿樣本從超低溫冰箱中取出，恒溫解凍。解凍后加0.2倍劑量濃度為70%的高氯酸沉淀蛋白質(zhì)，然后以10000轉(zhuǎn)/min，4℃離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾。將處理好的各組血漿樣本進(jìn)樣2 μL，根據(jù)所得峰面積代入回歸方程，計算4種神經(jīng)遞質(zhì)的濃度。

2.2 造模、分組與給藥

2.2.1 失眠動物模型 PCPA腹腔注射造大鼠失眠模型是目前公認(rèn)并廣泛用于5-HT及其與其他遞質(zhì)之間關(guān)系研究的經(jīng)典動物模型[5]。對Wistar大鼠一次性腹腔注射PCPA混懸液45 mg/1 ml/100 g，在腹腔注射PCPA28～30 h后，活動明顯頻繁，對外界的聲、光等刺激異常敏感，興奮性增高，攻擊性增強，飲食及二便顯著性增多，大便色灰白，晝夜節(jié)律紊亂，白天也活動不停，表明模型復(fù)制成功。

2.2.2 動物分組 取大鼠50只，按隨機數(shù)字表法分為以下5組，每組10只。①空白對照組：腹腔注射與PCPA同體積的弱堿性生理鹽水1次，之后連續(xù)7天灌胃與五加棗仁膏滋組相同體積的生理鹽水；②失眠模型組：失眠模型大鼠，連續(xù)7天灌胃與五加棗仁膏滋組相同體積的生理鹽水正常飼養(yǎng)7天；③五加棗仁膏滋組：失眠模型大鼠，連續(xù)7天給予五加棗仁膏滋灌胃實驗，按1.35 g/kg/天給予大鼠五加棗仁膏滋灌胃；④電針組：失眠模型大鼠，連續(xù)7天給予電針刺激實驗；⑤針?biāo)幗Y(jié)合組：失眠模型大鼠，連續(xù)7天給予五加棗仁膏滋灌胃，同時連續(xù)7天給予電針實驗。

2.2.3 針刺取穴與施針給藥方法 穴位選擇百會與左神聰穴。選用0.30 mm×25 mm毫針刺入穴位后連接電針儀，電池供電，電壓9 V，選疏密波，強度以頭部輕微抽動為度，留針30 min，以上方法連續(xù)實驗7天，每天早上6:00～7:00針刺。每天早上9:00膏滋灌胃，連續(xù)7天。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 實驗結(jié)果

3.1 神經(jīng)遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為，5-HT：y=11067780x+86600；5-HIAA：y=18168613x-4443；NE：y=24953675x+44505；DA：y=64021775x-91322。

色譜圖中峰1：NE約2.5 min出現(xiàn);峰2：DA約3.6 min出現(xiàn);峰3：5-HIAA約6.6 min出現(xiàn);峰4：5-HT約16.3 min出現(xiàn)。色譜圖見圖1、圖2。

3.2 大鼠血漿中NE、DA、5-HT、5-HIAA含量的測定

NE、DA結(jié)果見表1，5-HT、5-HIAA結(jié)果見表2。

圖1 4種神經(jīng)遞質(zhì)混合對照品高效液相色譜圖(峰1：NE，峰2：DA，峰3：5-HIAA，峰4：5-HT)

圖2 實驗大鼠血漿中4種神經(jīng)遞質(zhì)高效液相色譜圖

組別例數(shù)NE(pg/mL)DA(ng/mL)空白對照組100．7030±0．26110．0915±0．0173失眠模型組101．6941±0．5920??0．1329±0．0194??五加棗仁膏滋組101．2642±0．4352??#0．0753±0．0082?##電針組101．2526±0．5093??#0．0722±0．0094?##針?biāo)幗Y(jié)合組101．1625±0．3940??#0．0497±0．0104??##△△▲▲

注：與空白對照組比較,*P<0.05，**P<0.01；與失眠模型組比較,#P<0.05，##P<0.01；與五加棗仁膏滋組比較,△P<0.05，△△P<0.01；與電針組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 各組實驗大鼠血漿5-HT和5-HIAA含量的比較

注：與空白組比較,*P<0.05，**P<0.01；與失眠模型組比較,#P<0.05，##P<0.01；與五加棗仁膏滋組比較,△P<0.05，△△P<0.01；與電針組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表1可見，①各實驗組大鼠血漿中NE含量，失眠模型組大鼠極顯著高于對照組(P<0.01)；五加棗仁膏滋組、電針組、針?biāo)幗Y(jié)合組也極顯著高于空白對照組(P<0.01)，但3組數(shù)據(jù)值處于空白對照組與失眠模型組之間，并顯著低于失眠模型組(P<0.05)；而針?biāo)幗Y(jié)合組分別與五加棗仁膏滋組和電針組進(jìn)行比較，無顯著性差異。②各實驗組大鼠血漿中DA含量，失眠模型組大鼠極顯著高于空白對照組(P<0.01)；五加棗仁膏滋組、電針組、針?biāo)幗Y(jié)合組含量極顯著低于失眠模型組(P<0.01)；相對于空白對照組，膏滋組、電針組顯著低(P<0.05)；而針?biāo)幗Y(jié)合組分別與五加棗仁膏滋組和電針組進(jìn)行比較，均具有極顯著性差異(P<0.01)。

由表2可見，5-HT轉(zhuǎn)換率(5-HIAA/5-HT)方面，失眠模型組大鼠最高，較空白組有極顯著性差異(P<0.01)，五加棗仁膏滋組、電針組、針?biāo)幗Y(jié)合組均極顯著低于空白對照組和失眠模型組(P<0.01)；而針?biāo)幗Y(jié)合組分別與五加棗仁膏滋組和電針組進(jìn)行比較，數(shù)值較低，均具有極顯著性差異(P<0.01)。

4 討論

睡眠是一個十分復(fù)雜的生理過程，睡眠的產(chǎn)生與中樞神經(jīng)某些結(jié)構(gòu)以及不同遞質(zhì)的作用密切相關(guān)。針?biāo)幗Y(jié)合顧名思義是針灸結(jié)合藥物對疾病進(jìn)行治療，是體現(xiàn)中醫(yī)理論、中醫(yī)特色的重要手段之一，針?biāo)幗Y(jié)合產(chǎn)生療效的機制是一個典型的多因素、多水平的問題，針灸、藥物作用機制具有多途徑、多層次、多靶點等特點。本研究即從神經(jīng)遞質(zhì)角度研究針?biāo)幗Y(jié)合的作用機理。

從實驗中得到4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化規(guī)律，之所以呈現(xiàn)出以上規(guī)律，可能因為:①NE和DA均為參與覺醒的神經(jīng)遞質(zhì)，屬于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，一般規(guī)律為二者含量越高動物越清醒，而且DA是NE的前體物質(zhì)，二者含量變化趨勢基本一致。失眠模型大鼠的NE、DA升高是因為造模后興奮度提高所致，經(jīng)藥物、針刺、針?biāo)幗Y(jié)合干預(yù)后，實驗組大鼠血漿中NE、DA含量降低，說明各實驗手段能夠使實驗動物的失眠狀態(tài)得到改善，而從DA數(shù)據(jù)看，針?biāo)幗Y(jié)合組的效果最佳。②5-HT、5-HIAA含量變化規(guī)律用5-HT轉(zhuǎn)換率即(5-HIAA/5-HT值)來進(jìn)行促眠效果分析，而不用單純的5-HT、5-HIAA含量數(shù)值來判斷，其機理闡述為細(xì)胞外的、能夠檢測到的5-HT并不能完全反映5-HT能神經(jīng)元的興奮性。所以，目前許多研究者將5-HT轉(zhuǎn)換率作為5-HT能神經(jīng)元興奮性的指標(biāo)[6-8]。延長覺醒可增加5-HT轉(zhuǎn)化率，也揭示了覺醒狀態(tài)的維持又必須依賴于高水平的5-HT釋放。

從本實驗結(jié)果可以看出，從單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的角度研究，應(yīng)用五加棗仁膏滋、電針針刺以及二者相結(jié)合的手段，均能改善失眠大鼠的睡眠狀態(tài)，而針?biāo)幗Y(jié)合的促眠作用最佳。同時參考各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)確定針?biāo)幗Y(jié)合方式相對于單純用針或單純用藥對失眠大鼠的睡眠改善具有更佳效果，體現(xiàn)出針?biāo)幗Y(jié)合對于失眠癥的治療優(yōu)勢。

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許貴軍(1975-)，男，副主任藥師，研究方向：新制劑新劑型研究。

△通訊作者：孫忠人(1960-)，男，教授，博士后合作指導(dǎo)教師,研究方向：中醫(yī)針灸治療腦病。

R246.1

A

1005-0779(2017)04-0058-03

2016-08-30