楊 帆 高 翔 石玉萍 魏小果

(甘肅省人民醫(yī)院消化科，甘肅 蘭州 730000)

鴉膽子油逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑耐藥胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性

楊 帆 高 翔 石玉萍 魏小果

(甘肅省人民醫(yī)院消化科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討鴉膽子油增加奧沙利鉑(OXA)耐藥胃癌SGC-7901細(xì)胞(SGC-7901/COXA)對(duì)OXA敏感性的效果。方法 (1)建立SGC-7901/COXA細(xì)胞株。首先通過讓細(xì)胞持續(xù)接觸藥物的培養(yǎng)方法，并逐漸增加OXA的濃度，建立SGC-7901/COXA細(xì)胞株。(2)計(jì)算鴉膽子油及OXA對(duì)SGC-7901/COXA細(xì)胞增殖抑制率及藥物的IC50。取對(duì)數(shù)生長期SGC-7901/COXA細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的鴉膽子油、OXA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后應(yīng)用CCK8試劑測(cè)定各孔光吸收值(A)，取平均值，計(jì)算兩藥單獨(dú)對(duì)SGC-7901/CDDP細(xì)胞增殖抑制率及藥物的IC50。(3)計(jì)算兩藥聯(lián)合后SGC-7901/COXA細(xì)胞增殖抑制率、IC50逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。選擇適宜的鴉膽子油濃度與不同濃度OXA聯(lián)合，重復(fù)CCK8法，計(jì)算兩藥聯(lián)合后SGC-7901/COXA細(xì)胞增殖抑制率、IC50、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。結(jié)果 鴉膽子油、OXA對(duì)SGC-7901/COXA細(xì)胞增殖具有抑制作用，該作用與濃度呈正相關(guān)。鴉膽子油、OXA對(duì)SGC-7901/COXA細(xì)胞的IC50分別為91.39 μg/ml和5.37 μg/ml。鴉膽子油聯(lián)合不同濃度OXA后對(duì)SGC-7901/COXA細(xì)胞增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，聯(lián)合用藥后OXA的IC50降為1.29，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為4.16，因此SGC-7901/COXA對(duì)OXA敏感性明顯增強(qiáng)。結(jié)論 鴉膽子油與OXA聯(lián)合后SGC-7901/COXA對(duì)OXA的敏感性增加，相對(duì)單獨(dú)使用易產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)，兩者聯(lián)合后能有效提高SGC-7901/COXA對(duì)OXA的敏感性。

奧沙利鉑；胃癌；SGC-7901細(xì)胞；鴉膽子油

胃癌治療方案以手術(shù)切除為主，但因多數(shù)胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，失去根治性手術(shù)治療機(jī)會(huì)。因此只能選擇以化學(xué)治療為主的綜合治療方案。回顧化療藥物的發(fā)展，從早期的氟尿嘧啶+阿霉素，到新一類以鉑類為主的化療方案，有效率亦僅有40%，難以進(jìn)一步提高。而制約化療效果的一個(gè)關(guān)鍵因素是藥物的耐藥性，這是化療的瓶頸。中藥在化療減毒增效方面發(fā)揮重要作用。鴉膽子油是從鴉膽子果實(shí)中提純得到的脂肪油，具有抗腫瘤作用，而且與化療藥物合用具有減毒增效的作用，同時(shí)具有一定逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥作用(多藥耐藥逆轉(zhuǎn)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制作用)。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證鴉膽子油能否增加SGC-7901/COXA對(duì)奧沙利鉑(OXA)敏感性的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SGC-7901細(xì)胞(ATCC)；OXA(江蘇豪森)；鴉膽子油(沈陽藥大雷允上公司)；膽囊收縮素八肽(CCK8)試劑盒(日本同仁)；酶標(biāo)儀(奧地利帝肯公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立SGC-7901/COXA細(xì)胞株 本研究采用大劑量間隙沖擊逐步增加劑量法建立SGC-7901/COXA細(xì)胞株。首先取對(duì)數(shù)生長期的胃癌SGC-7901細(xì)胞，用 0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液后，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)用含有0.125 μg/ml OXA(相當(dāng)于抑制率為20%濃度)的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，經(jīng)過多次傳代，觀察細(xì)胞生長穩(wěn)定無明顯變形，可增加藥物濃度，經(jīng)過3個(gè)月的誘導(dǎo)，使胃癌SGC-7901細(xì)胞依次能在0.25、0.5、1、2 μg/ml RPMI 1640培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長和傳代，建立其耐藥細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)觀察到耐藥細(xì)胞株增殖速度減慢，倍增時(shí)間延長。

1.2.2 應(yīng)用CCK8法觀察鴉膽子油、OXA及兩藥聯(lián)合后SGC-7901/COXA細(xì)胞增殖抑制率、藥物的IC50、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901/COXA細(xì)胞，應(yīng)用0.25%胰酶消化，制成2×104/ml單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μl，其中1孔留作空白孔，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使得細(xì)胞充分貼壁。然后將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，加入不同濃度的鴉膽子油和OXA，鴉膽子油各組終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，OXA各組終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2 μg/ml，陰性對(duì)照組每孔加入100 μl RPMI 1640培養(yǎng)液，空白孔加200 μl普通培養(yǎng)液(不加細(xì)胞)，每個(gè)濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加藥后將細(xì)胞再次置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后按照每孔加入20 μl CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，即可用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值，波長取490 nm。取6個(gè)復(fù)孔的平均值。計(jì)算藥物作用48 h的增殖抑制率。抑制率=〔1-(實(shí)驗(yàn)組平均OD值-空白組平均OD值)/(陰性對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值)〕×100%。根據(jù)抑制率計(jì)算兩藥的IC50，然后選擇適宜的鴉膽子油與OXA聯(lián)合作用于SGC-7901/COXA細(xì)胞，重復(fù)CCK8方法，計(jì)算兩藥聯(lián)合后細(xì)胞增殖抑制率及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 建立SGC-7901/COXA細(xì)胞株 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察到OXA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的IC50為0.84 μg/ml，而OXA對(duì)SGC-7901/COXA細(xì)胞IC50為5.37 μg/ml，耐藥倍數(shù)為6.39。因此通過大劑量間隙沖擊逐步增加劑量法建立SGC-7901/COXA細(xì)胞株這種方法可行。

2.2 鴉膽子油、OXA及兩藥聯(lián)合后SGC-7901/COXA細(xì)胞增殖抑制率、藥物的IC50、逆轉(zhuǎn)倍數(shù) 根據(jù)鴉膽子油對(duì)SGC-7901/COXA細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果，選擇濃度為30 μg/ml鴉膽子油(相當(dāng)于IC30濃度)與不同濃度OXA聯(lián)合作用于SGC-7901/COXA細(xì)胞。鴉膽子油、OXA及兩者聯(lián)合對(duì)SGC-7901/COXA細(xì)胞增殖具有不同程度的抑制作用，并且抑制作用強(qiáng)度與濃度呈正相關(guān)。48 h鴉膽子油6.25 μg/ml抑制率(10.2±1.5)%,12.5 μg/ml抑制率(15.4±1.9)%,25 μg/ml抑制率(22.2±2.1)%,50 μg/ml抑制率(35.7±4.0)%,100 μg/ml抑制率(55.3±5.3)%；OXA 0.125 μg/ml抑制率(5.3±0.6)%,0.25 μg/ml抑制率(8.3±1.1)%,0.5 μg/ml抑制率(12.4±1.7)%,1 μg/ml抑制率(20.1±2.2)%,2 μg/ml抑制率(33.7±3.6)%；鴉膽子油+OXA 0.125 μg/ml抑制率(8.2±1.0)%,0.25 μg/ml抑制率(12.3±1.6)%,0.5 μg/ml抑制率(22.4±2.5)%,1 μg/ml抑制率(40.3±4.7)%,2 μg/ml抑制率(66.5±6.4)%。鴉膽子油聯(lián)合OXA后對(duì)SGC-7901/COXA細(xì)胞較單用OXA增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，聯(lián)合用藥后OXA的IC50為1.29，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為4.16，因此SGC-7901/COXA細(xì)胞對(duì)OXA敏感性明顯增強(qiáng)。見圖1。

圖1 OXA單用與聯(lián)合鴉膽子油對(duì)SGC-7901/COXA 細(xì)胞增殖抑制對(duì)比

3 討 論

早期胃癌以手術(shù)切除治療為主，晚期胃癌以化療為主，目的主要在于提高患者生活質(zhì)量及延長生存時(shí)間。OXA為第三代鉑類抗癌藥物，具有抗癌譜廣，溶解性和穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，因此療效確切顯著，作為晚期胃癌標(biāo)準(zhǔn)治療方案〔1〕。國外一些關(guān)于OXA聯(lián)合化療方案研究結(jié)果表明，含OXA組患者總生存時(shí)間、有效率較順鉑組高，總生存時(shí)間10.7個(gè)月、有效率為41.3%，且血液、胃腸、腎毒性等不良反應(yīng)發(fā)生率低〔2，3〕。鉑類藥物抗腫瘤作用機(jī)制為藥物進(jìn)入細(xì)胞后，首先水解成化合物，然后進(jìn)一步去質(zhì)子化，生成羥基化的配位離子，與DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)，因此DNA 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致DNA 轉(zhuǎn)錄復(fù)制終止，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期，從而達(dá)到抗癌目的〔4〕。而鉑類藥物在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)，也會(huì)激活體內(nèi)一些其他的信號(hào)通過，這是其產(chǎn)生毒性不良反應(yīng)和耐藥的原因〔5〕。

腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要作用機(jī)制：(1)細(xì)胞內(nèi)藥物有效濃度下降。藥物泵出增加、攝取減少及藥物失活都可引起細(xì)胞內(nèi)藥物有效濃度下降。OXA在體內(nèi)代謝主要依賴于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)。GST不但具有解毒功能，還可促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)，因此可導(dǎo)致細(xì)胞耐藥發(fā)生。另外GST家族中人體腫瘤組織中存在大量的GSTP1，其作為GST家族中一員，可催化細(xì)胞內(nèi)大量如谷胱甘肽(GSH)、金屬硫蛋白等巰基分子，這些物質(zhì)與鉑類藥物共價(jià)結(jié)合后，使鉑類藥物停留在細(xì)胞質(zhì)，不能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA 發(fā)生交聯(lián)，使DNA產(chǎn)生損傷。另外還可增強(qiáng)鉑類藥物水溶性，使藥物排出增加，細(xì)胞內(nèi)藥物有效濃度降低，藥物抗腫瘤活性減弱。(2)DNA損傷修復(fù)作用增強(qiáng)。因DNA 損傷修復(fù)在一定程度上可以削弱鉑類藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。OXA在體內(nèi)產(chǎn)生耐藥及敏感性降低主要與切除修復(fù)互補(bǔ)交叉基因(ERCC1)、ERCC2、ERCC5等核苷酸切除修復(fù)因子有關(guān)〔6〕。其中ERCC1 在NER 系統(tǒng)中具有DNA損傷修復(fù)和核酸內(nèi)切酶的雙重功能，因此通過提高ERCC1 表達(dá)水平可以快速修復(fù)G2/M期的DNA 損傷，引起細(xì)胞對(duì)OXA耐藥反應(yīng)。而ERCC2 則具有多個(gè)單核苷酸多態(tài)性，其介導(dǎo)751 位密碼子由Lys 轉(zhuǎn)變?yōu)镚ln，影響OXA的治療效果。而ERCC5 作為一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，存在于多種腫瘤組織，其表達(dá)強(qiáng)弱與OXA藥物敏感性相關(guān)。(3)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異?！?〕。若轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被異常激活或者被抑制，細(xì)胞就會(huì)對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生抵抗及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用減弱。這些過程參與蛋白主要包括p53和Bcl-2家族蛋白〔8〕。另外，分泌型聚集素(sCLU)蛋白與OXA耐藥有關(guān)。sCLU可激活A(yù)Kt 通路引起細(xì)胞對(duì)OXA耐藥反應(yīng)，其表達(dá)水平與OXA介導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)〔9〕。

鴉膽子屬苦木科植物，從其干燥的成熟果實(shí)中可提取出脂肪油即鴉膽子油。鴉膽子油對(duì)多種癌癥的治療通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，進(jìn)一步抑制細(xì)胞DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組，阻斷癌細(xì)胞從G0/G1期細(xì)胞發(fā)展到S期；上調(diào)caspase信號(hào)通路周期相關(guān)蛋白p53，達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的目的。鴉膽子油還可以破壞細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)、線粒體系統(tǒng)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器等發(fā)揮直接殺傷癌細(xì)胞作用〔10〕。諸多研究提示鴉膽子油與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可提高治療效果，同時(shí)降低惡心嘔吐等不良反應(yīng)的發(fā)生，并能減少化療藥物導(dǎo)致出現(xiàn)的骨髓抑制、血常規(guī)下降等副反應(yīng)〔11〕。耿國軍等〔12〕通過鴉膽子油作用到肺腺癌細(xì)胞SPA-A1后觀察結(jié)果，肺腺癌細(xì)胞呈凋亡形態(tài)學(xué)改變，將肺癌腺細(xì)胞(SPA-A1)阻滯于G0/G1期；抑制肺腺癌SPA-A1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。魏紅斌〔13〕通過對(duì)325例胃癌患者進(jìn)行meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鴉膽子油聯(lián)合化療方案對(duì)胃癌患者進(jìn)行治療后，能提高胃癌患者療效，生活質(zhì)量得以改善，化療藥物副作用減輕。楊凡等〔14〕研究認(rèn)為鴉膽子油聯(lián)合化療能提高結(jié)腸癌患者化療效果，同時(shí)減輕化療的副反應(yīng)，具有增效減毒作用。有研究發(fā)現(xiàn)，OXA可影響鈉、鈣離子交換通道，從而引起神經(jīng)毒性的發(fā)生〔15〕。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子油對(duì)多藥耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用，并能明顯抑制ONA拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOPO)Ⅱ的活性。湯濤等〔16〕進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞增殖生長抑制實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳濃度為0.025 g/L時(shí)能在一定程度上逆轉(zhuǎn)K562/A02、MCF-7/ADM 和KB/VCR 等細(xì)胞的耐藥性。同時(shí)鴉膽子油能抑制由TOPOⅡ介導(dǎo)的κDNA 去連環(huán)作用，濃度為0.31 g/L時(shí)部分抑制TOPOⅡ酶活力，濃度為2.5 g/L可完全抑制ONA拓?fù)洚悩?gòu)酶TOPOⅡ酶活力。所以當(dāng)鴉膽子油與其他抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，鴉膽子油可發(fā)揮其耐藥逆轉(zhuǎn)作用，增強(qiáng)其他藥物對(duì)耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

本實(shí)驗(yàn)從體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了鴉膽子油聯(lián)合OXA臨床減毒增效作用，下一步將研究鴉膽子油逆轉(zhuǎn)OXA耐藥胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)OXA敏感性的具體機(jī)制。

1 Kang YK，Kang WK，Shin DB，etal.Capecitabine/cisplatin versus 5-fluorouracil/cisplatin as first-line therapy in patients with advanced gastric cancer：a randomised phase Ⅲ noninferiority trial〔J〕.Ann Oncol，2009；20(4)：666-73.

2 Dank M，Zaluski J，Barone C，etal.Randomized phase Ⅲ study comparing irinotecan combined with 5-fluorouracil and folinic acid to cisplatin combined with 5-fluorouracil in chemotherapy naive patients with advanced adenocarcinoma of the stomach or esophagogastric junction〔J〕.Ann Oncol，2008；19(8)：1450-7.

3 Cuningham D，Starling N，Rao S，etal.Capecitabine and oxaliplatin for advanced esophagogastric cancer〔J〕.N Engl J Med，2008；358(1)：36-46.

4 Kelland L.The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy〔J〕.Nat Rev Cancer，2007；7(8)：573-84.

5 Michalke B.Platinum speciation used for elucidating activation or inhibition of Pt-containing anti-cancer drugs〔J〕.J Trace Elem Med Biol，2010；24(2)：69-77.

6 Socinski M，Langer C，Okamoto I，etal.Safety and efficacy of weekly nab-paclitaxel in combination with carboplatin as first-line therapy in elderly patients with advanced non-small cell lung cancer〔J〕.Ann Oncol,2013;24(2):314-21.

7 Howell SB，Safaei R，Larson CA，etal.Copper transporters and the cellular pharmacology of the platinum-containing cancer drugs〔J〕.Mol Pharmacol，2010；77(6)：887-94.

8 More SS，Akil O，Ianculescu AG，etal.Role of the copper transporter CTR1 in platinum-induced ototoxicity〔J〕.J Neurosci，2010；30(28)：9500-9.

9 Chang CL，Hsu YT，Wu CC，etal.Dose-dense chemotherapy improves mechanisms of antitumor immune response〔J〕.Cancer Res，2013；73(1)：119-27.

10 齊錦宏，張麗珍.鴉膽子油乳注射液聯(lián)合適形放療治療局部晚期食管癌療效觀察〔J〕.河南醫(yī)學(xué)研究，2015；24(2)：60-2.

11 張力文，陳文磊.鴉膽子仁浸劑治療尖銳濕疣68例療效觀察〔J〕.新中醫(yī)，2016；48(5)：150-2.

12 耿國軍，余海彬，于修義，等.鴉膽子油乳對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016；36(4)：300-4.

13 魏紅斌.鴉膽子油乳注射液聯(lián)合化療治療胃癌療效的Meta分析〔D〕.蘭州：甘肅中醫(yī)學(xué)院，2014.

14 楊 凡，閆 涵，龐歆橋，等.鴉膽子油聯(lián)合化療治療結(jié)直腸癌效果的系統(tǒng)評(píng)價(jià)〔J〕.山東醫(yī)藥，2016；56(13)：45-7.

15 Krishnan AV，Goldstein D，F(xiàn)riedlander M，etal.Oxaliplatin and axonal Na+channel function in vivo〔J〕.Clin Cancer Res，2006；12(15)：4481-4.

16 湯 濤，蒙凌華，陳陵際，等.鴉膽子油乳具有多藥耐藥逆轉(zhuǎn)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制作用〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2001；17(5)：534-9.

〔2016-12-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

魏小果(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤研究。 石玉萍(1966-)，女，主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤研究。

楊 帆(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2017)08-1854-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.014