王永良 劉忠民 劉眉眉 李 靜 鄭 妍

(吉林大學體育學院，吉林 長春 130012)

不同負荷游泳運動對老齡大鼠心肌細胞形態(tài)及 Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

王永良 劉忠民 劉眉眉1李 靜 鄭 妍2

(吉林大學體育學院，吉林 長春 130012)

目的 探討不同負荷游泳運動對老齡大鼠心肌細胞中Bcl-2、Bax及HIF-1蛋白表達的影響及凋亡機制。方法 將48只22月齡雄性健康Wistar老齡大鼠隨機分為對照組(C)、大負荷組(H)、中等負荷組(M)和小負荷組(S)，每組12只，進行為期8 w的不同負荷的游泳運動；運動干預后解剖取樣，HE染色觀察心肌細胞形態(tài)學變化，免疫組織化學檢測心肌細胞Bcl-2、Bax和HIF-1蛋白表達。結果 S組老齡大鼠心肌中Bcl-2表達與C組(P<0.01)差異非常顯著，H組與C組(P<0.05)差異顯著，S組心肌Bax表達與C組(P<0.01)差異非常顯著，H組與C組(P<0.05)差異顯著，S組心肌細胞HIF-1α表達與C組(P<0.05)差異顯著，H組與C組(P<0.01)差異非常顯著。適宜的游泳運動(S組)心肌纖維排列有序，細胞間質(zhì)減少，心肌纖維肥厚，走向正常，著色比較均勻，且未觀察到肌絲斷裂，也無充血壞死現(xiàn)象發(fā)生。S組促進Bcl-2表達增加，Bax蛋白表達降低，進而抑制心肌細胞凋亡發(fā)生；大負荷運動或不適宜(H、M組)利于Bcl-2蛋白的表達減少，Bax蛋白的表達升高，進而促進心肌細胞凋亡的發(fā)生。結論 Bcl-2、Bax 蛋白表達變化是運動干預心肌細胞凋亡的調(diào)控機制之一。

游泳運動；心肌細胞形態(tài)；Bcl-2

研究表明〔1〕，長期中等強度的運動可造成大鼠心肌細胞中凋亡調(diào)控基因Bcl-2表達明顯增加，抑制心肌細胞凋亡；而力竭運動和過度運動可引起心肌細胞中Bcl-2表達下降、調(diào)控基因Bax表達顯著升高以及凋亡調(diào)控基因Bcl-2/Bax比值顯著下降，促進心肌細胞凋亡〔2〕。可見，運動負荷對心肌細胞凋亡有一定的影響。本研究擬分析不同運動負荷對心肌細胞Bcl-2和 Bax表達的影響。

1 對象與方法

1.1 動物與分組 22月齡自然老化雄性 Wistar大鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)2014-0001。48只大鼠體重(561.04±34.53)g；毛色正常，精神狀態(tài)良好，分籠飼養(yǎng)，每籠6只，溫度23℃～25℃，相對濕度50%～60%，自然光照；采用國家標準嚙齒類動物專用飼料，自由飲水進食，間隔1 d更換動物墊料。將48只Wistar大鼠隨機分為四組(每組12只)：對照組(C自由飼養(yǎng))、大負荷組(H)、中等負荷組(M)和小負荷組(S)。每周一到周六同一時間進行實驗，周日休息一天，每周一測一次體重。

1.2 游泳運動負荷的制定 結合劉忠民等〔3〕的不同負荷定量標準，制定本實驗不同組的運動負荷，S、M、H組運動負荷分別為15、30、60 min/d。實驗泳池選用高80 cm，直徑為60 cm，水深70 cm的圓形桶中進行，實驗整個過程水溫始終保持在(30±2)℃。為保持老齡大鼠的運動記憶，每天游泳運動安排在統(tǒng)一固定時間進行。

1.3 實驗動物取材與免疫組化染色測試 實驗結束后即刻對樣本大鼠進行解剖以便進行免疫組織化學檢測。首先將5 ml/只鹽酸利多卡因液麻醉大鼠，然后將其固定于手術臺上，打開胸腔暴露心臟，自左心室插管，迅速剪破右心耳，并快速灌注20 ml 0.9%生理鹽水沖洗，待見清水流出，隨后用4%多聚甲醛溶液緩慢灌注進行固定，直到大鼠全身僵硬，尤其尾部僵硬為止。固定后，提取心臟浸泡于甲醛固定液中，以備進行免疫組化檢測。按照免疫組化染色試劑的主要操作過程進行免疫組化陽性細胞判定：心肌細胞中Bcl-2、Bax、缺氧誘導因子(HIF)-1α陽性細胞呈棕黃色顆粒定位于細胞質(zhì)和細胞膜。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 老齡大鼠心肌組織形態(tài)結構 C組老齡大鼠心肌纖維排列結構紊亂，間隙較寬，間質(zhì)較多，肥大趨勢明顯。經(jīng)歷8 w不同負荷游泳運動后，H組老齡大鼠心肌纖維出現(xiàn)大量斷裂，發(fā)生了不同程度的運動性心肌肥大，毛細血管充血，心肌纖維橫截面出現(xiàn)的空白面積最大，有壞死現(xiàn)象發(fā)生；M 組大鼠心肌纖維斷裂現(xiàn)象明顯，毛細血管偶見輕度充血，橫斷面空白面積較大，與H 組比較未出現(xiàn)明顯的壞死現(xiàn)象；S組心肌纖維排列有序，細胞間質(zhì)減少，心肌纖維肥厚，走向正常，著色比較均勻，且未觀察到肌絲斷裂，也無充血壞死現(xiàn)象發(fā)生。見圖1。

2.2 不同負荷游泳運動對大鼠心肌細胞Bcl-2表達的影響 Bcl-2免疫反應陽性細胞定位在心肌細胞的胞漿和細胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒。S 組Bcl-2蛋白免疫反應陽性細胞居最高，H組最低，各組心肌細胞Bcl-2蛋白表達S組(0.24±0.05)，M組(0.14±0.03)，H組(0.07±0.04)，C組(0.13±0.02)，S組>M組>C組>H組(P<0.05，P<0.01)，見圖2。

2.3 不同負荷游泳運動對大鼠心肌細胞Bax蛋白表達 Bax免疫反應陽性細胞定位在心肌細胞的胞漿和細胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒。S 組Bax蛋白免疫反應陽性細胞處最低，H組居最高，各組間心肌細胞Bax蛋白表達為S組(0.04±0.02)，M組(0.12±0.02)，H組(0.18±0.02)，C組(0.12±0.04)；H組>C組>M組>S組(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

圖1 心肌細胞HE染色圖(×200)

圖2 Bcl-2免疫組化樣本陽性細胞表達圖(×200，箭頭所指處)

圖3 Bax免疫組化樣本表達圖(×200，箭頭所指處)

3 討 論

張昊等〔4〕在研究老齡大鼠運動訓練對心臟影響的研究功能中，老年運動組大鼠心肌超微結構觀察可見結構清晰，線粒體數(shù)目增多，基質(zhì)致密，脂褐素顆粒成績顯著減少。余冬敏〔5〕研究力竭游泳應激導致大鼠心肌損傷的實驗得出：長期力竭游泳應激會使心臟產(chǎn)生一系列病理及功能的改變,造成運動性心臟超負荷,破壞心肌局部組織結構,最終導致心肌損傷。郭勇力等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)：中等負荷組大鼠心肌組織無細胞壞死現(xiàn)象發(fā)生，心肌結構清晰且排列有序，心肌纖維組織與細胞核均未見異常，但力竭訓練組的大鼠心肌纖維受到不同程度的損傷，心肌組織橫紋呈現(xiàn)模糊或有的消失不見，細胞核出現(xiàn)破裂或溶解現(xiàn)象，且周邊區(qū)伴有充血狀。綜合以上學者研究結果，雖然不同運動負荷及運動時間不一，但適宜的運動負荷運動對大鼠心臟最有利的觀點并不相悖。

王艷艷等〔7〕研究藏紅花酸預處理對心肌缺血大鼠的心肌細胞保護作用機制發(fā)現(xiàn)可能與Bcl-2蛋白表達增多，Bax蛋白表達下降有關。李文娟〔8〕在抗阻練習對大鼠骨骼肌細胞凋亡影響的研究中顯示，大鼠進行10 w抗組訓練后促使D-半乳糖模型SD大鼠腓腸肌Bcl-2、Bax蛋白表達明顯減少;潘月順等〔9〕研究結果顯示：低強度運動負荷可促進Bcl-2表達，而中等強度運動負荷抑制Bax蛋白表達量，同時提高Bcl-2蛋白表達量，進而降低CHF大鼠心肌細胞的凋亡率；而高強度運動負荷心肌細胞Bax蛋白表達量顯著提高，進而使CHF大鼠心肌細胞凋亡率升高;陳淦等〔10〕研究表明：安靜對照組、中等和大強度運動組均有Bcl-2表達，中等強度運動組和安靜對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),大強度運動組和安靜對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),大強度運動組表達顯著低于中等強度運動組(P<0.05)。適宜運動可抑制心肌細胞Bax蛋白表達，同時促進Bcl-2表達升高，優(yōu)化Bcl-2/Bax比值，有效控制凋亡現(xiàn)象發(fā)生，保證心肌細胞生存能力，達到延緩心肌細胞衰老的效果。大量研究均證明：超負荷或力竭性運動都可加速心肌細胞凋亡發(fā)生〔11〕,不適宜的運動負荷會造成大鼠心肌細胞凋亡增加,并且可能參與心肌的損害過程。

本實驗研究結果表明，適宜的游泳運動促進Bcl-2表達增加，Bax蛋白表達降低，進而抑制心肌細胞凋亡發(fā)生；大負荷運動利于Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白的表達升高，進而促進心肌細胞凋亡的發(fā)生。提示Bcl-2、Bax 蛋白表達變化是運動干預心肌細胞凋亡的調(diào)控機制之一，與上述觀點并不相悖。

1 Oltvai ZH，Milliman CL,Korsmeyer SJ,etal.BCL-2 hetero dimerizs in vivo with a conserved homolog Bax，that accelerates program med cell death〔J〕.Cell，1993;74(4):609-19.

2 李明學,程珂玲.有氧運動對衰老模型大鼠心肌細胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(4):950-2.

3 劉忠民，劉慧佳，宋 燕，等.不同運動負荷對大鼠海馬神經(jīng)c-fos表達的影響〔J〕.中國實驗診斷學，2011;15(6)：963-4.

4 張 昊，王偉偉，薛 過，等.運動訓練通過誘導自噬、抑制凋亡改善老齡大鼠心臟功能〔J〕.中國病理生理雜志，2014;30(1)：11-7.

5 余冬敏.力竭游泳應激致大鼠心肌損傷的實驗研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學碩士論文，2014(2):38-9.

6 郭勇力，劉 霞，張文鋒，等.不同強度運動對大鼠心肌細胞凋亡的影響〔J〕.中國臨床康復，2004;8(9):1732-3.

7 王艷艷，孫經(jīng)武，樊維娜，等.藏紅花酸預處理對心肌缺血大鼠凋亡相關蛋白Bcl-2與Bax表達影響〔J〕.臨床心血管病雜志，2015;3(1)：93-6.

8 李文娟.抗阻練習對衰老大鼠骨骼肌細胞凋亡的影響〔D〕.上海：華東師范大學碩士論文，2008.

9 潘月順，仇 琪.不同負荷運動對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響〔J〕.中國運動醫(yī)學雜志，2014;32(12):1082-7.

10 陳 淦,湯長發(fā).不同強度運動對大鼠心肌細胞凋亡的影響〔J〕.生命科學研究,2012;16(2)：102-7.

11 張鶴亭.不同負荷運動對大鼠心肌細胞凋亡和Bcl-2蛋白表達的影響〔D〕.武漢：武漢體育學院，2008.

〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省科技廳自然科學基金項目(201215037)；吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術研究與開發(fā)項目(No.2013C011)；吉林市科技局專項研究項目(No.2015313013)

劉忠民(1960-)，男，教授，主要從事運動與健康科學研究。

王永良(1988-)，男，碩士，主要從事運動人體科學研究。

G804

A

1005-9202(2017)08-1857-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.015

1 長春公安醫(yī)院 2 日本早稻田大學體育科學研究科