黃國(guó)明 鈔雪林 陳建云

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科，江西 南昌 330006)

多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因敲除小鼠認(rèn)知功能的變化

黃國(guó)明 鈔雪林 陳建云

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科，江西 南昌 330006)

目的 觀察多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)基因敲除小鼠認(rèn)知功能的變化。方法 采用Western印跡及PCR方法檢測(cè)DAT基因敲除C57BL/6 J小鼠模型，通過(guò)對(duì)DAT基因敲除小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮試驗(yàn)及曠場(chǎng)試驗(yàn)研究小鼠認(rèn)知能力的變化。結(jié)果 在Morris 水迷宮試驗(yàn)中，與WT組小鼠相比，DAT基因敲除小鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，顯示其學(xué)習(xí)能力下降；在撤掉平臺(tái)后，其在原平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短，表明其記憶能力亦下降。在曠場(chǎng)試驗(yàn)中，與WT組小鼠相比，DAT基因敲除小鼠總的探索路程降低，雖然其自主興奮性運(yùn)動(dòng)增加，但多為無(wú)目的性運(yùn)動(dòng)，其在中央格停留時(shí)間及次數(shù)也下降，表明其探索好奇能力明顯下降。結(jié)論 敲除小鼠DAT基因可導(dǎo)致小鼠多動(dòng)，同時(shí)損傷小鼠的認(rèn)知功能，表明DAT基因可能和學(xué)習(xí)、記憶、探索能力有關(guān)。

多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；認(rèn)知功能；Morris 水迷宮試驗(yàn)；曠場(chǎng)試驗(yàn)

多巴胺(DA)在行為、認(rèn)知、情感、獎(jiǎng)賞等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動(dòng)中具有重要作用。DA能系統(tǒng)異常參與導(dǎo)致精神分裂癥、藥物成癮、帕金森疾病、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、路易體癡呆、阿爾茨海默病、注意力缺陷多動(dòng)癥等多種神經(jīng)精神疾病。DA能神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)的傳遞受突觸間隙DA濃度的影響，即同時(shí)受DA能神經(jīng)元合成釋放DA到突觸間隙的能力及DA轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)重?cái)z取突觸間隙內(nèi)DA到神經(jīng)末梢的能力調(diào)控〔1，2〕。本研究采用DAT基因敲除小鼠模型(DAT-KO)，探討DAT基因敲除后小鼠認(rèn)知功能的變化。

1 材料和方法

1.1 材料 純合子DAT基因敲除C57BL/6 J小鼠(基因型DAT-/-)為HO組，DAT基因敲除C57BL/6 J小鼠(基因型DAT+/-)為HET組，野生型C57BL/6 J小鼠(基因型DAT+/+)為WT組，每組13只，20月齡，來(lái)源于上海軟隆科技發(fā)展有限公司。WT組小鼠均重40～43 g，皮毛光滑，飲食、 活動(dòng)、體質(zhì)量增長(zhǎng)正常；HET組小鼠均重35～40 g，皮毛光滑，飲食、 活動(dòng)、體質(zhì)量增長(zhǎng)正常；HO組小鼠均重32～36 g，皮毛不整，飲食正常，多動(dòng)。

1.2 方法 各組取3只小鼠斷頭處死，取大腦組織。(1)PCR驗(yàn)證基因型：以100 mg組織加入1 ml Trizol勻漿提取總RNA。按照TAKA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，-80℃冷凍保存。引物設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)GenBank所給出的基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因的引物，GAPDH上游引物5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCG-3'，下游引物5'-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3'；DAT上游引物5'-GGCGGGAGTGGTATTATGAA-3'，下游引物5'-GTGATCCGGAAGGACTGATT-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。real-time PCR反應(yīng)：以cDNA為模板，在7500 real-time PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法計(jì)算各組的RNA表達(dá)差別。

(2)Western印跡驗(yàn)證基因型：以1 g組織加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min。4℃，10 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度為1 μg/μl，分裝后-80℃冷凍保存。取相同質(zhì)量的裂解緩沖液上樣進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛奶封閉1 h，分別用抗GAPDH抗體(1∶1 000；Abcam公司)及抗DAT抗體(1∶1 000；Abcam公司)孵育4℃過(guò)夜，用TBST溶液洗膜后，加入1∶5 000稀釋二抗室溫孵育1 h，洗膜后ECL顯色掃描。應(yīng)用Image J分析軟件進(jìn)行灰度掃描分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.1 Morris水迷宮試驗(yàn) 水迷宮裝置為一圓形水池，直徑150 cm，高50 cm，水深28 cm，水溫(25±1)℃，可升降平臺(tái)直徑8 cm，高25 cm。水迷宮分為 4個(gè)象限，水池上方由攝像頭與計(jì)算機(jī)相連，記錄小鼠游泳軌跡，水迷宮測(cè)試時(shí)環(huán)境應(yīng)保證黑暗和安靜，避免小鼠的行為受外界干擾。

(1)定位航行試驗(yàn)(反映空間記憶的獲得能力)：在水池內(nèi)某一位置固定平臺(tái)，將小鼠面向池壁放入水中，記錄其在 2 min 內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)和路程，小鼠找到并爬上平臺(tái)后，讓其停留5 s，若小鼠入水后2 min內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)置于平臺(tái)上，并停留10 s，此時(shí)記錄逃避潛伏期為 120 s。每日于固定的時(shí)間訓(xùn)練2次(上午9：00，下午2：00)，連續(xù)5 d。每次訓(xùn)練完成后迅速將小鼠擦干。每日各小鼠逃避潛伏期用2次訓(xùn)練的均值表示。

(2)空間探索實(shí)驗(yàn)(檢測(cè)空間記憶的保持能力)：在第6天(即為期5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后)去除平臺(tái)，將小鼠從固定象限中點(diǎn)面朝池壁放入水中，記錄小鼠2 min池內(nèi)活動(dòng)情況，通過(guò)分析獲得2 min內(nèi)小鼠經(jīng)過(guò)原平臺(tái)所在靶象限的時(shí)間。

1.2.2 曠場(chǎng)試驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新環(huán)境中自主行為、探究行為與恐懼焦慮感的一種常用方法。小鼠由于對(duì)新開(kāi)闊環(huán)境恐懼而主要在周邊區(qū)域活動(dòng)，但其探究特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的動(dòng)機(jī)，小鼠在中央格停留時(shí)間及次數(shù)代表其探索好奇的程度。實(shí)驗(yàn)采用長(zhǎng)寬高均為50 cm的無(wú)頂塑料箱，內(nèi)壁為黑色，底部分為25個(gè)等份小方格。將小鼠從中央格放入箱內(nèi)，由攝像系統(tǒng)記錄小鼠5 min內(nèi)的探索活動(dòng)，追蹤其探索路程及在中央格停留時(shí)間及次數(shù)。每只老鼠適應(yīng)結(jié)束后用酒精擦拭箱子，避免前只老鼠氣味干擾。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Tukey法。

2 結(jié) 果

2.1 Western印跡及PCR驗(yàn)證小鼠基因型 DAT mRNA在HO組基本不表達(dá)(0.09±0.02)，HET組(0.65±0.14)較WT組(1.19±0.78)下降50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步采用Western印跡對(duì)小鼠腦組織蛋白進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DAT蛋白在HO組也基本不表達(dá)(0.07±0.01)，HET組DAT蛋白水平(0.34±0.11)則較WT組(0.79±0.24)下降70%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。表明建立DAT基因敲除小鼠模型成功。

圖1 各組大鼠DAT蛋白相對(duì)表達(dá)水平

2.2 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 DAT基因敲除對(duì)小鼠學(xué)習(xí)能力的影響 各組小鼠的平均逃避潛伏期均逐漸縮短(圖2)。經(jīng)過(guò)5 d的Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，WT組、HET組、HO組第5天逃避潛伏期均值分別為(36.32±8.76)s，(68.12 ± 8.15)s，(90.03 ±11.81)s，均短于第1天的(53.39 ±10.45)s，(85.97 ± 8.10)s，(110.20 ±2.32) s(P<0.01)。表明隨著定位航行訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組小鼠都具有了一定的空間學(xué)習(xí)能力。同時(shí)HET組及HO組平均逃避潛伏期均明顯高于WT組，表明其空間學(xué)習(xí)能力較WT組下降。

圖2 各組大鼠定位航行試驗(yàn)平均逃避潛伏期變化

2.2.2 DAT基因敲除對(duì)小鼠記憶能力的影響 在訓(xùn)練小鼠完成5 d的 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)后，于第6天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，與WT組〔43.14±7.23)s〕比較，HET組〔(23.31±4.28)s〕在原平臺(tái)所在象限的活動(dòng)時(shí)間稍有延長(zhǎng)，HO組〔14.21±5.31)s〕明顯短于WT組(P<0.05，P<0.01)，表明基因敲除可損傷小鼠的記憶能力。

2.3 曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 各組小鼠探索路程 WT組探索路程(1 708.30±58.95)cm，HET組(1 671.40±59.96)cm，HO組(909.70±38.15)cm，HET組與WT組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而HO組小鼠明顯低于WT組(P<0.01)。

2.3.2 各組小鼠中央格停留時(shí)間及次數(shù) 與WT組〔(43.15±9.78)s、(10.12±2.33)次〕比較，HET組〔(21.15±7.08)s、(5.42±1.33)次〕中央格停留時(shí)間及次數(shù)均低于WT組(P<0.05)；HO組〔(10.04±3.28)s、(2.12±1.01)次〕明顯低于WT組(P<0.01)，表明基因敲除可降低小鼠探索好奇能力。

3 討 論

DA是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在腦內(nèi)發(fā)揮極其重要的功能〔3〕，DA參與的神經(jīng)通路有黑質(zhì)-紋狀體通路(調(diào)節(jié)軀體自主運(yùn)動(dòng))，該通路受損可導(dǎo)致帕金森病及其他運(yùn)動(dòng)障礙性疾病〔4〕；以及中腦-皮層傳導(dǎo)束和中腦-邊緣傳導(dǎo)束(參與情緒、行為動(dòng)機(jī)和學(xué)習(xí)記憶等心理和認(rèn)知功能的調(diào)節(jié))障礙〔5〕，該通路異常則與精神分裂、藥物成癮相關(guān)〔6〕。DAT位于DA能神經(jīng)元突觸周?chē)募?xì)胞膜上，是一種Na+/Cl-依賴轉(zhuǎn)運(yùn)體〔7〕，它的主要功能是重?cái)z取突觸間隙內(nèi)的DA，從而調(diào)控突觸間隙內(nèi)DA的有效濃度，維持DA循環(huán)，減少對(duì)新合成DA的需求，保持DA在神經(jīng)元中的穩(wěn)態(tài)〔8〕。敲除 DAT基因破壞突觸間隙內(nèi)DA的重?cái)z取及清除過(guò)程，Isingrini等〔9，10〕研究結(jié)果顯示敲除DAT基因?qū)е峦挥|間隙內(nèi)DA存在時(shí)長(zhǎng)增加100倍；Gainetdinov等〔11，12〕研究也表明敲除DAT基因?qū)е峦挥|間隙內(nèi)DA水平至少升高 5 倍，存在時(shí)間延長(zhǎng) 300 倍。因此，敲除DAT基因可能會(huì)對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、情緒等各方面產(chǎn)生重要影響。

本研究通過(guò)對(duì)DAT基因敲除小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮試驗(yàn)及曠場(chǎng)試驗(yàn)研究小鼠認(rèn)知能力的變化，結(jié)果顯示，敲除DAT基因可能導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)、記憶、探索能力均下降，導(dǎo)致小鼠認(rèn)知減退。

研究發(fā)現(xiàn)DAT基因敲除小鼠的行為學(xué)表型研究發(fā)現(xiàn)，完全敲除DAT的 DAT-KO小鼠表現(xiàn)為自發(fā)性興奮性運(yùn)動(dòng)明顯增加，同時(shí)其曠場(chǎng)試驗(yàn)及水迷宮試驗(yàn)?zāi)芰ο陆怠?3〕，但Spielewoy等〔14〕認(rèn)為曠場(chǎng)試驗(yàn)及水迷宮試驗(yàn)?zāi)芰ο陆档脑驗(yàn)樾∈蟮淖园l(fā)性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致其無(wú)法進(jìn)行學(xué)習(xí)、探索試驗(yàn)，未明確提出其認(rèn)知能力下降。Del′Guidice等〔15〕采用H型迷宮試驗(yàn)檢測(cè)DAT基因敲除小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，認(rèn)為小鼠多動(dòng)不干擾其認(rèn)知能力，敲除小鼠DAT基因?qū)е滦∈笳J(rèn)知能力下降，與本研究結(jié)果一致。利用PET檢測(cè)人大腦發(fā)現(xiàn)DAT的表達(dá)量下降與大腦老化相關(guān)，DAT的下降與路易體癡呆相關(guān)，同時(shí)DAT SPECT技術(shù)正被探索用于區(qū)分帕金森病、路易體癡呆及阿爾茨海默病〔16〕，這可能與DAT缺失導(dǎo)致突觸間隙DA量升高有關(guān)，Morice等〔17〕發(fā)現(xiàn)給予DAT-KO小鼠DA競(jìng)爭(zhēng)性抑制藥物可以改善認(rèn)知能力下降，認(rèn)為DAT基因敲除導(dǎo)致的突觸間隙高DA水平參與導(dǎo)致認(rèn)知能力下降。目前認(rèn)為DA、五羥色胺、煙堿等均與認(rèn)知功能相關(guān)，有研究表明給予DAT-KO小鼠尼古丁可以改善其認(rèn)知能力下降〔18，19〕。運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知能力的維持可能有賴于腦內(nèi)多種遞質(zhì)間的平衡〔20〕，包括DA在內(nèi)的大腦遞質(zhì)系統(tǒng)與認(rèn)知功能之前的關(guān)系尚需更多機(jī)制研究。

本研究結(jié)果表明敲除小鼠DAT基因不僅導(dǎo)致小鼠自主性興奮性運(yùn)動(dòng)增加，而且導(dǎo)致小鼠認(rèn)知能力降低，DAT基因參與學(xué)習(xí)、記憶、探索能力的調(diào)控，為進(jìn)一步研究相關(guān)的神經(jīng)疾病提供了理論基礎(chǔ)。

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〔2016-12-26修回〕

(編輯 滕欣航)

黃國(guó)明(1979-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事老年精神障礙研究。

R395.4

A

1005-9202(2017)08-1866-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.019