程瑞斌+劉靜

（咸寧市中心醫(yī)院湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院 檢驗科，湖北咸寧 437100）

[摘 要] 目的：分析基因芯片檢測乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）分型和耐藥突變的準確度靈敏度，探討其臨床應(yīng)用價值。方法：以我院2014年5月至2016年9月確診且符合入組標準的351例乙型病毒性肝炎患者為研究對象，采用基因芯片法檢測其血清標本HBV基因分型及核苷酸類藥物突變情況，以DNA直接測序法為金標準，計算基因芯片檢測HBV分型和耐藥突變的準確度靈敏度。結(jié)果：基因芯片與基因測序檢測HBV分型、耐藥突變結(jié)果完全一致。以基因測序檢測結(jié)果為金標準，基因芯片檢測HBV分型和耐藥突變的準確度為100%；基因芯片檢測HBV分型和耐藥的最低檢出限為103 copies/mL。結(jié)論：基因芯片技術(shù)在HBV分型和耐藥突變的檢測中具有較高的準確度及靈敏度，能夠為臨床抗病毒藥物的選擇提供可靠的參考。

[關(guān)鍵詞] 基因芯片；乙肝病毒分型；耐藥突變；準確度；靈敏度

中圖分類號：R446.1 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2017）04-062-03

DOI：10.11876/mimt201704025

安全、有效的抗病毒治療對于延緩乙型病毒性肝炎病情進展具有重要意義[1]。然而，HBV包括多種基因型，不同基因型耐藥特點存在差異，耐藥嚴重影響了抗病毒治療效果[2]。當前臨床明確HBV耐藥突變檢測的金標準為DNA直接測序法，但存在成本高、耗時久等弊端，無法滿足快速診斷、大規(guī)模推廣要求[3]。本研究就基因芯片檢測HBV分型及耐藥突變的準確度及靈敏度進行分析，旨在評估該技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以我院2014年5月—2016年9月參照2010年全國傳染病與寄生蟲病學(xué)術(shù)會議擬定的《病毒性肝炎防治方案》確診的乙型病毒性肝炎患者為研究對象。入組患者乙肝表面抗原（HBsAg）及HBV DNA檢測均為陽性（HBV DNA≥1×103 IU/mL），排除合并其他類型肝炎及免疫性肝病、膽汁型肝硬化患者及基因芯片檢測無信號者[4]共351例入選。其中男189例，女162例，年齡17～71歲，平均年齡（48.42±10.58）歲。351例患者均有長期（≥48周）核苷類抗病毒藥物使用史，其中208例接受拉米夫定治療，143例接受阿德福韋酯治療。本研究已征得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 抽取患者入組次日空腹靜脈血4 mL，分裝于4支抗凝管內(nèi)，分別用于基因芯片法HBV基因分型、耐藥突變檢測及基因測序法HBV基因分型、耐藥突變檢測。

1.2.2 標本檢測 基因芯片：HBV基因分型及耐藥突變檢測試劑均購自深圳亞能生物技術(shù)有限公司，使用Biomctra基因擴增儀及FYY-3型分子雜交儀（興化市分析儀器廠），操作均嚴格按照試劑使用說明書。擴增循環(huán)條件：95℃ 10 min→94℃ 34 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s，重復(fù)循環(huán)50次。結(jié)果分析使用光學(xué)掃描儀[5]。HBV膜條探針排列順序設(shè)計見表1?；驕y序：取第二次聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增產(chǎn)物，委托華大基因公司完成基因測序。

1.2.3 結(jié)果分析 根據(jù)基因芯片、基因測序檢測結(jié)果，分析患者HBV分型及耐藥突變，以基因測序檢測結(jié)果為金標準，計算基因芯片檢測HBV分型及耐藥突變的準確度、靈敏度及特異性[6]。此外，為驗證基因芯片對HBV分型和耐藥檢測的準確性，應(yīng)用實時定量PCR法確認標本載量并制成104、103、102 copies/mL濃度，分析基因芯片的最低檢出限[7]。

2 結(jié)果

基因芯片與基因測序檢測HBV分型結(jié)果完全一致，均為B型211例、C型53例、B+C型87例?；蛐酒瑴蚀_度100%。

351例患者中有126例患者耐藥基因突變耐藥，基因芯片與基因測序檢測HBV耐藥突變結(jié)果相同，具體見表2，準確度為100%。

以基因測序檢測結(jié)果為金標準，基因芯片檢測HBV分型和耐藥突變的靈敏度及特異性均為100%；基因芯片檢測HBV分型和耐藥的最低檢出限為103 copies/mL。

3 討論

核苷類似物是臨床治療病毒性乙型肝炎的常用方案，其口服給藥方便、病毒抑制作用較強等優(yōu)勢已得到廣泛認可，且可用于肝功能失代償者，但該類抗病毒藥物HBeAg轉(zhuǎn)換率偏低，療效持久性不足，會導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[8-9]。HBV耐藥突變的發(fā)生，可造成HBV DNA再次升高、轉(zhuǎn)氨酶反彈等，對治療效果造成不良影響 [10]。與此同時，不同HBV基因型對干擾素的應(yīng)答、疾病進程的影響存在差異[11]，因此，在明確HBV耐藥突變的同時，了解HBV分型對于指導(dǎo)治療方案的選擇亦有著重要意義。

當前臨床判斷HBV分型與耐藥突變主要依據(jù)基因測序技術(shù)，目前該技術(shù)耗時久、操作煩瑣且成本高昂 [12]。作為一種新型生物芯片技術(shù)，基因芯片檢測主要根據(jù)分子間特異性相互作用的原理，通過集成于硅芯片或玻璃芯片內(nèi)微型生化分析系統(tǒng)，全面了解基因及其他生物組分信息，具有準確、快速、信息量大的優(yōu)勢[13]。與傳統(tǒng)檢測手段相比，基因芯片技術(shù)具有無污染、成本低、自動化、微型化等特點，且可檢測已知突變位點，故在HBV分型和耐藥突變方面有著良好的應(yīng)用前景[14]。

為明確基因芯片技術(shù)檢測HBV分型與耐藥突變的價值，本研究結(jié)果表明，基因芯片與測序在HBV分型和耐藥突變的檢測準確度方面具有一致性，這主要得益于HBV耐藥變異基本為單堿基變異，而寡核苷酸基因芯片技術(shù)在單次檢測中即可明確與HBV耐藥性相關(guān)的單堿基變異，一般不會導(dǎo)致誤判或漏檢[15-16]。

本研究篩選過程中8例患者因基因芯片無信號而未入組，無信號的原因可能是由于DNA拷貝數(shù)低于基因芯片的最低極限。在靈敏度的分析中，最低檢出限亦為重要指標。本研究制成不同階梯濃度的標本，就基因芯片技術(shù)的最低檢出限進行了分析，結(jié)果表明，該技術(shù)最低檢出限可達103 copies/mL，顯現(xiàn)出其在檢測靈敏度方面較高的價值。

需要注意的是，由于基因芯片技術(shù)僅可檢測已知位點的耐藥變異，無法發(fā)現(xiàn)新的變異位點并針對性設(shè)計引物與探針，故在了解易突變區(qū)域完整序列、發(fā)現(xiàn)新的耐藥突變位點方面存在不足[18]。隨著臨床對于HBV耐藥突變研究的不斷深入，以及更多新的耐藥位點的探索，基因芯片技術(shù)在HBV耐藥突變檢測環(huán)節(jié)的應(yīng)用價值有望得到顯著提高，但仍無法完全取代基因測序技術(shù)。

參 考 文 獻

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第一作者：程瑞斌，大專，檢驗主管技師，研究方向：檢驗臨床，Email：chengruibin@sina.com。