馬 力

·實(shí)驗(yàn)研究·

去氫甲睪酮單克隆抗體免疫親和柱的制備與應(yīng)用研究

馬 力

目的 為了防止去氫甲睪酮(MA)濫用，對(duì)其殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)，迫切需要一種有效、方便、快速的檢測(cè)方法。方法 將MA單克隆抗體與CNBr-Sepharose 4B偶聯(lián)制備獲得去氫甲睪酮單克隆抗體免疫親和柱(IAC)，同時(shí)對(duì)色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化、對(duì)IAC的性能及實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。結(jié)果 IAC對(duì)MA的最大柱容量是4.76 μg /g干膠，最佳上樣和洗脫緩沖液分別為2%和70%的甲醇；柱子重復(fù)使用3次，柱容量和回收率分別為93.4%和81.1%。為進(jìn)一步研究基質(zhì)對(duì)提取效率的影響，用IAC對(duì)加標(biāo)肉制品和中藥材樣品進(jìn)行凈化處理，其回收率為78.7%～95.1%。結(jié)論 試驗(yàn)制備了對(duì)MA具有特異性吸附的IAC，并對(duì)其用于中藥材等實(shí)際樣品進(jìn)行凈化處理的應(yīng)用前景進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

去氫甲睪酮；單克隆抗體；免疫親和柱；ELISA

去氫甲睪酮(1-dehydro-17a-methyltesto- sterone，MA)，是一種人工合成的甾類雄性蛋白同化激素，具有增加蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)肌肉增長(zhǎng)和提高中藥材轉(zhuǎn)化率等作用，因而MA作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1]。但是，消費(fèi)者長(zhǎng)期攝入含有此類激素類藥物的動(dòng)物源性食品會(huì)導(dǎo)致肝功能損害、生育能力降低、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及精神和行為障礙等[2-4]。因此，世界上很多國(guó)家對(duì)MA在畜牧業(yè)上的應(yīng)用都有嚴(yán)格限制。為了防止MA濫用，我院2012年6月-2015年9月對(duì)其殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)，迫切需要一種有效、方便、快速的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑:豬肉樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?，中藥材粉末樣品本院藥劑科提供；MA、群勃龍(TR)、丙酸睪酮(TP)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品；CNBr-Sepharose 4B購(gòu)自GE-Healthcare公司；高效液相色譜級(jí)甲醇購(gòu)自Fisher Scientific公司，其余試劑均為分析純購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備:Synergy HT多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bio-TEK instruments公司)；Cary 100紫外光譜儀(Varian Medical Systems公司)；小型垂直電泳槽(Bio- Rad Laboratories公司)；5415R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；超純水系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)。

1.3 MA單克隆抗體的純化:以實(shí)驗(yàn)室之前獲得的雜交瘤細(xì)胞(穩(wěn)定分泌去氫甲睪酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1D6F10B4，江蘇大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))進(jìn)行克隆和擴(kuò)大培養(yǎng)、制備腹水單抗。單抗純化采用使用正辛酸—飽和硫酸銨法，并用SDS-PAGE對(duì)純化后的單抗進(jìn)行純度評(píng)價(jià)。利用紫外分光光度法測(cè)定純化后的MA單抗在280 nm和260 nm處的吸光度，其濃度(mg/mL)=1.45A280 nm- 0.74A260 nm計(jì)算。

1.4 凝膠電泳:純化抗體在12%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色。

1.5 IAC的制備:參照CNBr-Sepharose 4B的產(chǎn)品說(shuō)明書并略作修改，具體步驟如下：將純化后的單抗對(duì)pH 8.3、0.1 mol/L NaHCO3(含0.5 mol/L NaCl)的偶聯(lián)緩沖液透析過(guò)夜，并稀釋到一定濃度備用。準(zhǔn)確稱取CNBr-Sepharose 4B干膠0.05 g，于5 mL 1 mmol/L HCl溶液中充分溶脹。用10倍體積以上的偶聯(lián)緩沖液快速洗滌，4 000 r/min離心1 min，2次離心； 取洗滌后的1 mL濕膠，迅速加入2 mL一定濃度的抗體溶液，于室溫下振蕩反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，用10倍體積以上的偶聯(lián)緩沖液洗滌除去未偶聯(lián)的抗體，收集洗滌液，計(jì)算偶聯(lián)率；加入5倍體積的pH 8.0、0.1 mol/L Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl)，室溫下振蕩封閉2 h；先后用5倍體積pH 4.0 的0.1 mol/L 醋酸鹽緩沖液(含0.5 mol/L NaCl)、pH 8.0的0.1 mol/L Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl)交替洗滌3次，然后用pH 7.4的0.01 mol/L PBS 洗滌2次，進(jìn)行裝柱。

1.6 IAC提取條件優(yōu)化:為了提高IAC提取效率，其上樣和洗脫緩沖液的優(yōu)化參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]。將500 ng的MA分別溶解在2%、5%或10%的甲醇/水(v/v)溶液中，上樣，充分沖洗后除去非特異性結(jié)合的MA。然后用5 mL洗脫緩沖液(60%、70%、80%、90%、100%甲醇-水溶液)進(jìn)行洗脫，收集沖洗和洗脫組分，用ELISA方法檢測(cè)MA量。一抗是文中1.3制備的單抗，二抗是HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品，方法參照文獻(xiàn)成熟方法技術(shù)。

1.7 柱容量測(cè)定:IAC的柱容量測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]。在最佳提取條件下，將2 mg MA溶解在10 mL 2%的甲醇溶液中，連續(xù)上樣液(1.0 mL/次)，利用固定相的結(jié)合特性來(lái)吸附目標(biāo)產(chǎn)物，達(dá)到分離純化的液相色譜方法測(cè)定穿過(guò)組分中MA的含量并計(jì)算最大柱容量。

1.8 基質(zhì)對(duì) IAC凈化效果的影響:為了研究基質(zhì)對(duì)IAC凈化效果的影響，豬肉和中藥材樣品中分別添加1.2 ng/g和4.8 ng/g水平的MA。將5 g豬肉樣品進(jìn)行勻漿，并在20 mL叔丁基甲基醚中振蕩5 min[7]，超聲提取10 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，并用叔丁基甲基醚重復(fù)萃取2次，合并萃取液，旋干。將殘余物溶解在3 mL 2%甲醇中，上樣，收集洗脫液測(cè)定MA的含量，并計(jì)算IAC凈化的回收率。中藥材粉末樣品的處理步驟與豬肉樣品相似，用50%的乙醇/水(v/v)代替叔丁基甲基醚。

2 結(jié)果

2.1 MA單克隆抗體的純化和表征:由于(NH4)2SO4沉淀法簡(jiǎn)便且抗體損失量較小，在本實(shí)驗(yàn)中用來(lái)純化MA抗體。通過(guò)測(cè)定280 nm和260 nm處的吸光度，純化后的單克隆抗體濃度為3.4 mg/mL。SDS-PAGE分析表明抗體已被有效純化(圖1)。

2.2 IAC色譜條件的優(yōu)化:上樣和洗脫條件決定了分析物(抗原)—抗體的結(jié)合和分離狀態(tài)以及抗體的活性，因而在很大程度上影響著IAC凈化處理效率。本試驗(yàn)中選用3種不同的上樣緩沖液(2%、5%和10%的甲醇)，結(jié)果表明甲醇濃度對(duì)結(jié)合率沒(méi)有顯著影響(97.2%、100.3%和95.4%)，因此，選擇低濃度2%的甲醇作為上樣緩沖液。

圖1 純化后MA單抗的SDS-PAGE

不同洗脫緩沖液(60%、70%、80%和90%的甲醇/水溶液)的解吸能力如圖2所示，隨著甲醇濃度由60%到90%，MA的洗脫量也由74.4%提高到91.1%。根據(jù)蛋 白質(zhì) 中組氨酸、色氨酸或半胱氨酸等，氨基酸殘基與色譜柱上的金屬離子螯合作用形成絡(luò)合物，從而實(shí)現(xiàn)分離蛋白質(zhì)的目的。

圖2 不同甲醇體積分?jǐn)?shù)下洗脫組分中MA的含量

雖然甲醇濃度越高，解吸效率越高，但是對(duì)抗體的損害也越大。因此，選擇70%的甲醇作為洗脫液，柱中80%以上的MA可以被洗脫。

2.3 IAC的特性:在最佳提取條件下，對(duì)IAC的最大柱容量及柱之間的變異性和重復(fù)使用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。將10 mL 200 ng/mL的MA溶液連續(xù)上樣過(guò)柱，每1 mL收集1管，測(cè)定MA含量。前5 mL穿過(guò)液中幾乎檢測(cè)不到MA，上樣第6 mL時(shí)，穿過(guò)液中檢測(cè)到10 ng MA。因此，計(jì)算得該IAC柱的最大柱容量為4.76 μg MA/g干膠，見表1。

隨機(jī)取6個(gè)IAC柱，分別用含50 ng、250 ng和500 ng的MA溶液上樣，收集洗脫組分測(cè)定MA含量并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，MA回收率在76%～97%，柱與柱之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為8.5%，表明所制備IAC具有較好的重現(xiàn)性。

連續(xù)上樣，收集洗脫組分，測(cè)定回收率。如圖3、圖4所示，經(jīng)過(guò)3次使用后，IAC柱仍有93.4%的柱容量和81.1%的回收率，表明所制備IAC具有較好的穩(wěn)定性。

表1 MA的IAC柱之間的重復(fù)性

圖3 IAC柱容量測(cè)定

圖4 重復(fù)使用后IAC柱容量和回收率變化曲線

2.4 基質(zhì)對(duì)IAC凈化效率的影響:FAO/WHO[7]規(guī)定的MA結(jié)構(gòu)類似物TR最大殘留量為2.0 ng/g，因此設(shè)定1.2 ng/g和4.8 ng/g 2個(gè)水平的加標(biāo)量，進(jìn)行實(shí)際樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，樣品中MA回收率為78.7%～95.1%。結(jié)果表明，所制備IAC能夠有效用于動(dòng)物組織和中藥材樣品的凈化處理，見表2。

表2 IAC凈化處理食品和中藥材樣品中MA的回收率(n=3)

3 討論

目前，食品或中藥材中MA殘留檢測(cè)常用氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等儀器分析方法。這些方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但是由于目標(biāo)分析物量級(jí)小且樣品基質(zhì)復(fù)雜，在儀器分析前要對(duì)樣品進(jìn)行大量的預(yù)處理。傳統(tǒng)的樣品前處理方法如索氏提取、液液分配和固相萃取等，其敏感性和再現(xiàn)性較差，所用試劑量較大，操作費(fèi)時(shí)。而免疫親和色譜(IAC)方法是以抗體和抗原之間的特異性和可逆結(jié)合為原理對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離，是一種強(qiáng)有力的分離技術(shù)[7-8]。由于其特異性高、操作簡(jiǎn)單，IAC被廣泛應(yīng)用在真菌毒素、獸藥、農(nóng)藥和重金屬殘留量檢測(cè)的樣品前處理。我們實(shí)驗(yàn)室已成功制備了MA多克隆抗體IAC柱，但與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有更好的均一性、重復(fù)性。本試驗(yàn)制備了對(duì)MA具有特異性吸附的IAC，并對(duì)其用于食品或中藥材等實(shí)際樣品進(jìn)行凈化處理的應(yīng)用前景進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備獲得了去氫甲睪酮單克隆抗體免疫親和柱，優(yōu)化建立了免疫親和凈化處理?xiàng)l件，并對(duì)IAC的性能和實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，IAC凈化處理的上樣和洗脫條件分別為2%和70%甲醇溶液，IAC的柱容量為4.76 μg MA/g干膠；柱和柱之間的變異系數(shù)不高于8.5%，重復(fù)使用3次后，IAC的柱容量和回收率仍高于93.4%和81.1%；使用IAC對(duì)食品和中藥材粉末樣品中MA進(jìn)行凈化處理，回收率為77.7%～95.1%。

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Preparation and application research of immunoaffinity column for the selective extraction of metandienone

MALi.

NingxiaResearchInstituteofTraditionalChineseMedical,Yinchuan750021,China

Objective To prevent the abuse of MA,an effective and convenient method was used to detect the residue.Methods Immunoaffinity column(IAC)was prepared by coupling CNBr-activated Sepharose with the metandienone monoclonal antibody(mAb)2% methanol and 70% methanol were selected respectively as loading and eluting solution by optimization.The maximum binding capacity of the column for MA reached 4.76 μg/g gel.After three times of usage,the binding capacity and recovery still remained 93.4% and 81.1% respectively.Results To further verify the effect of matrices on the extraction efficiency,the IAC was challenged with MA-fortified meat and herbal medicines and the recovery rate were found to be in the range of 78.7%～95.1%.Conclusion IAC with specific absorption of MA is prepared and the application prospect of the purification treatment was evaluated.

Metandienone;Monoclonalantibody；IAC；ELISA

10.13621/j.1001-5949.2017.04.0334

寧夏中醫(yī)研究院，寧夏 銀川 750021

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170328.2214.022.html

R 927.2

A

2016-11-11 [責(zé)任編輯]馬興忠