楊惠子，陳明龍，周怡然，李璇，穆清，王麗娜，王貴鑫，張園

（蘇州科技大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009）

有機質添加對鉛污染農(nóng)田土生態(tài)功能穩(wěn)定性的影響研究

楊惠子，陳明龍，周怡然，李璇，穆清，王麗娜，王貴鑫，張園*

（蘇州科技大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009）

應用磷脂脂肪酸（PLFA）分析方法，研究有機質的添加對受到不同程度鉛污染的土壤中微生物群落的結構和多樣性的影響，探討土壤有機質含量與鉛污染土壤穩(wěn)定性的相關關系。結果表明：在受到重金屬鉛污染的土壤微生物群落中細菌占主導地位；土壤鉛污染越嚴重、有機質含量越低，土壤微生物的多樣性越低，反之多樣性越高；革蘭氏陰性菌和真菌與有機質含量和土壤穩(wěn)定性呈顯著正相關關系（P＜0.01）?？赏ㄟ^提高鉛污染土壤中有機質含量來增強土壤的生態(tài)功能穩(wěn)定性。

鉛污染；磷脂脂肪酸；微生物；土壤穩(wěn)定性；聚類分析

土壤是人類賴以生存的主要資源之一，作為全球生態(tài)系統(tǒng)的一部分，土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性對人類可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[1]。然而，2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》[2]顯示，全國耕地土壤重金屬點位超標率高達12.1%。因重金屬在土壤中存在生物累積效應，可通過水、植物等介質影響人類健康，重金屬污染已成為國際上嚴峻的環(huán)境問題之一[3－6]。鉛作為一種毒性較高的重金屬，其對土壤的危害隨著鉛礦開采、冶煉以及制造業(yè)的快速發(fā)展而日益加劇[7]。

目前，鉛污染防治的科技支撐還較薄弱，主要體現(xiàn)在研究廣度和深度不夠[8]。因為研究土壤微生物群落是通過微生物分離方法進行的，不僅工作量大、研究成本高，而且許多微生物是無法人工分離培養(yǎng)的[9]。所以本研究在宏觀上以生態(tài)功能穩(wěn)定性為切入點，來評價土壤的質量和健康水平。生態(tài)功能穩(wěn)定性可以利用抵抗力和恢復力兩個指標進行度量[10]，并預測重金屬脅迫下土壤生態(tài)功能的恢復速率與程度，其大小可由土壤微生物活性、多樣性及均勻性共同衡量，故本研究引入存在于活體微生物細胞膜的磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid，PLFA），作為微生物的生物標記（Biomarker）[11]，用于鑒定土壤微生物種類和識別微生物類群[12]，從而實現(xiàn)對微生物多樣性及均勻性的量化。通過對受到鉛污染并作相關處理的土壤中微生物群落的組成與活力的研究，體現(xiàn)土壤質量以及微生物群落結構與土壤質量的相關性[13]。而MIDI Sherlock微生物自動鑒定系統(tǒng)在速度與鑒定數(shù)量上占據(jù)明顯的優(yōu)勢，是一種能夠快速、準確鑒定微生物的方法[14]。

本實驗采用磷脂脂肪酸分析和MIDI Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)結合，研究受鉛脅迫的農(nóng)田土壤的微生物群落結構及土壤微生物和土壤穩(wěn)定性的相關影響。通過測定土壤微生物的呼吸強度來衡量土壤功能的抵抗力、恢復力及穩(wěn)定性，借助PLFA生態(tài)標記的生態(tài)學參數(shù)，從微生物群落結構多樣性、均勻性及優(yōu)勢度方面，闡明土壤微生物對重金屬脅迫的敏感程度及其群落結果的動態(tài)響應。旨在探討土壤有機質含量對鉛污染土壤生態(tài)系統(tǒng)功能恢復的影響，為土壤生態(tài)功能的修復提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗方案及樣品采集

本實驗所用土壤采集于江蘇省蘇州市郊區(qū)農(nóng)田土（31°15′4.39″N，120°34′28.74″E）。隨機選擇彼此相距10 m的3個地塊（范圍0.5 m×0.5 m）采集土壤，除去表層1 cm左右的浮土，采集表層1～20 cm處的潔凈土壤樣品，收集混合后進行風干并研磨過2 mm篩網(wǎng)備用。

1.2 底物誘導呼吸實驗

將預處理過的土壤含水率調(diào)節(jié)至15%，分別進行處理A和處理B（表1）。處理A：按土壤與蘆葦葉（C/ N=14.96）干重比3∶1混合，共800 g，添加不同濃度的PbCl2溶液（Pb的等效濃度依次為50、100、200 mg· kg-1混樣干重），處理編號分別為A1、A2、A3。處理B：純土壤800 g，不添加蘆葦葉，向其中添加與處理A相同濃度梯度的PbCl2溶液，編號分別為B1、B2、B3。設置空白組（Blank）：純土壤800g，不添加蘆葦及PbCl2溶液。處理A、B和Blank的土壤含水率均調(diào)節(jié)為18%。以土壤環(huán)境質量標準GB 15618—1995（鉛的自然背景值為Pb≤35 mg·kg-1）作為鉛濃度添加的基本原則。

將每種處理后的土壤分別混合均勻，分裝于塑料瓶中28℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)期間土壤含水率保持在18%。定義加入鉛脅迫當天為第0 d，在加入鉛脅迫后第1、7、15、30、60 d進行底物誘導呼吸速率實驗（SIR）的測定[15]，各處理組分別設置3個平行重復，每次實驗設置1組空白對照。

通過計算加Pb脅迫處理和無脅迫處理的相關底物誘導呼吸速率f（t），量化土壤微生物對擾動的抵抗力f（1）、恢復力f（60）和功能穩(wěn)定性Sb（圖1），從而確定受Pb脅迫后的抵抗力和恢復力。定義Sb為彈性曲線面積。f（t）和Sb的計算公式見公式（1）和公式（2）[16]。

表1 底物誘導呼吸實驗的樣品成分列表Table 1 Components of the experiment of substrate-induced respiration rate

圖1 土壤功能穩(wěn)定性計算分析Figure 1 Analysis of soil stability

式中：f（t）為第t d試驗組CO2與對照組CO2的濃度比值；CO2-stressed（t）為試驗組第t d的CO2的濃度；CO2-control（t）為對照組第t d的CO2的濃度；Sb為土壤穩(wěn)定性。

1.3 PLFA的提取與樣品檢測

稱取4 g（干重）土壤，置于離心管中，剩余土樣于烘箱中烘24 h，測得含水率。向離心管中加入1∶1.2∶2.4的磷酸緩沖液、三氯甲烷、甲醇，于暗處劇烈振蕩2 h，離心；轉移上清液并加入磷酸緩沖液和三氯甲烷，劇烈振蕩，加入11.5 mL提取液于剩余土壤中，搖動，離心，轉移上清液，搖動，封口靜置過夜。液體分為兩相，將試管中下層溶液放入大試管中，30℃水浴加熱后氮吹至1 mL。調(diào)解萃取小柱，將濃縮液及沖洗液加入萃取小柱，向萃取小柱加入1∶2的三氯甲烷、丙酮，棄去，向萃取小柱中加入5 mL甲醇并收集淋洗液，32℃水浴，氮吹濃縮，加入1∶1甲醇∶甲苯和氫氧化鉀溶液，搖勻，37℃水浴加熱，加入0.15∶1∶1的1 mol·L-1醋酸溶液、己烷、超純水，振蕩，將上層溶液移入小瓶氮吹至干，下層加己烷，振蕩。用移液槍加己烷于干燥樣品中，搖動，檢測前轉入色譜儀專用的內(nèi)襯管。此后2～3 d在-20℃保存，超過3 d在-80℃保存[17]。

PLFA鑒定采用美國MIDI公司（MIDI，Newark，Delaware，美國）開發(fā)的Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)（Sherlock MIS 6.2）[18]。此系統(tǒng)備有圖譜識別軟件和迄今為止微生物鑒定系統(tǒng)中最大的數(shù)據(jù)庫資源，包括嗜氧菌1100余種，厭氧菌800余種，酵母菌和放線菌300余種，共計超過2200種[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 PLFA生物標記生態(tài)學參數(shù)

本研究將PLFA生物標記作為數(shù)量測度，引入生態(tài)學多樣性測度Shannon-Wiener指數(shù)（H）[20]、豐富度（S）[20-21]和Pielou均勻度指數(shù)（J）[20-21]、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）[21]等方法，計算微生物PLFA生物標記生態(tài)學參數(shù)，通過相關系數(shù)，分析各參數(shù)的相關性。重要生態(tài)學參數(shù)的計算方法如下：

式中：Pi指第i種特征磷脂脂肪酸占實驗中總的特征磷脂脂肪酸個數(shù)的比例，Pi=Ni/N，Ni為處理i的特征磷脂脂肪酸個數(shù)，N為該實驗中總特征磷脂脂肪酸個數(shù)；S為微生物群落中PLFA生物標記出現(xiàn)的頻次，即豐富度。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理方法

所有測定結果均為3次重復的平均值。用SPSS 22.0進行PLFA的主成分分析、相關性分析、分層聚類分析，為保證結果可靠性，減少誤差，僅分析含量高于0.1%的脂肪酸[22]。所用圖表統(tǒng)一采用Origin 8.0處理。

2 結果與討論

2.1 底物誘導呼吸

底物誘導呼吸作用是一種廣泛用于測定土壤微生物量的生理方法，并能在一定程度上揭示環(huán)境脅迫情況，與土壤環(huán)境質量密切相關[23]。當土壤中加入易降解底物或基質（例如葡萄糖）時，呼吸速率立即提高，提高量與微生物生物量的大小成正比[24]。據(jù)此通過測定加入底物后短時間內(nèi)呼吸產(chǎn)生的CO2量，來估測土壤中微生物群落多樣性[25-26]。由圖2可以看出，無論Pb濃度高低，在第1、7、15 d處理A、B中底物誘導呼吸強度均為先增強后減弱，且呼吸強度均在第7 d達到峰值，但處理A中底物誘導呼吸強度高于處理B中的呼吸強度，說明微生物生物量在15 d中呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢，但處理A中的微生物生物量高于處理B。在第30 d后，處理A中底物誘導呼吸大幅度增強，但處理B中底物誘導呼吸增強緩慢并趨于平緩，在有機質添加的情況下，處理A中的土壤微生物量增加，土壤的生物多樣性提高，而處理B的生物多樣性基本無顯著變化。因此，對于處理A，添加有機質后會將土壤中的鉛離子固定，從而對土壤重金屬的生物有效性有一定的抑制效果[27]，對于微生物的生長繁殖有較好的促進作用，促使微生物生物量增加，增強土壤的恢復能力。而對于處理B，由于缺少有機質對鉛的吸附固定作用，增強了鉛對微生物的毒性作用，抑制了微生物的生命活動，因而不利于微生物對鉛離子的吸附和轉化，使土壤的恢復能力下降。

圖2 不同處理方式下土壤二氧化碳呼吸量與時間的關系Figure 2 Respiration of CO2during incubation time under different treatments

2.2 土壤抵抗力、恢復力及穩(wěn)定性

通過對土壤微生物呼吸強度的數(shù)據(jù)結果采用公式（1）進行處理轉換，計算得到各組抵抗力f（1）和恢復力f（60），并由公式（2）計算出土壤的穩(wěn)定性（Sb），如表2所示。處理B中土壤的抵抗力隨著土壤鉛含量的增加而降低，而處理A中土壤的抵抗力隨著土壤鉛含量的增加先升高后降低。這是由于重金屬鉛會與土壤中有機質發(fā)生吸附作用，使鉛的生物毒性減弱[28]，故在處理A中有機質的加入對重金屬鉛的毒性起到了一定的緩沖作用。因此，有機質含量高的土壤可以抵抗更高濃度的鉛污染。處理A、B中土壤的恢復力均隨著土壤中鉛濃度的增加先升高后降低。這是由于一定濃度的鉛脅迫可以刺激土壤中的微生物通過加快新陳代謝來抵御這種逆境，從而增強了微生物的呼吸作用[29]，反映在恢復力上則是使其升高；而當鉛污染的程度過重時，土壤微生物的活性則會遭到抑制[28]，故土壤恢復力下降。處理A、B中土壤穩(wěn)定性均隨著土壤中鉛離子含量的升高而降低。但由于有機質表面富含的官能團對重金屬元素有較強的富集和配位能力，能使土壤中的重金屬形態(tài)由交換態(tài)和溶液態(tài)轉變?yōu)樘妓猁}結合態(tài)、氧化物結合態(tài)和殘渣態(tài)，從而起到固化（沉淀）或鈍化作用[30]，故與處理B相比，處理A中土壤的恢復力及穩(wěn)定性高。

表2 不同處理方式下土壤的抵抗力、恢復力及穩(wěn)定性Table 2 Soil resistance，resilience and stability under different treatments

2.3 土壤微生物PLFA的表征菌落及含量

各菌落占微生物總量的百分比見圖3。從中可以發(fā)現(xiàn)，Blank土壤中主要微生物的總體分布情況是：革蘭氏陰性菌>革蘭氏陽性菌>真菌。在處理A中：A1中革蘭氏陰性菌>真菌>革蘭氏陽性菌，A2中革蘭氏陰性菌占比最高且真菌的占比與革蘭氏陽性菌相近，A3中革蘭氏陰性菌>革蘭氏陽性菌>真菌。而在處理B中：革蘭氏陽性菌>革蘭氏陰性菌>真菌。除此之外，A1、A2、A3中的革蘭氏陽性菌所占比重呈遞增趨勢；B1、B2、B3中的各菌落含量無明顯差異。處理B中的優(yōu)勢菌種是革蘭氏陽性菌，占微生物量的百分比最高（約為62%），而添加有機質的處理A中革蘭氏陰性菌與真菌占微生物量的百分比明顯增加，其對應的穩(wěn)定性也較高，具體的相關性分析見2.6節(jié)。

圖3 不同處理方式下菌種分類累加值所占百分比Figure 3 Ratio of accumulated content of microbial communities under different treatments

2.4 土壤微生物群落的生態(tài)學參數(shù)

不同處理下土壤微生物群落PLFA生物標記共檢測到89個，根據(jù)公式（3）～公式（5），計算得到土壤微生物群落的豐富度（S）、多樣性（H）、均勻度（J）及優(yōu)勢度（D），統(tǒng)計結果見表3。在處理A中，革蘭氏陽性菌的優(yōu)勢度高，各微生物群落的豐富度高；而在處理B中，革蘭氏陰性菌和真菌的優(yōu)勢度高，各微生物群落的豐富度較高。與Blank對比，處理A、B中微生物群落的多樣性和均勻度均有所下降，這是由于重金屬鉛的加入使微生物代謝活性滯后，對土壤養(yǎng)分利用低所導致[31]；但豐富度均有所增加且處理A高于處理B，說明添加有機質有利于增加土壤微生物的豐富度，并能對土壤微生物多樣性的減少起到阻礙作用，進而提高土壤的抵抗力、恢復力和穩(wěn)定性；對均勻度的影響則不大。

2.5 土壤微生物PLFA生物標記的聚類分析

以各PLFA生物標記參數(shù)值為指標，以各PLFA為樣本，構建分析矩陣，并以歐氏距離為尺度，用最小距離法進行系統(tǒng)聚類，結果見圖4。結果表明，可將其分成八大類，各類PLFA生物標記相對生物量大小順序為：Ⅰ類>Ⅱ類>Ⅲ類>Ⅳ類>Ⅴ類>Ⅵ類>Ⅶ類>Ⅷ類。

第Ⅰ類：PLFA生物標記含量高，在樣方中分布的頻次較高，多樣性指數(shù)高，屬于該類的PLFA為16∶0，表征假單胞菌[32]。

第Ⅱ類：PLFA生物量高，在樣方中分布的頻次較高，多樣性較高，屬于該類的PLFA為18∶1 ω8c，代表著主導革蘭氏陰性菌的屬性，生物量含量較高；以及18∶2 ω6c，代表著主導真菌的屬性。

第Ⅲ類：PLFA生物量高，在樣方中分布的頻次較高，多樣性中等偏低，屬于該類的PLFA為16∶1 ω3c，代表著主導革蘭氏陰性菌的屬性，生物量含量較高。

第Ⅳ類：PLFA含量中等，在樣方中分布的頻次較高，多樣性中等或較高，屬于該類的PLFA有20∶0 10-methyl，代表著主導放線菌的屬性；以及18∶1 ω9c，代表著主導細菌的屬性。

第Ⅴ類：PLFA生物標記含量中等，在樣方中分布的頻次較高，多樣性中等偏高，屬于該類的PLFA有16∶0 10-methyl，代表著主導放線菌的屬性；以及15∶0 iso，代表著主導革蘭氏陽性菌的屬性。

第Ⅵ類：PLFA生物標記含量中等，在樣方中分布的頻次中等偏低，多樣性中等偏低，屬于該類的PLFA有18∶1 ω7c DMA，代表著主導厭氧菌的屬性；18∶1 ω7c和19∶0 cyclo ω9c，代表著主導革蘭氏陰性菌的屬性。

表3 不同處理下不同菌群的生態(tài)學參數(shù)Table 3 Ecological parameters of different strains in different treatments

圖4 微生物群落PLFA生物標記各生態(tài)學參數(shù)聚類分析Figure 4 Cluster analysis of PLFA ecological parameters value of microbial community

第Ⅶ類：PLFA生物標記含量較低，在樣方中分布的頻次中等偏低，多樣性中等偏低，屬于該類的PLFA有19∶0 cyclo ω7c，代表著主導革蘭氏陰性菌的屬性；16∶3 ω6c和18∶0 cyclo ω6c，分別代表著主導原生動植物和細菌的屬性。

第Ⅷ類：其余PLFA全部歸為第Ⅷ類，其特點為PLFA生物標記含量低，在樣方中分布的頻次低，多樣性低。

分層聚類結果顯示，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類PLFA生物標記在處理A中的含量明顯高于處理B，生物標記含量較高，多表征革蘭氏陰性菌和真菌；第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ類PLFA生物標記屬于過渡型生物標記，特點是隨時間的變化其含量在不同處理方式下的波動較大，生物標記含量中等；第Ⅶ類PLFA生物標記僅在處理B中出現(xiàn)，生物標記含量低，多表征原生動物和細菌；第Ⅷ類PLFA生物標記在各組處理中的分布較為分散，無顯著規(guī)律性。這說明添加有機質可顯著促進第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類PLFA所表征菌群的生長繁殖，借助此類菌群對土壤鉛污染的凈化作用，達到改善土壤環(huán)境質量，提高土壤的抵抗力、恢復力及穩(wěn)定性的目的。

2.6 不同類型菌群與土壤理化性質的相關性分析

實驗測得未添加鉛污染的土壤中鉛的含量為5.58 mg·kg－1，有機質含量的占比為4.05%，可溶性有機碳（DOC）的含量為23.49 g·kg－1。所有處理中不同類型菌落含量占比與土壤理化性質的Pearson相關系數(shù)見表4。從表中可以看出：

（1）不同類型菌落與土壤中有機質的含量、恢復力和穩(wěn)定性呈顯著相關關系，而與土壤鉛含量、抵抗力無顯著相關性（P＜0.05）。

（2）革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌含量與土壤穩(wěn)定性高度線性相關（P＜0.01）。革蘭氏陰性菌細胞壁表面的羧基與革蘭氏陽性菌細胞壁表面的羧基和糖醛酸上的磷酸基對重金屬具有富集作用[33]，有利于富集轉化鉛離子，因此與土壤穩(wěn)定性具有顯著相關性。

（3）革蘭氏陰性菌、真菌與土壤中有機質的含量、恢復力和穩(wěn)定性呈顯著正相關。這與2.3節(jié)中穩(wěn)定性高的組別革蘭氏陰性菌與真菌占微生物量的百分比更高相對應。研究表明，霉菌、酵母菌等真菌有較好的重金屬吸附能力，原因是真菌具有菌絲體粗大、吸附后易脫離以及吸附量大等特點[34]。在2.5節(jié)聚類分析Ⅰ類中生物標記含量最高的假單胞菌為革蘭氏陰性細菌，而革蘭氏陰性菌的富集作用與真菌的吸附作用是其與土壤恢復力、穩(wěn)定性呈顯著正相關的原因之一。

表4 變量與各影響因子的相關系數(shù)Table 4 Correlation coefficient of influence factors and variables

3 結論

（1）土壤中的微生物普遍對低濃度的鉛污染表現(xiàn)出一定的抵抗性，在較高濃度的鉛污染下，革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出了較好的抵抗性，而真菌含量與土壤微生物的豐富度都顯著降低。

（2）有機質含量高且穩(wěn)定性高的土壤中16∶0、18∶1 ω8c、18∶2 ω6c和16∶1 ω3c等PLFA的含量較高，而19∶0 cyclo ω7c、16∶3 ω6c和18∶0 cyclo ω6c等PLFA僅在鉛污染較為嚴重的土壤中出現(xiàn)。

（3）有機質的添加使微生物群落中革蘭氏陰性菌和真菌比例明顯增加，革蘭氏陰性菌對重金屬的富集能力與真菌對重金屬的吸附能力減弱了土壤中鉛污染的影響，從而使土壤的穩(wěn)定性提高。

上述土壤微生物生物量、微生物群落結構變化的過程、耐性和機理，特別是對特征功能基因的鑒定和篩選及其在土壤污染修復過程中的作用機制，今后需要進一步加強研究，以便為重金屬污染土壤的修復提供科學依據(jù)。

致謝：感謝南京師范大學鄧歡老師及其團隊對本項目實驗的技術支持。

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Effects of organic matter on the ecological stability of lead contaminated agricultural soil

YANG Hui－zi,CHEN Ming－long,ZHOU Yi－ran,LI Xuan,MU Qing,WANG Li－na,WANG Gui－xin,ZHANG Yuan*
（School of Environmental Science and Engineering,Suzhou University of Science and Technology,Suzhou 215009,China）

This experiment explored the relationship between soil organic matter content and the stability of lead contaminated soil,and studied the effects of different levels of lead contaminated soil amended by adding organic matters on the microbial community structure and diversity using the phospholipid fatty acid（PLFA）analysis method.The results showed that the bacteria are dominant in lead contaminated soil microbial community.The less lead contamination and the less organic matter content in the soil,the lower soil microbial diversity it will have,whereas the diversity is higher.G－and fungus with organic content and soil stability are significant positive correlations（P＜0.01）;the ecological stability of lead contaminated soil can be enhanced by improving soil organic matter content.

lead pollution;phospholipid fatty acid;microbial;soil stability;clustering analysis

X53

A

1672－2043（2017）04－0694－08

10.11654/jaes.2016－1383

2016－10－30

楊惠子（1996—），女，山東德州人，本科在讀，主要研究方向為土壤污染修復。E－mail：1004816139@qq.com

*通信作者：張園E－mail：yuanzhang_1001@mail.usts.edu.cn

蘇州市分離凈化材料與技術重點實驗室項目（SZS201512）；蘇州市科技計劃項目（SNG201613）；2016年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610332020）；江蘇省環(huán)境科學與工程重點實驗室開放課題項目（Zd131201）

Project supported：The Program of Separation and Purification Material and Technology Key Laboratory of Suzhou（SZS201512）；The Science and Technology Plan Program of Suzhou（SNG201613）；The National Innovative Entrepreneurial Training program of College Students in 2016（201610332020）；The Jiangsu Key Laboratory Open Projects of Environmental Science and Engineering（Zd131201）

楊惠子，陳明龍，周怡然,等.有機質添加對鉛污染農(nóng)田土生態(tài)功能穩(wěn)定性的影響研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36（4）：694－701.

YANG Hui－zi,CHEN Ming－long,ZHOU Yi－ran,et al.Effects of organic matter on the ecological stability of lead contaminated agricultural soil[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（4）:694－701.