劉麗敏++++++史文娟++++++何芳++++++伍雪梅

[摘要]目的 研究siRNA干擾叉頭框轉(zhuǎn)錄因子F2（FOXF2）對人宮頸癌SiHa細胞體外轉(zhuǎn)移能力的影響及其作用機制。方法 采用RT-PCR、Western blot分別檢測siRNA-FOXF2轉(zhuǎn)染前后，SiHa細胞中FOXF2 mRNA、蛋白的表達變化；同時用劃痕試驗和Transwell侵襲試驗分別檢測siRNA-FOXF2轉(zhuǎn)染前后細胞的遷移和侵襲能力，CCK8檢測siRNA-FOXF2轉(zhuǎn)染前后細胞的增殖能力。結(jié)果 SiHa細胞內(nèi)FOXF2敲除后，RT-PCR、WB檢測顯示siRNA-FOXF2轉(zhuǎn)染組FOXF2的蛋白、mRNA均明顯下降；劃痕試驗和Transwell侵襲試驗顯示細胞侵襲、遷移能力增強；CCK8檢測顯示siRNA-FOXF2轉(zhuǎn)染組促進細胞增殖能力（P<0.01）。結(jié)論 siRNA干擾FOXF2促進SiHa細胞的體外轉(zhuǎn)移能力及細胞增殖能力，進而促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]宮頸癌；叉頭框轉(zhuǎn)錄因子F2；SiHa細胞；細胞遷移；細胞侵襲；細胞增殖

[中圖分類號] R737.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）03（c）-0004-04

[Abstract]Objective To explore the effect of siRNA silencing FOXF2 on invitro metastasis of human cervical carcinoma SiHa cells and its mechanism.Methods The expression of FOXF2 mRNA and protein in SiHa-siRNA-FOXF2 cells and negative control cells were detected by RT-PCR and Western blot respectively. The migration and invasion ability of cells were detected by wound-healing assay and Transwell assay before and after siRNA-FOXF2 transfection.CCK8 was used to detect the proliferation of cells before and after siRNA-FOXF2 transfection.Results The expression of FOXF2 mRNA and protein in siRNA-FOXF2 transfected group was significantly decreased after FOXF2 knockout in SiHa cells by RT-PCR and WB detection；the invasion and migration were enhanced by wound-healing assay and transwell assay.After transfection of siRNA-FOXF2 into cervical cancer SiHa cell lines，the capability of cell proliferation was significantly enhanced （P<0.01）.Conclusion siRNA-FOXF2 can promote the invitro metastasis and proliferation of SiHa cells，and promote the development of cervical cancer.

[Key words]Cervical cancer；FOXF2；SiHa cells；Cell invasion；Cell migration；Cell proliferation

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤第3位，死亡率居第4位[1]，且發(fā)病趨勢呈低齡化[2]。目前主要的治療方法是宮頸癌根治術(shù)和放化療，其對早期患者的治愈率高達80%～95%，但對于晚期和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者仍無令人滿意的治療方法。因此，從分子水平研究宮頸癌的發(fā)病和預(yù)防機制，采取針對性的靶向治療迫在眉睫。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子F2（forkhead boxF2，F(xiàn)OXF2）蛋白為FOX轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員之一，主要存在于泌尿道、呼吸道和消化道等系統(tǒng)器官的鄰近上皮間質(zhì)細胞，其參與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成[3]、胚胎及組織發(fā)育[4]以及上皮與間質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化[5]等。有研究報道，F(xiàn)OXF2的低表達與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]，F(xiàn)OXF2高表達于正常前列腺組織和前列腺良性腫瘤，低表達于前列腺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[7-8]。但目前有關(guān)FOXF2基因在宮頸癌分子機制研究的相關(guān)報道較少。本研究旨在探討FOXF2干擾宮頸癌SiHa細胞的分子機制，為臨床治療宮頸癌的靶點提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料

人宮頸癌細胞株SiHa購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫；DMEM購自美國Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，natocor）、Transwell小室購自美國Corning公司。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine TM 3000（LTP03000）和OptiMEMⅠ Medium購自美國Invitrogen公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。FOXF2 siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，包含3對目的siRNA，1對陰性對照siRNA。Si-FOXF2 1415序列為：5′-GCGUCUGUCAGGAUAUUAATT-3′；Si-FOXF2 1305序列為：5′-GCAUCACUCUACUCCAGUGTT-3′；Si-FOXF2 650序列為：5′-CCAGCGAGUUCAUGUUCGATT-3′；干擾陰性對照組siRNA序列為：5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3′，RT-PCR試劑Takara，日本。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) SiHa細胞復(fù)蘇后，加入含10%FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的DEME中培養(yǎng)，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h內(nèi)換液。取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化、傳代、凍存。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)SiHa細胞分為5組：轉(zhuǎn)染陰性對照組（陰性）、Si-FOXF2 1415組（1415）、Si-FOXF2 1305組（1305）、Si-FOXF2 650組（650）及未經(jīng)任何處理的SiHa細胞作為對照組（NC）。轉(zhuǎn)染前一天將SiHa細胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染時細胞融合達到30%～50%，PBS清洗3遍，每孔加入900 μl無血清培養(yǎng)基。將5 μl的siRNA和3 μl的Lipo3000分別與50 μl的OptiMEMⅠMedium混懸，輕輕混勻后靜置5 min。將含有siRNA和Lipo3000的OptiMEMⅠ Medium輕輕混勻后靜置20 min。將每孔100 μl混勻的DNA脂質(zhì)體復(fù)合物均勻滴入含有無血清培養(yǎng)基的細胞中。48 h后終止提樣。

1.2.3 RT-PCR檢測各組FOXF2 mRNA的表達 終點提取RNA，采用紫外/可見光分光光度儀測量細胞樣品總RNA的濃度和純度[D（260 nm）/D（280 nm）分析RNA濃度在1.9～2.1之間提示RNA質(zhì)量良好]。隨后按Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計引物序列為：FOXF2上游：5′-TCGCTGGAGCAGAGCTACTT-3′；下游：5′-CCCATTGAAGTTGAGGACGA-3′；GAPDH上游：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。最終獲得轉(zhuǎn)染率最高的SI-FOXF2序列。

1.2.4蛋白印跡法檢測篩選后的3組FOXF2蛋白的表達 按上述方法轉(zhuǎn)染細胞，分為Si-FOXF2陰性對照組、Si-FOXF2組和未經(jīng)任何處理的SiHa細胞作為對照組。72 h后用全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，南京）提取蛋白，BCA蛋白試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，北京）測蛋白濃度，以GAPDH為內(nèi)參，按10%分離膠、6%濃縮膠濃度制膠，按濃縮膠80 V、分離膠120 V恒壓電泳，200 mA轉(zhuǎn)膜1 h，5%BSA封閉2 h，TBST洗滌后孵一抗（兔抗人FOXF2 1∶1000，兔抗人GAPDH 1∶10000，Abcam）4℃過夜，次日洗滌后二抗（羊抗兔1∶2000，CST）1 h，洗滌，ECL顯影（merckmillipore）。實驗重復(fù)3次。

1.2.5細胞劃痕實驗 待轉(zhuǎn)染后細胞數(shù)達90%生長融合時，用200 μl移液槍頭沿培養(yǎng)板底部呈一字型劃痕，用PBS洗3遍，換上無血清的培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)0、12、24、36、48 h在倒置顯微鏡下（10×10）測量劃痕的寬度。細胞遷移率（%）=（1-即時劃痕寬度/原始劃痕寬度）×100%。

1.2.6 Transwell侵襲試驗 用50 μl Matrigel稀釋液（1∶4）包被Transwell小室。取Si-FOXF2陰性對照組（Si-Ha NC組）、Si-FOXF2 650組和未處理SiHa組（SiHs組）的細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，上室加入200 μl（3×104）細胞懸液，下室加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μl，每組重復(fù)3孔，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室，PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3遍，用棉簽擦去上室細胞，結(jié)晶紫染色30 min，洗滌，倒置，風干，顯微鏡下拍照。每個濾膜隨機選取5個200倍視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，以此表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.2.7 CCK8檢測細胞增殖實驗 取轉(zhuǎn)染24 h后Si-FOXF2陰性對照組（SiHs組）、si-FOXF2 650組和未處理SiHa組的細胞（SiHa Nc組），用10%FBS血清培養(yǎng)基重懸細胞，在96孔板中加入100 μl（9×103）的細胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌3遍，將每孔加入10 μl CCK8及90 μl無血清培養(yǎng)液的混合液，避光，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。酶標儀測定450 nm處的吸光值。計算細胞活性公式：細胞增值率（%）=[處理組D（450 nm）-空白孔D（450 nm））/（空白對照組D（450 nm）-空白孔D（450 nm）]×100%。

1.2.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 siRNA-FOXF2干擾對SiHa細胞FOXF2 mRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示：3對目的siRNA-FOXF2干擾后FOXF2 mRNA較轉(zhuǎn)染陰性對照組及對照組明顯下降（70%～85%），siRNA-FOXF2 650鏈下降最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。選取siRNA-FOXF2 650鏈進行后續(xù)實驗（圖1）。

2.2 siRNA-FOXF2干擾對SiHa細胞FOXF2蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示：siRNA-FOXF2 650干擾后，siRNA-FOXF2 650組細胞FOXF2蛋白表達水平明顯低于轉(zhuǎn)染陰性對照組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），進一步證實轉(zhuǎn)染成功（圖2）。

2.3 siRNA-FOXF2干擾對SiHa細胞遷移力的影響

細胞劃痕試驗顯示，siRNA-FOXF2干擾后，siRNA-FOX F2 650組細胞的遷移能力明顯高于轉(zhuǎn)染陰性對照組及對照組（P<0.01）（圖3）。

2.4 siRNA-FOXF2干擾對SiHa細胞侵襲力的影響

Transwell侵襲試驗顯示，轉(zhuǎn)染組穿過小室濾膜的SiHa細胞數(shù)明顯多于轉(zhuǎn)染陰性對照組及對照組，即siRNA-FOXF2 650組細胞侵襲能力高于轉(zhuǎn)染陰性對照組及對照組（圖4）。

2.5 CCK8檢測siRNA-FOXF2干擾對SiHa細胞增殖的影響

CCK8實驗結(jié)果顯示：siRNA-FOXF2 650組細胞增殖率明顯高于陰性轉(zhuǎn)染對照組及對照組（P<0.01）（圖5）。

3討論

宮頸癌嚴重威脅女性健康，發(fā)病率逐漸上升，僅次于乳腺癌，且呈現(xiàn)年輕化趨勢[9-10]。宮頸癌的侵襲性強，發(fā)生盆腔轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者其術(shù)后復(fù)發(fā)率約為70%[11]。宮頸癌變是外源性和內(nèi)源性多個致癌因素致使抑癌基因失活以及致癌基因激活作用下形成的一個漫長復(fù)雜的過程[12]。臨床追蹤觀察所顯示，一般從宮頸癌前病變逐漸演變成宮頸癌的時間大約為10年[13]。從這一時間來看宮頸癌是可以預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)且可以治愈的腫瘤。防治的突破點在于宮頸癌前病變的及時發(fā)現(xiàn)、及時治療，阻斷其向?qū)m頸癌的進一步發(fā)展，因此探索宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的分子機制對于宮頸癌的治療有著至關(guān)重要的意義。

FOXF2基因位于人染色體6p25.3，編碼一含有444個氨基酸的DNA結(jié)合蛋白，其分子量大約為46 KD[14]。FOXF2是間質(zhì)特異性的轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于泌尿道、呼吸道和消化道等器官的鄰近上皮間質(zhì)細胞，其參與ECM合成[3]、胚胎及組織發(fā)育[4]、以及上皮與間質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化[5]等。FOXF2通過調(diào)節(jié)細胞的極性進而維持組織的穩(wěn)態(tài)，其在胚胎發(fā)育及組織分化的過程中發(fā)揮著重要作用[15]。FOXF2作為FOX家族中的一員，對抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用，而且發(fā)現(xiàn)FOXF2在許多惡性腫瘤中的表達較低[16]，而且FOXF2的低表達加快了腫瘤的生長、進展，預(yù)示著患者預(yù)后較差[17]。也有研究報道FOXF2基因低表達能夠促進小鼠腸道腺瘤的形成和生長[18]。siRNA干擾FOXF2在小細胞肝癌中促進細胞增殖和抗細胞凋亡[6]，這與本研究結(jié)果一致，干擾FOXF2后促進SiHa細胞的遷移、侵襲、增殖。siRNA干擾FOXF2，促進細胞的侵襲及增殖，加快腫瘤的發(fā)展，預(yù)示著預(yù)后不良。從這一角度為宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機制提供了理論證據(jù)。但本研究仍有一定的局限性，僅在體外細胞水平得到了驗證，體內(nèi)實驗有待進一步驗證，進而判斷其是否可以作為臨床評估宮頸癌的預(yù)后指標。下一步將研究上調(diào)FOXF2基因?qū)m頸癌SiHa細胞作用的分子機制，進而為FOXF2基因的靶點腫瘤防治研究提供進一步的的實驗依據(jù)和新思路。

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