陳 超,岳崇慧,王艷菲,藏小丹,劉 鵬,于國萍

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖

陳 超,岳崇慧,王艷菲,藏小丹,劉 鵬,于國萍*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

目的:為了研究榛蘑中多糖的提取條件,以榛蘑多糖得率為指標(biāo),采用超聲波輔助復(fù)合酶(纖維素酶、木瓜蛋白酶)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。方法:通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了酶解溫度、超聲功率、超聲時(shí)間、液料比、酶解時(shí)間、復(fù)合酶比例以及加酶量對(duì)榛蘑多糖得率的影響,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:通過單因素實(shí)驗(yàn),確定了酶解溫度50 ℃、超聲功率360 W、超聲時(shí)間20 min;通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定了最佳提取條件:加酶量1.9%、復(fù)合酶比例2∶1、酶解時(shí)間138 min、液料比30∶1(mL/g)。結(jié)論:在此條件下,榛蘑多糖得率為40.56%。

榛蘑,多糖,超聲波,纖維素酶,木瓜蛋白酶

榛蘑又名蜜環(huán)菌,隸屬于真菌界,是口蘑科真菌蜜環(huán)菌的子實(shí)體,普遍存在于溫帶地區(qū)。榛蘑口感鮮美,富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、以及鋅、鐵、鎂等礦物質(zhì),因此可以開發(fā)具有功能性的榛蘑食品[1]。

榛蘑多糖作為一種活性多糖,具有促進(jìn)造血、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤生長(zhǎng)等藥理作用[2]。近年來,藥用真菌多糖因其具有降血脂、抗感染等功能,逐漸引起了人們的關(guān)注。關(guān)于榛蘑多糖的研究早已有所報(bào)道,余晨晨等[3]利用紅外光譜、氣相衍生化分析榛蘑水溶性多糖的結(jié)構(gòu),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,榛蘑多糖結(jié)構(gòu)由吡喃葡萄糖組成;也有研究發(fā)現(xiàn)[4],榛蘑子實(shí)體胞內(nèi)多糖由D-葡萄糖和D-半乳糖組成,氣相色譜分析結(jié)果顯示,二者比例為5∶1。榛蘑多糖的提取方法有很多[5],如采用熱水、稀酸、稀堿作為浸提劑,但這些方法操作時(shí)間長(zhǎng)、效率低,多糖提取率普遍不高。而超聲波法提取多糖,是利用超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)破壞細(xì)胞壁,使溶劑滲透到細(xì)胞中,能使物質(zhì)中分子加速運(yùn)動(dòng),從而提高提取率[6];酶可以水解纖維素、糖蛋白,以及酶具有高效性和專一性,使得在提取過程中能夠節(jié)約時(shí)間、產(chǎn)物穩(wěn)定[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖,具有提取時(shí)間短、效率高等特點(diǎn),優(yōu)化榛蘑多糖的提取工藝,對(duì)榛蘑多糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榛蘑 產(chǎn)自黑龍江省尚志市珍珠山鄉(xiāng),清水洗凈后放入干燥器進(jìn)行干燥,之后用粉碎機(jī)粉碎,過60目篩,備用;葡萄糖、苯酚、濃硫酸等 均為分析純;纖維素酶 315000 U/g,上海藍(lán)季技術(shù)發(fā)展有限公司;木瓜蛋白酶 490200 U/g,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

DZW電熱恒溫水浴鍋 天津萊斯特儀器有限公司;PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H-1微型漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司;TU-1800紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;小型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FW型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 榛蘑多糖提取得率測(cè)定

1.2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別向8支試管中吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的100 μg/mL的葡萄糖溶液,用蒸餾水將每支試管補(bǔ)至2.0 mL。隨后向每支試管中分別加入1.0 mL濃度為6%的苯酚,迅速滴加濃硫酸5.0 mL,振蕩均勻后于沸水浴中煮沸20 min,冷卻5 min,并在490 nm處測(cè)定吸光度[8]。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)x,吸光度為縱坐標(biāo)y,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得y=0.007x-0.006,R2=0.999。

1.2.1.2 多糖提取得率的計(jì)算 移取2.0 mL多糖提取液,按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測(cè)定吸光度,以2.0 mL蒸餾水按相同操作作為空白實(shí)驗(yàn)。

榛蘑多糖得率(%)=多糖濃度(g/mL)×稀釋倍數(shù)×提取液體積(mL)/原料質(zhì)量(g)×100

1.2.2 超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖的工藝 稱取粒徑為60目的榛蘑樣品5 g,首先按照不同的條件在水溶液中酶解。隨后100 ℃沸水中滅酶10 min,冷卻至室溫。接著上述體系再經(jīng)過不同條件的超聲處理后,于4000 r/min離心30 min,所得到的上清液即為榛蘑多糖提取液。將上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,依照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法,在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.2.3 超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖的單因素實(shí)驗(yàn) 研究液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)、酶解時(shí)間(80、100、120、140、160 min)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)、加酶量(占底物的百分比，1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%)、復(fù)合酶比例(纖維素酶∶木瓜蛋白酶為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、超聲功率(240、280、320、360、400 W)和超聲時(shí)間(10、15、20、25、30 min)7個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響。其中,固定值為:液料比20∶1、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度45 ℃、加酶量(占底物百分比)1%、復(fù)合酶比例為1∶1、超聲功率320 W、超聲時(shí)間20 min。

1.2.4 響應(yīng)面法對(duì)榛蘑多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用響應(yīng)面法在四因素三水平上對(duì)多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化。如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert.V8.0.6.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析;使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖的條件確定

2.1.1 液料比對(duì)多糖得率的影響 如圖1所示,多糖得率會(huì)隨著液料比的增加而增大,這是由于液料比的增加,使得更多的水分子滲透到物料中,從而增大了多糖與水分子的接觸面積[9],利于多糖的提取;當(dāng)液料比超過20∶1時(shí),隨著體系中水分的增加使酶濃度降低,酶與底物結(jié)合不充分,就出現(xiàn)了提取得率下降的趨勢(shì)[10];而且液料比過高不利于后期的分離濃縮,因此選擇20∶1作為多糖的最佳液料比。

圖1 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The effect of liquid material ratio on the rate of polysaccharide extraction注:不同字母代表差異顯著(p<0.05),圖2～圖7同。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 如圖2所示,多糖提取得率會(huì)隨著酶解時(shí)間的增加而增大,這是由于酶解時(shí)間過短,多糖在水溶液中溶解不徹底;當(dāng)酶解時(shí)間140 min時(shí),溶劑的滲透與多糖向周圍溶劑的擴(kuò)散達(dá)到平衡,此時(shí)多糖得率達(dá)到最大值;當(dāng)超過140 min時(shí),提取得率有下降趨勢(shì),可能的原因是提取時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起多糖水解[10]。因此選擇140 min作為提取的最佳酶解時(shí)間。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2 The effect of enzymolysis time on the rate of polysaccharide extraction

2.1.3 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 本實(shí)驗(yàn)選用的復(fù)合酶為纖維素酶和木瓜蛋白酶,其中纖維素酶的最適溫度范圍是40～60 ℃,而木瓜蛋白酶的最適溫度范圍是50～65 ℃[8]。如圖3所示,多糖得率會(huì)隨著酶解溫度的升高而增大;當(dāng)溫度超過50 ℃,多糖得率會(huì)顯著下降,是由于溫度的升高導(dǎo)致酶活性降低或使部分酶失活[7]。而50 ℃是兩種酶都適合的反應(yīng)溫度,因此選擇50 ℃作為提取多糖的最佳酶解溫度。

圖3 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 The effect of enzymolysis temperature on the rate of polysaccharide extraction

2.1.4 加酶量對(duì)多糖得率的影響 如圖4所示,多糖得率會(huì)隨著加酶量的增加而增大,當(dāng)加酶量超過1.75%時(shí),多糖得率下降,其原因可能是當(dāng)酶濃度達(dá)到一定程度時(shí),酶分子處于過度飽和狀態(tài),導(dǎo)致一部分酶無法與底物結(jié)合,使提取得率降低[11]。因此選擇1.75%作為提取多糖的最佳加酶量。

圖4 加酶量對(duì)多糖得率的影響Fig.4 The effect of enzyme concentration on the rate of polysaccharide extraction

2.1.5 復(fù)合酶比例對(duì)多糖得率的影響 如圖5所示,當(dāng)復(fù)合酶比例從3∶1變?yōu)?∶1時(shí),多糖得率增大,其原因可能是:這兩種酶在此比例時(shí),對(duì)蛋白、纖維素兩類物質(zhì)的分解達(dá)到最大值,在分解細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)有利于多糖的浸出;當(dāng)復(fù)合酶的比例從2∶1逐漸變?yōu)?∶3時(shí),兩種酶的比例與相應(yīng)底物的比例不符,分解的量少,多糖得率降低;此外,當(dāng)復(fù)合酶中木瓜蛋白酶的比例增大時(shí),可能是由于木瓜蛋白酶在分解蛋白類物質(zhì)的同時(shí),產(chǎn)生的小分子物質(zhì)對(duì)多糖有一定的包埋作用[7],從而影響多糖的提取。所以只有在復(fù)合酶比例為2∶1時(shí),這兩種酶都能充分發(fā)揮作用。因此選擇2∶1作為提取多糖的最佳復(fù)合酶比例。

圖5 加酶比例對(duì)多糖得率的影響Fig.5 The effect of ratio of compound enzyme on the rate of polysaccharide extraction

2.1.6 超聲功率對(duì)多糖得率的影響 如圖6所示,得率會(huì)隨著超聲功率的增加而增大,其原因可能是超聲功率增大,超聲的空化作用和攪拌作用增強(qiáng),超聲的空化作用會(huì)破壞溶質(zhì)的細(xì)胞壁,使得溶劑更易進(jìn)入細(xì)胞中,從而使多糖得率增大;然而若超聲功率超過360 W,超聲波的劇烈作用會(huì)對(duì)多糖產(chǎn)生破壞作用從而降低得率[12]。因此選擇360 W作為提取多糖的最佳超聲功率。

圖6 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.6 The effect of ultrasonic power on the rate of polysaccharide extraction

圖7 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.7 The effect of ultrasonic time on the rate of polysaccharide extraction

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Rseponse surface design arrangement and experimental results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

注:**:影響極顯著(p<0.01);*:影響顯著(p<0.05)。

2.1.7 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 如圖7所示,多糖得率會(huì)隨著超聲時(shí)間的增加而增大;當(dāng)超聲時(shí)間超過20 min,多糖得率反而下降。其原因可能是超聲時(shí)間的增加使得提取溶劑有充足的時(shí)間和榛蘑粉末作用,有利于多糖的溶出;若超聲時(shí)間過長(zhǎng),溫度和超聲波會(huì)對(duì)已經(jīng)提取出的多糖產(chǎn)生破壞作用,降低得率[13]。因此選擇20 min作為提取多糖的最佳超聲時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型的建立及顯著性的檢驗(yàn) 采用響應(yīng)面分析法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果見表2,得到以榛蘑多糖得率為響應(yīng)值的回歸方程:

Y=40.81+3.75A+3.05B-0.12C-0.30D-2.61AB-2.24AC-0.96AD-0.90BC+4.52BD+2.39CD-4.37A2-6.92B2-5.17C2-5.76D2。

為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性及各因素對(duì)榛蘑多糖得率的影響程度,對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。從表3可以看出,回歸模型中,p<0.0001,表明得到的回歸方程擬合程度較好,回歸效果極顯著;而失擬項(xiàng)p=0.5142>0.05,說明失擬項(xiàng)不顯著。因此,應(yīng)用此方程來模擬指標(biāo)值與因素的關(guān)系是可行的。同時(shí),其方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9767,表明97.67%的數(shù)據(jù)可以用此方程解釋。

由表3還可知,加酶量A和復(fù)合酶比例B的p<0.01,說明對(duì)多糖得率影響差異極顯著,酶解時(shí)間C和液料比D的p>0.05,說明對(duì)多糖得率影響差異不顯著;四個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)榛蘑多糖得率的影響均達(dá)到差異極顯著水平;而交互項(xiàng)AB、AC、BD、CD對(duì)多糖得率的影響差異極顯著,AD、BC對(duì)多糖得率的影響差異不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用的分析與優(yōu)化 通過Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖,目的是進(jìn)一步研究各因素之間的交互作用。圖8～圖13分別顯示了6組以榛蘑多糖得率為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖。

圖8 加酶量和復(fù)合酶比例對(duì)多糖得率的響應(yīng)面Fig.8 Curved surface of response of enzyme concentration and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

圖9 加酶量和酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的響應(yīng)面Fig.9 Curved surface of response of enzyme concentration and enzymolysis time to the rate of polysaccharide extraction

從圖8可知,加酶量和復(fù)合酶比例的交互作用對(duì)多糖得率的影響較大。隨著加酶量和復(fù)合酶比例的增加,多糖得率均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)。這主要是由于,當(dāng)反應(yīng)體系中酶濃度增大時(shí),酶與底物的接觸機(jī)會(huì)增加,多糖溶出加快;反之,由于溶液中的酶分子已經(jīng)飽和,多余酶分子無法與底物結(jié)合,底物水解的速度就會(huì)減慢,使得多糖得率下降[5],因此只有在適宜的加酶量和復(fù)合酶比例條件下,多糖得率才能達(dá)到最大值。

同樣,從圖9～圖13中可以看出,加酶量和酶解時(shí)間、復(fù)合酶比例和液料比、酶解時(shí)間和液料比的交互作用，對(duì)多糖得率影響極顯著。只有加酶量和酶解時(shí)間、加酶量和液料比、復(fù)合酶比例和酶解時(shí)間、復(fù)合酶比例和液料比、酶解時(shí)間和液料比的比例適合，多糖得率才能達(dá)到最大值。

圖10 加酶量和液料比對(duì)多糖得率的響應(yīng)面Fig.10 Curved surface of response of enzyme concentration and liquid material ratio to the rate of polysaccharide extraction

圖11 酶解時(shí)間和復(fù)合酶比例對(duì)多糖得率的響應(yīng)面Fig.11 Curved surface of response of enzymolysis time and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

圖12 液料比和復(fù)合酶比例對(duì)多糖得率的響應(yīng)面Fig.12 Curved surface of response of liquid material ratio and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

由各響應(yīng)面可以看出,響應(yīng)值存在最大值。通過軟件分析計(jì)算得出多糖的理論最佳提取工藝:加酶量1.86%、復(fù)合酶比例2.14∶1、酶解時(shí)間137.55 min、液料比29.69∶1 mL/g,在此條件下,多糖得率為41.83%。為了驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性,采用修正的最佳提取條件:加酶量1.9%、復(fù)合酶比例2∶1、酶解時(shí)間138 min、液料比30∶1 mL/g,對(duì)多糖得率進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),平行實(shí)驗(yàn)3次,多糖得率的平均值為40.56%,與理論預(yù)測(cè)值(41.83%)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.08%,說明該回歸模型準(zhǔn)確可靠。由于榛蘑多糖的提取工藝不同,得到的多糖得率也不盡相同。鄒東恢[5]、邵信儒[1]分別采用多酶法和熱水浸提法從榛蘑中提取多糖,得率分別為16.85%和4.81%。相比之下,本實(shí)驗(yàn)采用的超聲波輔助復(fù)合酶法得到的多糖得率更高,對(duì)榛蘑多糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

3 結(jié)論

在超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖的實(shí)驗(yàn)中,通過單因素實(shí)驗(yàn)確定酶解溫度50 ℃、超聲波功率360 W、超聲波時(shí)間20 min;在此基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到最佳工藝條件為:加酶量1.9%、復(fù)合酶比例2∶1、

圖13 酶解時(shí)間和液料比對(duì)多糖得率的響應(yīng)面Fig.13 Curved surface of response of enzymolysis time and liquid material ratio to the rate of polysaccharide extraction

酶解時(shí)間138 min、液料比30∶1(mL/g),此條件下得到的最佳提取得率為40.56%,與理論預(yù)測(cè)值基本相符,因此可以用該模型分析響應(yīng)值的變化。

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Ultrasonic-assisted enzymatic method extraction of polysaccharide fromArmillariamellea

CHEN Chao,YUE Chong-hui,WANG Yan-fei,ZANG Xiao-dan,LIU Peng,YU Guo-ping*

(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Objective:In order to study the extraction technology of polysaccharide fromArmillariamellea,based on the polysaccharide yield,polysaccharide was extracted by ultrasonic-assisted enzymatic(cellulase,papain)method. Method:This paper studied the optimal extraction conditions by single factor experiment,such as enzymolysis temperature,ultrasonic power,ultrasonic time,liquid material ratio,enzymolysis time,ratio of compound enzyme,enzyme concentration. The optimal conditions were obtained by response surface methodology on the basis of single factor experiment. Result:By single factor experiment,enzymolysis temperature 50 ℃,ultrasonic power 360 W,ultrasonic time 20 min were determined.The results of response surface methodology showed that the optimal extraction conditions were enzyme concentration 1.9%,ratio of compound enzyme 2∶1,enzymolysis time 138 min,liquid material ratio 30∶1(mL/g). Conclusion:Under the optimal extraction conditions,the yield of polysaccharide reached 40.56%.

Armillariamellea;polysaccharide;ultrasonic;cellulase;papain

2016-10-11

陳超(1993-),女,碩士研究生,研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:18846921675@163.com。

*通訊作者:于國萍(1963-),女,博士,教授,研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:yuguopingneau@hotmail.com。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.035