沈春娟,沈 泉,趙黎明

(1.諾華賽分離技術(shù)(上海)有限公司,上海 201203; 2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200433; 3.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,上海 200237)

新型L-色氨酸分離純化連續(xù)色譜工藝的研究

沈春娟1,2,3,沈 泉1,趙黎明3，*

(1.諾華賽分離技術(shù)(上海)有限公司,上海 201203; 2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200433; 3.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,上海 200237)

L-色氨酸發(fā)酵液的分離純化是決定L-色氨酸生產(chǎn)成本和產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素,本研究旨在建立一種新型L-色氨酸連續(xù)色譜分離工藝,以降低L-色氨酸分離純化成本,提高L-色氨酸的收率。通過單柱實驗進(jìn)行色譜填料篩選,并對L-色氨酸在不同樹脂上吸附性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明,L-色氨酸在Applexion XA2014-22樹脂上的動態(tài)載樣量最高,達(dá)120 g/L樹脂,確定以氨水為洗脫液,進(jìn)行順序式模擬移動床分離以后,L-色氨酸的純度從30%提純到80%左右,L-色氨酸收率達(dá)到99%,谷氨酸的去除率達(dá)到100%。本研究所得L-色氨酸發(fā)酵液分離提純工藝和傳統(tǒng)離子交換工藝相比,操作更為簡單,產(chǎn)品純度更高,能夠有效降低工業(yè)化L-色氨酸生產(chǎn)成本,具有應(yīng)用推廣價值。

L-色氨酸,順序式模擬移動床,吸附,收率

色氨酸又名2-氨基-3-吲哚基丙酸,是一種芳香族、雜環(huán)、非極性α-氨基酸,其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。有D-、L-色氨酸兩種異構(gòu)體,天然存在的色氨酸均為L-型。L-色氨酸(L-tryptophan,Trp)是一種重要的營養(yǎng)必需氨基酸,人和動物自身不能合成,只能通過食物來攝取[1]。L-色氨酸又被稱為第二必需氨基酸,目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料添加劑以及農(nóng)業(yè)環(huán)境檢測等行業(yè)。近年來,隨著對L-色氨酸生理功能了解和科學(xué)研究的不斷深入,L-色氨酸的應(yīng)用越來越廣泛,世界上對其需求量也越來越大。目前,L-色氨酸最大的應(yīng)用市場為氨基酸飼料添加劑,是繼蛋氨酸和賴氨酸之后的第三大飼料添加氨基酸[2]。

圖1 L-色氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of L-tryptophan

隨著L-色氨酸發(fā)酵水平的不斷提高,發(fā)酵成本大大降低,發(fā)酵液后續(xù)的分離純化成為決定生產(chǎn)成本的重要因素,下游分離成本可以占到總成本的50%～80%以上[3]。目前,離子交換法是從發(fā)酵液中提純L-色氨酸的主流方法。然而離子交換均為單柱間歇操作,樹脂利用率低,對L-色氨酸的吸附量一般在64～90 g/kg樹脂范圍,且離子交換工藝一般包括進(jìn)樣、純水洗雜、0.2～0.5 mol/L低濃度氨水洗雜(如L-谷氨酸雜質(zhì))、2 mol/L高濃度氨水解析L-色氨酸和水洗等步驟,工藝步驟繁瑣,對L-色氨酸解吸缺乏精確控制,存在解吸拖尾現(xiàn)象,解吸收率徘徊在93%～95%,洗脫劑消耗大,增加了L-色氨酸的生產(chǎn)成本,而低濃度氨水洗雜去除谷氨酸步驟要嚴(yán)格控制洗脫時間以及出料pH,因此對于L-谷氨酸的去除率并不高,而且該步驟也會伴隨L-色氨酸的損失。

模擬移動床(Simulated Moving Bed,SMB)色譜分離技術(shù)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種現(xiàn)代化分離技術(shù),將若干根色譜柱串聯(lián)在一起,每根色譜柱均設(shè)有物料的進(jìn)出口,并通過操作開關(guān)閥組沿著流動相的循環(huán)流動方向定時切換,從而周期性改變物料的進(jìn)出口位置,以此來模擬固定相與流動相之間的逆流移動,實現(xiàn)組分之間的連續(xù)分離[7-8]。SMB具有分離能力高、能耗低、總柱效高、流動相耗量少等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于石油、精細(xì)化工、制糖、食品等領(lǐng)域,近年來更是在手性藥物、有機(jī)酸和氨基酸等生化產(chǎn)品的分離中得到廣泛應(yīng)用[9]。模擬移動床色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于賴氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸等氨基酸產(chǎn)品的分離和精制[10]。萬紅貴等采用模擬移動床技術(shù)分離纈氨酸和丙氨酸,得到純度為98.6%纈氨酸和82.9%丙氨酸[11]。吳昊等通過用模擬移動床色譜技術(shù)分離L-苯丙氨酸,其收率大于97.6%,對天冬氨酸也有很高的去除率,并將該技術(shù)應(yīng)用到L-苯丙氨酸工業(yè)化生產(chǎn)[12]。

本研究旨在篩選不同的樹脂和工藝條件,以水或其他水溶液作為洗提液,開發(fā)出L-色氨酸分離純化色譜工藝,并采用順序式模擬移動床技術(shù)進(jìn)行L-色氨酸連續(xù)色譜分離,以減少傳統(tǒng)工藝過程中的酸堿消耗和水耗,尋求更加綠色環(huán)保的工藝路線,降低工業(yè)化L-色氨酸生產(chǎn)成本,取代傳統(tǒng)離子交換工藝,推動我國L-色氨酸生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-色氨酸發(fā)酵液、離子交換法純化后產(chǎn)品溶液 由伊品生物公司提供,發(fā)酵液中L-色氨酸濃度為15～20 g/L,主要雜質(zhì)為L-谷氨酸、無機(jī)鹽、糖、蛋白質(zhì)、色素等,純度為30%;Applexion XA2014-22和Applexion XA2043苯乙烯系強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂 Novasep Process公司;XAD1600大孔吸附樹脂 陶氏化學(xué)有限公司;氨水 分析純,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;HPLC級甲醇及乙腈 迪馬科技有限公司。

小型模擬移動床系統(tǒng) 配置6～10根2.6 cm×100 cm層析柱,循環(huán)泵、原料泵、洗脫劑泵,流量計,溫度控制系統(tǒng),不銹鋼儲罐,軟件控制系統(tǒng)以及相應(yīng)的進(jìn)口和出口閥門和管路,由諾華賽分離技術(shù)有限公司提供;ORION 013005MD電導(dǎo)率儀、LE438 PH計 梅特勒;2695系列高效液相色譜儀 美國Waters;ICS2100離子色譜儀 賽默飛世爾。

1.2 檢測方法

L-色氨酸濃度分析采用高效液相色譜法,色譜分離柱:YMC-Pack Pro C18 S-5 μm,12 nm,4.6 mm×250 mm,流動相:50 mmol/L磷酸二氫鉀,10%甲醇溶液,流速:1 mL/min,柱溫:40 ℃,檢測波長:278 nm[13]。

L-谷氨酸濃度分析采用Waters AccQ·Tag柱前衍生法氨基酸分析試劑盒進(jìn)行樣品處理,以及HPLC分析柱檢測。色譜分離柱:Nova-Pak C18 4 μm×3.9 mm×150 mm;流動相A:AccQ·Tag試劑盒提供;流動相B:60%乙腈,梯度AccQ·Tag試劑盒提供;流速:1 mL/min;柱溫:37 ℃;檢測波長:254 nm。

1.3 單柱實驗

1.3.1 分離條件篩選 L-色氨酸側(cè)鏈帶有苯環(huán)結(jié)構(gòu),易和離子交換樹脂的骨架結(jié)合,用純水無法將色氨酸從樹脂上解析下來,因此本實驗設(shè)計陰離子樹脂采用酸作為洗提液,而陽離子樹脂采用堿作為洗提液。

將460 mL陽離子交換樹脂Applexion XA2041-NH4以及陰離子交換樹脂Applexion XA3114-SO4分別裝填于2.6 cm×100 cm玻璃柱內(nèi),分別用2 g/L氨水和2 g/L硫酸洗提液平衡陽離子及陰離子交換樹脂,然后將60 mL L-色氨酸發(fā)酵液注入色譜柱內(nèi),最后用洗提液洗脫。20 mL/管收集流出液,并分別對所收集樣品進(jìn)行pH、電導(dǎo)率以及L-色氨酸濃度檢測,并繪制各組分在兩種不同樹脂上的分離曲線。對比L-色氨酸和無機(jī)鹽(以硫酸銨為主)在樹脂上的分離度,選擇最佳分離介質(zhì)和洗提液。

式(1)

式中,R為分離度,TRT:L-Trp的保留時間,TRS:鹽的保留時間,WT和WS分別代表L-Trp和鹽份的峰寬。

1.3.2 樹脂篩選 將型號為Applexion XA2043、Applexion XA2014-22和R&H XAD1600的3種樹脂各取60 mL,分別裝填于1.6 cm×40 cm玻璃柱內(nèi),并用2 g/L氨水平衡樹脂,L-色氨酸發(fā)酵液以2 BV/h的流速吸附,當(dāng)柱底流出液與上柱液濃度一樣時停止上樣,共上樣7～15 BV。30 mL/管收集上樣過程中的流出液,并分別對所收集樣品進(jìn)行pH、電導(dǎo)率和L-色氨酸濃度檢測,繪制各組分在三種不同樹脂上的吸附曲線,并計算L-色氨酸動態(tài)載樣量,選擇最佳的樹脂。

式(2)

DBC=VBT×C0

式(3)

式中,DBC為L-Trp動態(tài)吸附載量(g/L),VBT:穿透體積(BV),C0:粗品中L-色氨酸的濃度(g/L)。

1.3.3 L-色氨酸和L-谷氨酸的分離 采用上述實驗篩選得到的樹脂和洗提液,上樣體積17 BV后用10 BV洗提液洗脫,觀察L-色氨酸和L-谷氨酸在樹脂上的吸附解析行為。

1.4 順序式模擬移動床分離純化L-色氨酸

1.4.1 順序式模擬移動床實驗設(shè)計 順序式模擬移動床技術(shù)(SSMB)是在傳統(tǒng)模擬移動床色譜(SMB)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。SSMB是一種間歇順序操作的模擬移動床,采用了間歇進(jìn)料、間歇出料的不同順序及連續(xù)分離等不同程序的運行模式,將傳統(tǒng)SMB的每一步均分為3～4個子步驟進(jìn)行,見圖2所示。

分步1:物料循環(huán)——沒有進(jìn)料出料,物料在樹脂內(nèi)循環(huán)移動,各組分在該步驟進(jìn)一步分離但沒有洗提液消耗。

分步2:進(jìn)料——物料由FZ3進(jìn)入柱內(nèi),殘液由FZ3出料,物料在該步驟吸附并收集已分離的純?nèi)跷浇M分。

分步3:提取液收集——洗提液由FZ1進(jìn)入,提取液由FZ1收集,收集純強(qiáng)吸附組分。分步2和3同時進(jìn)行以提高產(chǎn)能。該步驟進(jìn)行時,FZ2和FZ4無任何操作。

分步4:殘液收集——洗提液由FZ1進(jìn)入,殘液由FZ3排出并收集。該步驟下,FZ4無任何操作。

圖2 SSMB每個周期的運行步驟Fig.2 SSMB steps for each period

1.4.2 SSMB分離L-色氨酸實驗 順序式模擬移動床系統(tǒng)恒溫控制在60 ℃,包括色譜柱、原料罐和洗脫劑罐。原料泵連續(xù)把原料罐中的L-色氨酸發(fā)酵液和洗脫液泵將洗脫罐的洗脫劑氨水通過柱位閥的切換連續(xù)泵入到色譜柱的不同部位,提純后的L-色氨酸溶液和剩余液分別從不同色譜柱的出口閥連續(xù)流出[14]。測定收集得到的提取液和剩余液中干物質(zhì)、pH、電導(dǎo)率、L-谷氨酸及色氨酸濃度,并計算色氨酸收率和L-谷氨酸的去除率以及色譜純化后L-色氨酸純度(質(zhì)量含量)。

式(4)

式中,RECT為L-Trp收率(%),CTEXT:提取液中L-色氨酸濃度(g/L),VEXT:提取液體積(L),CTRAF:剩余液中L-色氨酸濃度(g/L),VRAF:剩余液體積(L)。

式(5)

式中,REMG為L-Glu去除率(%),CGEXT:提取液中L-谷氨酸濃度(g/L),VEXT:提取液體積(L),CGRAF:剩余液中L-谷氨酸濃度(g/L),VRAF:剩余液體積(L)。

式(6)

式中,PT為L-Trp純度即質(zhì)量含量(%),CTEXT:提取液中L-色氨酸濃度(g/L),DSEXT:提取液干基含量(%),DEXT:提取液密度(g/mL)。

實驗共采用9根直徑為2.6 cm的層析柱,樹脂裝填高度為95 cm,溫度恒定在60 ℃,樹脂采用陽離子交換樹脂Applexion XA2014-22,洗提液為2 g/L氨水。L-色氨酸發(fā)酵液中L-色氨酸濃度為15～20 g/L。

2 結(jié)果和分析

2.1 單柱實驗

2.1.1 分離條件篩選 從圖3和圖4中可以看出,L-色氨酸在陽離子交換樹脂(保留時間為1.6 BV)上吸附強(qiáng)于陰離子交換樹脂(保留時間為0.7 BV),這主要因為L-色氨酸側(cè)鏈基團(tuán)苯環(huán)和苯乙烯系陽離子交換樹脂骨架有很強(qiáng)的疏水作用力,而與聚丙烯酸陰離子交換樹脂骨架吸附比較弱。無機(jī)鹽在陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂上都以離子形式被排斥而很快從樹脂上洗脫下來,其保留時間在兩種樹脂上均為0.5 BV。雖然L-色氨酸和鹽分在以硫酸為洗提液的陰離子交換樹脂Applexion XA3114-SO4上有一定的分離,但L-色氨酸與鹽分分離度R(如表1所示)為0.401,遠(yuǎn)小于在陽離子交換樹脂上的分離度1.503。因此將聚苯乙烯系強(qiáng)陽離子交換樹脂選為L-色氨酸色譜分離樹脂,氨水作為洗提液。

圖3 L-色氨酸和鹽份在陰離子交換樹脂上的分離曲線圖Fig.3 Separation profile for L-Trp and salt on anion resin

圖4 L-色氨酸和鹽份在陽離子交換樹脂上的分離曲線圖Fig.4 Separation profile for L-Trp and salt on cation resin

樹脂型號洗提液分離度RApplexionXA2043-NH42g/LNH31503ApplexionXA3114-SO42g/LH2SO40401

2.1.2 樹脂篩選 圖5和表2分別顯示了L-色氨酸在不同樹脂上的吸附動力學(xué)曲線和L-色氨酸的動態(tài)吸附載量,可以看出,L-色氨酸在強(qiáng)酸性樹脂Applexion XA2014-22上流穿體積最大動態(tài)載樣量最高,達(dá)到120 g Trp/L樹脂。而在吸附樹脂XAD1600和陽離子交換樹脂Applexion XA2043動態(tài)吸附載量僅為50～60 g Trp/L樹脂。因此選擇Applexion XA2014-22樹脂為最佳后續(xù)實驗工作樹脂。

圖5 L-色氨酸在不同樹脂上的吸附動力學(xué)曲線Fig.5 Dynamic absorption profile for L-Trp on different resins

樹脂名穿透體積(BV)L-色氨酸動態(tài)吸附量(g/L樹脂)ApplexionXA2043～2550ApplexionXA2014-22～6120R&HXAD1600～360

2.1.3 L-色氨酸和L-谷氨酸分離 從圖6所示的吸附曲線上可以看出,色氨酸在5 BV的時候開始流穿,而谷氨酸在1 BV的時候開始流穿、2 BV時已經(jīng)接近樣品中的初始值,這說明在本實驗條件下谷氨酸在樹脂上的吸附能力遠(yuǎn)低于色氨酸。從圖6中可以看出,在解析部分,基本沒有谷氨酸被洗脫下來,這說明谷氨酸沒有吸附到樹脂上。L-谷氨酸有一個α氨基、一個α羧基和一個側(cè)鏈羧基,α羧基端pKa1為2.1,側(cè)鏈羧基端pKa2為4.07,氨基端pKa3為9.47,谷氨酸的等電點為3.2。在上樣的最初2 BV內(nèi),樹脂內(nèi)的pH基本大于谷氨酸的等電點,而且谷氨酸是酸性氨基酸,和樹脂的疏水作用力非常弱,因此谷氨酸不能結(jié)合到樹脂上。

L-色氨酸在強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂Applexion XA2014-22上動態(tài)吸附載量高,主要雜質(zhì)鹽份和L-谷氨酸在樹脂上基本沒有吸附,和L-色氨酸能達(dá)到很好的分離效果。因此選用Applexion XA2014-22陽離子交換樹脂作為色譜分離實驗的工作樹脂。

圖6 各組分在Applexion XA2014-22樹脂上的吸附解析曲線Fig.6 Absorption and desorption profile for each component on Applexion XA2014-22 resin

2.2 順序式模擬移動床中試實驗

在中試實驗過程中,優(yōu)化SSMB色譜運行參數(shù),并在每根柱子的出口端取樣分析以繪制各組分在樹脂上的分離曲線圖,優(yōu)化后的色譜分離圖譜見圖7。從圖7中可以看出,L-色氨酸與鹽及L-谷氨酸有很好的分離效果,L-色氨酸主要分布在FZ1為強(qiáng)吸附組分,L-谷氨酸和鹽分布在FZ3為弱吸附組分,而提取液在FZ1收集,剩余液在FZ3收集。因此通過SSMB色譜分離后,可以得到色氨酸富集的提取液以及鹽和谷氨酸富集的剩余液,從而達(dá)到L-色氨酸提純的目的。

圖7 各組分在各個柱子內(nèi)的分離曲線圖Fig.7 Separation profile for each component on columns

SSMB色譜分離實驗收集得到的提取液與由離子交換法制備得到的樣品進(jìn)行比較,結(jié)果如表3所示。通過SSMB分離以后,L-色氨酸的純度(質(zhì)量含量)從30%提純到80%左右,純度略高于離子交換法制備得到的產(chǎn)品,pH和電導(dǎo)率均明顯底于離子交換法制備得到的產(chǎn)品。尤其是pH和電導(dǎo)率遠(yuǎn)低于離交樣品,其主要原因是離交樣品中有過量的氨水,因此在工業(yè)生產(chǎn)中,離子交換后的樣品都需要進(jìn)行脫氨除去多余的氨再結(jié)晶,否則會影響結(jié)晶的收率。

此外采用SSMB連續(xù)色譜法L-色氨酸收率達(dá)到99%,高于93%～95%離交收率。L-谷氨酸去除率達(dá)到100%,高于離交法。總的來說SSMB色譜分離得到的L-色氨酸產(chǎn)品質(zhì)量及收率明顯優(yōu)于離子交換法得到的產(chǎn)品質(zhì)量,SSMB色譜法氨水消耗量也低于離子交換法。

表3 SSMB及離子交換法分離得到L-色氨酸產(chǎn)品分析結(jié)果Table 3 Analytical result for product purified by SSMB and IEX

3 結(jié)論

本文首次利用芳香族氨基酸——L-色氨酸α-氨基的離子交換性能以及側(cè)鏈基團(tuán)上苯環(huán)的疏水性能共同作用,以氨水作為洗提液,篩選得到了一種對L-色氨酸有很強(qiáng)的吸附作用力而對L-谷氨酸基本沒有吸附能力的樹脂,并且采用連續(xù)色譜分離模式——連續(xù)上樣、連續(xù)洗脫提純L-色氨酸,獲得良好的分離效果。從實驗結(jié)果來看,色譜工藝純化得到的L-色氨酸產(chǎn)品質(zhì)量明顯優(yōu)于離交產(chǎn)品,收率比離交工藝高5%～7%,而氨水消耗低于離交工藝,此外色譜工藝得到的L-色氨酸產(chǎn)品不需要額外的脫氨步驟。采用SSMB技術(shù)進(jìn)行連續(xù)分離提純,該工藝只采用一種洗提液進(jìn)行L-色氨酸吸附解析,和傳統(tǒng)離子交換繁瑣的工藝步驟相比,工藝操作更為簡單。因此色譜工藝無論從工藝操作和控制的復(fù)雜性以及產(chǎn)品質(zhì)量和運行成本都優(yōu)于傳統(tǒng)離子交換工藝,作為L-色氨酸分離純化的新型工藝可以取代傳統(tǒng)離交工藝,降低L-色氨酸工業(yè)化生產(chǎn)成本。

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Study on innovated continuous chromatographic process to separate L-tryptophan

SHEN Chun-juan1,2,3,SHEN Quan1,ZHAO Li-ming3,*

(1.Novasep Asia Co.,Ltd.,Shanghai 201203,China; 2.School of Life Science,Fudan University,Shanghai 200433,China; 3.School of Bioengineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

The separation and purification of L-tryptophan fermentation broth is an important factor forthe production cost of L-tryptophan industry.This study is aiming to develop an innovative chromatographic process to isolate L-tryptophan from fermentation broth in order to reduce the purification cost and increase the recovery of L-tryptophan. Continuous chromatographic process for L-tryptophan separation was set up by use of resin screening and sequential simulated moving bed(SSMB)technology. Based on dynamic capacity of L-tryptophan on different resin,cation IEX resin of Applexion XA2014-22 was selected as the best one with dynamic capacity of 120 g L-Trp/L resin. After SSMB separation,80% purity of L-tryptophan was obtained starting from 30% purity of raw material with selected resin and eluent by elution test. The final yield of L-tryptophan reached 99%,and all of the glutamic acid of raw material was removed.Compared with the traditional ion exchange process,this study provided an effective and economical technology for the separation and purification of L-tryptophan in industrial production.

L-tryptophan;sequential simulated moving bed;absorption;recovery

2016-10-11

沈春娟(1977-)，女，碩士，研究方向：分離純化，E-mail：sanndy.SHEN@novasep.com。

*通訊作者:趙黎明(1977-)，男，博士，教授，研究方向：分離純化技術(shù)、食品加工技術(shù)，E-mail:zhaoliming@ecust.edu.cn。

TS201.1

B

1002-0306(2017)08-0290-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.048