李志君,萬紅焱,顧麗莉,韓 毅,鄭亞麗,張夢(mèng)曉,劉文婷

(昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,云南昆明 650500)

草果多酚物質(zhì)提取及LC-MS/MS分析

李志君,萬紅焱,顧麗莉*,韓 毅,鄭亞麗,張夢(mèng)曉,劉文婷

(昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,云南昆明 650500)

對(duì)提油后的草果粉末進(jìn)行了多酚提取工藝優(yōu)化,多酚成分分析及抗氧化活性研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度、提取溫度進(jìn)行了四因素三水平的Box-Behnken中心組合研究,運(yùn)用Design Expert 8.06軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;利用LC-MS/MS對(duì)多酚物質(zhì)進(jìn)行定性;通過DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法檢測(cè)了草果多酚的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,草果多酚最佳提取工藝條件為:提取時(shí)間150 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇濃度60%、提取溫度67 ℃、多酚提取得率為9.69%;同時(shí),從草果中檢測(cè)出6種(原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3,5-二-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素)文獻(xiàn)已報(bào)道的多酚類物質(zhì)和4種(龍膽酸、原花青素B2、金絲桃苷、木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷)文獻(xiàn)未報(bào)道的多酚類物質(zhì);該草果多酚具有一定的DPPH、ABTS自由基清除能力,IC50值分別為42.46 μg/mL和85.47 μg/mL,且多酚濃度與其抗氧化活性正相關(guān)。

草果多酚,提取,響應(yīng)面,LC-MS/MS分析,抗氧化活性

草果(Amomumtsaoko)又名草果仁、草果子,為姜科豆蔻屬多年生常青叢生草本植物,是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用的中藥材,廣泛分布于我國(guó)云南、廣西、貴州、四川等地[1-4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)草果的研究主要集中于揮發(fā)油的提取和成分分析,而對(duì)草果多酚的研究少之又少,特別是對(duì)提取揮發(fā)油后的草果粉末沒有進(jìn)一步利用,造成原料的浪費(fèi)。關(guān)于植物中多酚提取的研究很多,常用的提取方法有超臨界流體萃取、微波萃取、傳統(tǒng)溶劑提取等。超臨界流體萃取操作條件穩(wěn)定,沒有溶劑殘留,安全環(huán)保,但提取率較低,設(shè)備成本高;微波萃取雖然提取率高,但對(duì)設(shè)備要求高,生產(chǎn)成本也相對(duì)較高;傳統(tǒng)溶劑提取法對(duì)設(shè)備要求低,操作簡(jiǎn)單,提取效果穩(wěn)定,已廣泛用于科研和實(shí)際生產(chǎn)中。所以本實(shí)驗(yàn)采用一定濃度的乙醇溶液提取草果中的多酚類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用精度高、周期短的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法[5]優(yōu)化了超臨界流體萃取揮發(fā)油后的草果粉末中多酚的提取工藝,并利用高效液相色譜儀及Q ExactiveTMFocus組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀對(duì)其多酚成分進(jìn)行定性分析,還通過DPPH、ABTS自由基清除率及SPSS 19.0軟件對(duì)多酚的抗氧化活性進(jìn)行研究。研究?jī)?nèi)容為多酚類物質(zhì)提供了新的來源,也為抗氧化劑的開發(fā)提供了一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草果 云南省怒江州瀘水縣;乙腈、甲醇(色譜純) 默克股份兩合公司;乙醇、沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽等 均為分析純。

Ultimate3000液相色譜儀、Q ExactiveTMFocus質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Scientific;LXJ-ⅡB高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HH-4電熱恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;BSA224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;RHP-600高速多功能粉碎機(jī) 浙江榮浩工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制0、20、40、60、80 和 100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[6],分別取上述不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL,加入20%的福林酚試劑2.5 mL,搖勻,靜置5 min,加入7.5 g/100 mL的碳酸鈉溶液2 mL,室溫下避光反應(yīng)60 min后,用分光光度計(jì)于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度值Y與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度X(μg/mL)之間的回歸關(guān)系為:Y=0.0061X+0.0314,R2=0.9981。

1.2.2 草果果實(shí)多酚的提取 草果果實(shí)于40 ℃下烘干至恒重,粉碎后過50目標(biāo)準(zhǔn)篩,然后進(jìn)行超臨界CO2提油實(shí)驗(yàn),具體工藝參照本課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)[7]。本實(shí)驗(yàn)稱取經(jīng)超臨界CO2流體萃取揮發(fā)油后的草果粉末0.2 g,按照一定的提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度、提取溫度進(jìn)行溶劑提取后,離心取上清液進(jìn)行多酚含量測(cè)定,并計(jì)算多酚提取得率。

草果果實(shí)多酚提取得率的計(jì)算公式:

式(1)

式中:E為草果多酚的提取得率(%);c為提取液中草果多酚的含量(g/mL);v為樣品液定容的體積(mL);n為提取液的稀釋倍數(shù);m為草果粉末質(zhì)量(g)。

1.2.3 草果果實(shí)多酚提取的單因素實(shí)驗(yàn) 采取漸變式優(yōu)化法,分別研究提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度和提取溫度對(duì)草果果實(shí)多酚提取得率的影響。具體實(shí)驗(yàn)步驟為:在料液比1∶25 g/mL、乙醇濃度60%、提取溫度70 ℃的條件下,研究提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)草果多酚提取得率的影響;在提取時(shí)間120 min、乙醇濃度60%、提取溫度70 ℃的條件下,考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL)對(duì)草果多酚提取得率的影響;在提取時(shí)間120 min、料液比1∶35 g/mL、提取溫度70 ℃的條件下,考察乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)草果多酚提取得率的影響;在提取時(shí)間120 min、料液比 1∶35、乙醇濃度50%的條件下,考察溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對(duì)草果多酚提取得率的影響。

1.2.4 草果果實(shí)多酚提取的響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Design-Expert 8.0.6軟件[8],根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理,選取溫度(℃)、萃取時(shí)間(min)、料液比(g/mL)、乙醇濃度(%)四個(gè)因素為自變量,以草果提取液中的多酚含量為指標(biāo)設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.2.5 草果果實(shí)多酚的定性研究 色譜條件:色譜柱為Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 m,美國(guó)Thermo Fisher公司);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈溶液,流速200 μL/min;進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序:0.00～1.00 min,95% A;1.00～15.00 min,95% A～40% A;15.00～16.00 min,40% A～5% A;16.00～17.00 min,5% A;17.00～18.00 min,5% A～95% A;18.00～20.00 min,95% A。

質(zhì)譜條件:離子化方式:電噴霧電離負(fù)離子模式(ESI-);噴霧電壓:3.2 kV;蒸發(fā)溫度:350 ℃;離子傳輸管溫度280 ℃;鞘氣(N2)壓力為30 bar;掃描范圍:m/z 100～1000,掃描分辨率:35000。碎裂方式:高能量碰撞(CID),能量35%。

1.2.6 草果果實(shí)多酚的抗氧化活性的測(cè)定 參照Blois[9]測(cè)定DPPH自由基清除能力、Re[10]測(cè)定ABTS自由基清除能力的方法,測(cè)定草果果實(shí)多酚提取液的抗氧化活性。以VC做陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次,各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)均用Origin 8.5軟件處理作圖。運(yùn)用Design Expert 8.06軟件和SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)草果多酚提取得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示,多酚提取得率隨提取時(shí)間增加而上升,在120 min達(dá)到最大值(8.62%)后,繼續(xù)增加提取時(shí)間,多酚提取得率卻有所下降。這說明,在一定范圍內(nèi)增大提取時(shí)間有利于草果中多酚物質(zhì)充分溶解于提取液中,但提取時(shí)間過長(zhǎng),可能使得浸出的多酚物質(zhì)被氧化或被降解[11],從而導(dǎo)致多酚提取量的降低。因此采用120 min為最佳提取時(shí)間。

圖1 提取時(shí)間對(duì)草果多酚提取得率的影響Fig.1 Effect of time on extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko

2.1.2 料液比對(duì)草果多酚提取得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,隨著料液比減小,多酚提取得率不斷增加,主要是因?yàn)闇p小料液比在一定程度上提高了傳質(zhì)推動(dòng)力[12]。當(dāng)料液比達(dá)到1∶35 g/mL之后,多酚提取得率開始下降,說明多酚物質(zhì)在提取液中的溶解度已基本達(dá)到飽和,繼續(xù)減小料液比,多酚提取量也許會(huì)增加,但其提取得率卻會(huì)減少。由此選取1∶35 g/mL為最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)草果多酚提取得率的影響Fig.2 Effect of ratio of solvents to raw material on extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko

2.1.3 乙醇濃度對(duì)草果多酚提取得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,隨著提取液中乙醇濃度的增加,草果多酚的提取得率先增加后減少,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí),多酚提取得率最高。這是因?yàn)椴莨卸喾宇愇镔|(zhì)多以氫鍵與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)形成穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu),乙醇濃度過低,不足以破壞草果中多酚類物質(zhì)與其它物質(zhì)的氫鍵或其它作用力,多酚提取液的含量低[13]。若乙醇濃度過高,脂溶性成分溶出過多,不利于多酚類物質(zhì)的溶解,也會(huì)降低多酚提取得率。因此選擇50%為最佳乙醇濃度。

圖3 乙醇濃度對(duì)草果多酚提取得率的影響Fig.3 Effect of concentration of ethanol on extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko

2.1.4 提取溫度對(duì)草果多酚提取得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。隨著溫度升高,草果多酚提取得率先增大后減小,當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí),多酚含量達(dá)到最大值。溫度升高,多酚物質(zhì)的溶解度和在提取液中的擴(kuò)散系數(shù)增加,其提取得率增加,但溫度過高,會(huì)造成多酚物質(zhì)一定程度的降解[14],特別是當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí),提取液沸騰蒸發(fā),損失很大。因此選擇60 ℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)草果多酚提取得率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得響應(yīng)值多酚提取得率(Y)與4個(gè)因素二次多項(xiàng)式的回歸模型為:Y=9.09-0.012A+0.52B-0.42C-0.62D-8.455×10-3AB-0.27AC+0.36AD+0.37BC+0.66BD-0.95CD-0.41A2-0.11B2-0.27C2-0.55D2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注:**表示影響極顯著(p≤0.01);*表示影響顯著(p<0.05)。

由表3可知,模型方程一次項(xiàng)B、C、D項(xiàng)極顯著,A項(xiàng)不顯著,且從F值看出影響因素的大小順序?yàn)?D>B>C>A,即乙醇濃度>時(shí)間>料液比>溫度;二次項(xiàng)A2、C2、D2極顯著,B2不顯著;交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD、CD極顯著,AB不顯著,A、B、C、D及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響見圖5。

如圖5所示,對(duì)各因素做響應(yīng)面圖與等高線圖可看出,料液比和溫度、乙醇濃度和溫度、料液比和時(shí)間、乙醇濃度和時(shí)間、乙醇濃度和料液比的響應(yīng)面圖中曲線較陡且等高線圖接近橢圓,說明交互作用對(duì)提取效果的影響均較顯著;溫度和時(shí)間的響應(yīng)面圖中曲線較平滑且等高線圖接近圓形,說明交互作用對(duì)草果中多酚提取量影響不顯著,這與回歸分析的結(jié)果吻合。

圖5 兩因素間的交互作用對(duì)多酚提取得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the yield of polyphenol

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件,以草果中多酚提取得率較大為目標(biāo),得出優(yōu)選實(shí)驗(yàn)條件為:提取溫度67.39 ℃、提取時(shí)間150 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇濃度60%,在此條件下,多酚提取得率可達(dá)到9.94%。在最佳條件下(參數(shù)調(diào)整為提取溫度67 ℃、時(shí)間150 min、料液比1∶30、乙醇濃度60%)平行實(shí)驗(yàn)三次,得出的提取得率平均值為9.69%±0.33%,和上述模型預(yù)測(cè)出的值接近,實(shí)際測(cè)得的提取得率與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差為2.5%,因此采用響應(yīng)面法得到的最佳條件準(zhǔn)確可靠。

2.3 草果多酚的定性研究

目前,草果中已報(bào)道[16]的多酚類物質(zhì)總共有9種,包括:原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3,5-二-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、2-甲氧基-1,4-二苯酚-1-O-[6-O-(3-甲氧基-4-羥基苯甲?；?]-β-D-吡喃葡萄糖苷、鄰苯二酚、鄰苯三酚。

表4 多酚化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 4 Mass spectrometric data of polyphenol compounds

注:S:確定的多酚種類;G:猜測(cè)所含多酚種類。

通過質(zhì)譜圖譜檢索可得到前6種多酚類物質(zhì),同時(shí)發(fā)現(xiàn)了4種草果果實(shí)中可能存在的未經(jīng)報(bào)道過的多酚類物質(zhì),見表4。

S1:Protocatechuic acid碎片離子153.01808與張協(xié)光等[17]所報(bào)道一致(千分位);碎片離子108.02022與報(bào)道109.02895不完全相符,推測(cè)是其在質(zhì)譜負(fù)離子模式下脫去一個(gè)質(zhì)子得到的,并且從分子結(jié)構(gòu)方面考慮,Protocatechuic acid脫去羧基即可得到碎片離子108.02022。

S2:P-hydroxy benzoic acid碎片離子137.02309及93.03310與宓捷波等[18]所報(bào)道一致(千分位),且王暐等[16]曾報(bào)道過,草果中含有P-hydroxy benzoic acid,因此判斷S2為P-hydroxy benzoic acid。

表5 四種新物質(zhì)碎片離子峰的歸屬與說明Table 5 Fragment peak assignment and commentin of four new polyphenols

表6 多酚提取液對(duì)DPPH和ABTS自由基清除率的回歸結(jié)果Table 6 Regression results of DPPH and ASTS radical scavenging activities of polyphenol

圖7 草果多酚和VC的ABTS自由基清除能力Fig.7 ABTS radical-scavenging activities of VC and polyphenols from Amomum tsaoko

LC-MS/MS分析確定了草果果實(shí)中6種多酚類物質(zhì),同時(shí)發(fā)現(xiàn)4種可能存在未經(jīng)報(bào)道過的多酚類物質(zhì);另外,實(shí)驗(yàn)證明草果多酚還具有一定的DPPH自由基與ABTS自由基清除能力,且多酚濃度與其抗氧化活性正相關(guān)。

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S3:Vanilloid二級(jí)碎片離子123.00747;108.02013與張協(xié)光等[17]所報(bào)道一致(千分位),而碎片離子152.01004與宓捷波等[18]所報(bào)道一致(千分位),說明此三個(gè)碎片離子都是PVanilloid的二級(jí)碎片離子,而且是第一次同時(shí)被檢測(cè)出。因此判斷S3為Vanilloid。

S4:Rutin二級(jí)碎片離子271.02518;300.02713與孔祥虹等[19]所報(bào)道一致,碎片離子301.03381與李辰辰等[20]所報(bào)道一致。且一級(jí)碎片離子609.14624與文獻(xiàn)均一致。因此判斷S4為Rutin。

S5:Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside碎片離子463.08774和301.03308與王暐等[16]報(bào)道過的一致。另外,推測(cè)碎片離子301.03308是由碎片離子463.08774失去一個(gè)脫水葡萄糖而得。

S6:3,5-di-C-β-D-glucopyranosylphloretin碎片離子597.18207與王暐等[16]所報(bào)道一致;本次新測(cè)得的碎片離子417.11865是由3,5-di-C-β-D-glucopyranosylphloretin脫去一個(gè)質(zhì)子,脫去一個(gè)葡萄糖單元得到的。因此判斷S6為3,5-di-C-β-D-glucopyranosylphloretin。

根據(jù)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式及其裂解規(guī)律,分析猜測(cè)草果中可能還含有Gentisic(龍膽酸)、Procyanidin B2(原花青素B2)、Hyperoside(金絲桃苷)、Luteolin-7-O-β-D-glucoside(木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷)4種多酚類物質(zhì),其二級(jí)質(zhì)譜圖碎片離子峰的歸屬及說明見表5。

2.4 草果多酚的抗氧化活性

由圖6、圖7和表6可知,草果多酚對(duì)DPPH和ABTS自由基均有較強(qiáng)的清除能力[21-22],半抑制質(zhì)量濃度(IC50)分別為42.46 μg/mL和85.47 μg/mL。在所測(cè)濃度范圍內(nèi),草果酚類提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力均高于同濃度的VC。

圖6 草果多酚和VC的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical-scavenging activities of VC and polyphenols from Amomum tsaoko

3 結(jié)論

選用乙醇作為提取液,通過響應(yīng)面法優(yōu)化提油后草果粉末中多酚的提取工藝,得到的最佳提取條件為:提取溫度67 ℃、時(shí)間150 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇濃度60%,此條件下多酚提取得率最高為9.69%。四個(gè)因素對(duì)草果多酚提取得率的影響大小順序?yàn)?乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比>提取溫度;并利用

Extraction and LC-MS/MS analysis of the polyphenols fromAmomumtsaoko

LI Zhi-jun,WAN Hong-yan,GU Li-li*,HAN Yi,ZHENG Ya-li,ZHANG Meng-xiao,LIU Wen-ting

(College of Chemical Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Extraction processes,component analysis and antioxidant activity of polyphenols from deoilingAmomumtsaokowere studied. Based on single factor experiments,a three-level-four-factor test was arranged to optimize the factorial parameters(extraction time,ratio of solvents to raw material,concentration of ethanol and extraction temperature)by employing Box-Behnken design of response surface methodology,and Design Expert 8.06 software was used to analyze test data. Then LC-MS/MS was used for qualitative analysis of polyphenols. Finally antioxidant activities of the polyphenols were detected by DPPH and ABTS free radical scavenging assay. The optimum extraction conditions were obtained as follows,extraction time 150 min,ratio of solvents to raw materia 1∶30 g/mL,ethanol concentration 60% and extraction temperature 67 ℃. The extraction yield was 9.69% under the conditions. At the same time,six kinds(protocatechuic acid,p-hydroxy benzoic acid,vanilloid,rutin,quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside and 3,5-di-C-β-D-glucopyranosylphloretin)of polyphenols were identical with those the reported in literature,and four kinds(gentisic,procyanidinB2,hyperoside and luteolin-7-O-β-D-glucoside)of polyphenols,which had not been reported in literature,were found in the extract fromAmomumtsaoko. The polyphenol had some DPPH free radica and ABTS free radica scavenging capacity,IC50values were 42.46 μg/mL and 85.47 μg/mL respectively,and the antioxidant activity was positively correlated with polyphenol concentration.

polyphenols ofAmomumtsaoko;extraction;response surface design;LC-MS/MS analysis;antioxidant activity

2016-10-14

李志君(1992-)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物的分離與提純方面的研究，E-mail:junandxin666@163.com。

*通訊作者:顧麗莉(1963-)，女，教授，主要從事化學(xué)工程方面的研究，E-mail:liligu001@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20966004)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)08-0294-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.049