冉軍艦,孫華迪,陳曉靜,梁新紅,焦中高,趙瑞香,*

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學院新科學院,河南新鄉(xiāng) 453003; 3.中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所,河南鄭州 450009)

基于主成分與聚類分析的35個蘋果品種多酚綜合評價

冉軍艦1,孫華迪2,陳曉靜2,梁新紅1,焦中高3,趙瑞香1,*

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學院新科學院,河南新鄉(xiāng) 453003; 3.中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所,河南鄭州 450009)

為了探討蘋果品種間多酚的差異,本研究采集了35個蘋果品種為試材進行多酚種類和含量的測定,采用相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析對不同蘋果品種和多酚的關(guān)系進行綜合評價。結(jié)果表明:35個不同蘋果品種的多酚組成和含量差異明顯,部分多酚之間存在顯著相關(guān)關(guān)系;依據(jù)主成分解釋總變量和碎石圖提取了4個主成分反應(yīng)原變量75%的信息,第一主成分(Principal Component 1,PC1)主要包括金絲桃苷、原花青素B2,第二主成分(Principal Component 2,PC2)主要包括根皮苷,結(jié)合得分圖直觀地顯示了蘋果品種和多酚間關(guān)系,秦陽、嘎啦一系、嘎啦二系分布在PC1和PC2的正向區(qū)間,屬于早熟品種,短枝華冠、華星、華脆分布在PC2負向區(qū)間,屬于中熟品種,黃元帥、富士、秦冠分布在PC1負向區(qū)間,屬于晚熟品種。聚類分析將35個蘋果品種分為5類,聚類結(jié)果與主成分的得分圖結(jié)果基本一致。本實驗對不同蘋果品種中多酚進行的綜合評價為蘋果原材料的選擇和多酚的綜合利用提供理論支持。

蘋果,多酚,主成分分析,聚類分析

多酚是蘋果中重要的活性物質(zhì)[1],有多種生理功能,近年來的研究包括抗氧化活性[2-3]、抗菌消炎[4-6]、預(yù)防冠心病[7]、抗腫瘤等[8-9]。多酚類物質(zhì)與蘋果本身的品質(zhì)、感官評價有密切關(guān)系,會因成熟度、品種、地域環(huán)境、組織部位的不同而存在較大的差異[10-14]。已有學者研究了不同地區(qū)不同品種蘋果中多酚物質(zhì)的變化,Belviso等[15]分析了意大利傳統(tǒng)蘋果品種,發(fā)現(xiàn)所有蘋果中多酚含量非常豐富,其中綠原酸和根皮苷是主要酚類物質(zhì);avikin等[16]測定了巴爾干半島四個蘋果品種在不同成熟期的多酚變化,發(fā)現(xiàn)槲皮素是主要的酚類物質(zhì),而且在不同的成熟期含量變化非常大;Thompsonwitrick等[17]研究了美國弗吉尼亞州20種適合做蘋果酒的蘋果品種,發(fā)現(xiàn)黃烷三醇類物質(zhì)在部分蘋果果肉中含量較高,但在果皮中含量較低;Ceymann等[18]研究了歐洲104種蘋果的12種多酚,發(fā)現(xiàn)表兒茶素、原花青素B2和綠原酸的含量較高,并將所有品種分為黃烷三醇類和酚酸類;Muthuswamy等[19]的實驗證明,從蘋果中提取的多酚種類中,根皮苷在蘋果種子中含量最高,在果肉中含量最低,兒茶素類和羥基肉桂酸衍生物類占總酚含量的90%左右。國內(nèi)外學者的研究多集中在蘋果中多酚的變化及多酚在蘋果不同部位的分布,而對蘋果多酚綜合評價分析的系統(tǒng)研究較少。

不同的分析方法,如光譜、質(zhì)譜和其他現(xiàn)代分析方法獲得的數(shù)據(jù)進行處理時主成分分析(principal component analysis,PCA)起到了重要的作用,主成分分析通過降維處理可以揭示組分和品種之間的復(fù)雜關(guān)系[20-21],所有的數(shù)據(jù)在分析之前先進行標準化處理,使每個變量對數(shù)據(jù)及方差的影響同等而且在主成分計算的過程中起到相同的作用。聚類分析(Cluster analysis,CA)是目前數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)發(fā)展最好的分支之一,能在多維空間或模式空間發(fā)現(xiàn)隱藏的結(jié)構(gòu)[22],能利用確定的標準如歐幾里德距離和曼哈坦距離計算出所有樣品之間的相關(guān)性[23],最相似的對象是第一群體,然后原始的這些群體根據(jù)其相似度而合并[24],聚類分析可以將數(shù)據(jù)組簡化,更能直觀的看到各數(shù)據(jù)分成的每一簇的特征。

本研究主要針對35個不同品種蘋果中的多酚含量和組成進行研究,采用相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析來了解不同多酚之間的相關(guān)性以及不同蘋果品種和組分之間的關(guān)系并進行分類分析,對蘋果品質(zhì)進行綜合評判,以期為蘋果原材料的選擇和多酚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試蘋果 品種見表1,采摘于陜西省白水縣蘋果實驗站和中國農(nóng)科院鄭州果樹研究所蘋果實驗基地,采摘的樣品在分析前最多在2 ℃下儲藏一周;沒食子酸、原兒茶素、兒茶素、花青素B2、表兒茶素、根皮苷、綠原酸、槲皮素、金絲桃苷、咖啡酸和鞣花酸 購自Sigma-Aldrich;甲醇 色譜級,購自Tedia;水 色譜級,由Milli-Q系統(tǒng)純化;乙酸 分析級,購自科密歐化學試劑公司。

cp2245型分析天平 法國Sartorius公司;KQ-2500E型超聲波提取儀 昆山禾創(chuàng)(上海)儀器有限公司;R-120型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士BüCHI公司;Waters高效液相色譜 含1525二元泵、2998雙通道紫外檢測器、2707自動進樣器、Breeze色譜管理軟件等,美國Waters公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 清洗蘋果,取果皮并切成小片凍干。在打漿前加入質(zhì)量分數(shù)1%抗壞血酸防止褐變。取1 g蘋果果皮凍干粉(加入液氮研磨成粉),用30 mL的甲醇-水-乙酸(69∶30∶1)溶液超聲萃取20 min。將混合液在532×g下離心10 min,取上清過濾。將殘渣再次萃取和離心,取上清和第一次上清混合并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30 ℃旋蒸。將殘渣溶解在10 mL甲醇中供定性分析。所有的樣品溶液在使用之前4 ℃避光保存。取20 μL樣品溶液用于高效液相色譜上樣分析,在上樣之前先用0.45 μm的濾膜過濾。

1.2.2 色譜條件 儀器:裝備著一個四元液相泵,一個脫氣裝置,一個自動進樣裝置和一個二極管陣列檢測器(DAD)的Waters 2695系統(tǒng)。色譜柱:反相C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。使用Empower軟件獲得層析數(shù)據(jù)并對數(shù)據(jù)進行處理。流動相:A是體積比1%的乙酸水溶液,B是色譜甲醇。采用梯度洗脫:0～10 min,5%～30% B線性洗脫;10～25 min,30%～50% B線性洗脫;25～35 min,50%～70% B線性洗脫;35～40 min,70%～5% B線性洗脫。流速:1.0 mL/min。上樣量:20 μL。柱溫:30 ℃。

1.2.3 檢測方法的建立[25]精確地稱取1 mg標品(原兒茶素、兒茶素、花青素B2、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、金絲桃苷、根皮苷、鞣花酸、槲皮素)溶解于10 mL甲醇中作為儲備液,在4 ℃下避光保存,使用前用0.45 μm濾膜過濾。將各標品配制成不同濃度利用1.2.2色譜條件在280和320 nm雙波長下檢測并繪制標準曲線,利用標準曲線對樣品中的各單酚定性和定量。

1.2.4 主成分分析和聚類分析 對35個蘋果品種的原兒茶素、兒茶素、花青素B2、表兒茶素、根皮苷、綠原酸、槲皮素、金絲桃苷、咖啡酸和鞣花酸進行描述性統(tǒng)計分析,再進行主成分和聚類分析,聚類距離采用歐式距離平方法,聚類方法采用Ward法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行相關(guān)性統(tǒng)計分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種蘋果多酚比較

表1 蘋果品種產(chǎn)地及采摘時間Table 1 Area and harvest time of different apple varieties

利用前期建立的方法[25]對表1中35個蘋果品種中單酚進行定性定量,結(jié)果如表2所示。不同品種蘋果的多酚含量和種類有很大區(qū)別,在大部分品種中表兒茶素、根皮苷和鞣花酸的含量較高,但在黃元帥、蜜脆、短枝華冠、華脆和華星中表兒茶素含量相比較其他品種較低,嘎啦一系、嘎啦二系和秦陽中根皮苷含量相比較其他品種較低;綠原酸在部分蘋果品種中含量較高;原兒茶酸、兒茶素和咖啡酸的含量較低,但在紅勛一號中原兒茶酸含量相比較其他品種較高,紅蓋露中兒茶素含量相比較其他品種較高,短枝華冠中咖啡酸含量相比較其他品種較高。新紅星中金絲桃苷的含量遠遠高于其他品種。Guo從不同國家采摘的145個蘋果品種皮中檢測十種多酚,發(fā)現(xiàn)有很大的區(qū)別,花青素-3-半乳糖苷只在紅色的蘋果皮中檢測到,槲皮素的六種黃酮醇類衍生物在所有品種蘋果皮中都檢測到,兒茶素、表兒茶素和根皮苷所占總酚的比例約為8%～70%,含量差別很大[26];Todea從羅馬尼亞西北部產(chǎn)的7個蘋果品種中檢測兒茶素、表兒茶素和槲皮素的含量,也發(fā)現(xiàn)不同蘋果品種中多酚含量差別很大[27]。

表2 不同品種蘋果中十種多酚的含量Table 2 Content of ten polyphenols in apple fruits of different varieties

注:Pro:原兒茶酸;Cat:兒茶素;Epi:表兒茶素;Phz:根皮苷;Chl:綠原酸;Caf:咖啡酸;Ell:鞣花酸;AntB2:原花青素B2;Hyp:金絲桃苷;Que:槲皮素;nd:沒有檢測到;表3同。

表3 不同品種蘋果多酚相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of apple polyphenols from different apple varieties

注:*表示顯著相關(guān)(p<0.05),**表示極顯著相關(guān)(p<0.01)。

表4 主成分分析的總方差Table 4 Total variance of PCA

通過高效液相色譜法可以對不同品種蘋果的多酚進行定性定量,但是品種和多酚組成及其含量之間的關(guān)系還不明確,所以用以下數(shù)據(jù)分析方法進行處理。

2.2 不同蘋果品種多酚相關(guān)性分析

35個蘋果品種的多酚相關(guān)性分析見表3。表兒茶素與鞣花酸、原花青素B2、金絲桃苷極顯著正相關(guān);根皮苷與咖啡酸、鞣花酸極顯著正相關(guān),根皮苷與槲皮素顯著正相關(guān);鞣花酸與原花青素B2、金絲桃苷極顯著正相關(guān),鞣花酸與槲皮素顯著正相關(guān);原花青素B2與金絲桃苷極顯著正相關(guān);金絲桃苷與槲皮素極顯著正相關(guān)。通過相關(guān)性分析可以揭示蘋果各單體酚間密切關(guān)聯(lián)程度,測定部分指標可預(yù)測相關(guān)指標的增減趨勢,相關(guān)性越強這種趨勢越明顯。

2.3 主成分分析

主成分分析是多元統(tǒng)計中的一種數(shù)據(jù)挖掘技術(shù),利用降維的原理在保留主要變量信息的前提下選擇較少的主成分來代表原來較多的變量,公麗艷等利用主成分和聚類分析了蘋果加工品質(zhì)[28];王沛等利用主成分分析了中早熟蘋果脆片的品質(zhì)[29];吳玲芳等也利用該方法分析了葉下珠多酚部位HPLC指紋圖譜[30]。以35種蘋果中10種多酚含量為變量進行分析,主成分數(shù)目選定要滿足數(shù)據(jù)降維的目的,并盡可能得到更多信息,當累計的方差貢獻率不低于75%就可確定主成分數(shù)目。從表4可以看出前4個主成分的特征值大于1.0,累計的方差貢獻值占總方差的75.11%。

根據(jù)碎石圖(圖1)可以進一步確定主成分數(shù)目,由圖1可知前4個主成分對解釋變量的貢獻最大,結(jié)合表4確定提取4個主成分最合適,綜合了蘋果多酚的大部分信息。

圖1 碎石圖Fig.1 Screen plot

主成分的載荷矩陣旋轉(zhuǎn)之后載荷系數(shù)更接近1或者0,能夠更好地解釋和命名變量。表5是旋轉(zhuǎn)成分矩陣,采用主成分分析的提取方法和具有Kaiser標準化的正交旋轉(zhuǎn)法,旋轉(zhuǎn)在5次迭代后收斂。結(jié)果可知,根據(jù)成分矩陣結(jié)果顯示第一主成分(PC1)綜合了金絲桃苷、原花青素B2和表兒茶素含量的信息,且在第一主成分呈正向分布,即PC1正向坐標值越大,金絲桃苷、原花青素B2和表兒茶素含量越高;第二主成分(PC2)綜合了根皮苷含量的信息,且在第二主成分呈正向分布,即在PC2正向坐標值越大,根皮苷含量越高;第三主成分(PC3)綜合了綠原酸含量的信息,且在第三主成分呈正向分布,即PC3正向坐標值越大,綠原酸含量越高;第四主成分(PC4)綜合了原兒茶酸含量的信息,原兒茶酸在第四主成分呈正向分布,即PC3正向坐標值越大,原兒茶酸含量越高。

表5 旋轉(zhuǎn)成分矩陣Table 5 Rotated component matrix

根據(jù)主成分分析結(jié)果保留前兩個主成分來簡化結(jié)果,第一主成分解釋總方差的31.19%,第二主成分解釋總方差的19.01%,第一主成分和第二主成分的得分圖見圖2。

圖2 不同蘋果品種的得分圖Fig.2 Scores plot of different apple varieties注:編號對應(yīng)的蘋果品種見表1,圖3同。

圖2顯示了蘋果品種與PC1和PC2的關(guān)系,35個品種中,秦陽、嘎啦一系、嘎啦二系等早熟品種分布在PC1和PC2的正向區(qū)間,金絲桃苷、原花青素B2和表兒茶素含量較高,華星、華脆等中熟品種分布在PC2負向區(qū)間,根皮苷含量較低,黃元帥、富士一系、富士二系、秦冠分布在PC1負向區(qū)間,金絲桃苷、原花青素B2和表兒茶素含量較低。

2.4 聚類分析

對35個蘋果品種進行系統(tǒng)聚類分析,聚類距離采用歐式距離平方法,聚類方法采用Ward法,根據(jù)蘋果中多酚的類間距離進行區(qū)分,得到了蘋果樣品的聚類樹狀圖,結(jié)果如圖3所示。

圖3 系統(tǒng)樹狀圖Fig.3 Dendrogram

由圖3可以看出,當類間距離為10時,蘋果樣品分為5大類,其中秦冠、千秋、國光、粉紅女士、延風、華脆和華星是第一類,昂林、恩派、黃元帥、蜜脆、紅玉、富士一系、富士二系、澳洲青蘋、岳帥、陸奧和紅蓋露是第二類,長富二號、凱蜜歐、爵士、新新疆2號、涼香和皮諾娃是第三類,嘎啦一系、嘎啦二系、秦陽、太平洋玫瑰、玉華早富、花牛、清明、紅勛一號和茂汶是第四類,新紅星是第五類。在這五類中,第一類和第二類都是中晚熟品種,但第一類中熟品種占多數(shù),第二類晚熟品種占多數(shù),第三類是中熟品種,第四類是早熟品種,新紅星是早熟品種,但表兒茶素、原花青素B2和金絲桃苷的含量遠遠高于其他品種,具有明顯的特征性。當類間距離為15時,蘋果樣品分為3大類,第一類是中晚熟品種,第二類是早中熟品種,第三類是新紅星。聚類分析的結(jié)果與主成分分析結(jié)果對應(yīng),金絲桃苷、原花青素B2和表兒茶素在早熟品種中含量較高,根皮苷在中熟品種中含量較低,金絲桃苷、原花青素B2和表兒茶素在晚熟品種中含量較低。在這個數(shù)據(jù)分析過程中,由常見分析特征引起的樣本自然分組的這種趨勢是顯而易見的,另外,從視覺角度來說,聚類分析比主成分分析更好的捕捉化學相似性。

3 結(jié)論

多酚是蘋果中重要的功能性成分,不同蘋果品種中多酚的含量和種類差別很大,本文對35個蘋果品種的10種多酚進行檢測,發(fā)現(xiàn)在大部分蘋果品種中表兒茶素、根皮苷、和鞣花酸含量較高,原兒茶酸、兒茶素和咖啡酸的含量較低,但新紅星中金絲桃苷的含量比其他品中高出幾個數(shù)量級;各單體酚之間既相互獨立又密切相關(guān);用主成分分析法和聚類分析法對這35種蘋果進行了分類分析,提取的4個主成分反映原變量75.11%的信息,是評價蘋果多酚的特征指標,能夠代表總變量的絕大部分信息,通過第一主成分和第二主成分得分圖理清了蘋果品種和多酚組成之間的關(guān)系,不同品種蘋果多酚的差異主要在于金絲桃苷、根皮苷、鞣花酸、綠原酸等含量的變化,金絲桃苷、原花青素B2和表兒茶素作為早熟和晚熟因子,根皮苷作為中熟因子,能夠區(qū)分不同品種蘋果的成熟時期,為蘋果多酚的利用奠定基礎(chǔ)。聚類分析和主成分分析對品種分類判定結(jié)果基本一致,蘋果多酚與品種間關(guān)聯(lián)關(guān)系較為顯著。通過上述方法對不同蘋果品種進行綜合分析得到客觀的評價結(jié)果,可作為篩選品質(zhì)優(yōu)良蘋果品種的依據(jù),對開發(fā)不同種類蘋果多酚具有一定的指導(dǎo)意義。

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Comprehensive evaluation of polyphenols from 35 apple varieties based on principal component and cluster analysis

RAN Jun-jian1,SUN Hua-di2,CHEN Xiao-jing2,LIANG Xin-hong1,JIAO Zhong-gao3,ZHAO Rui-xiang1,*

(1.School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.Xinke Collge,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 3.Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,China)

The purpose of this research was to investigate the variations between apple varieties and polyphenols,varieties and contents of polyphenols from 35 apple varieties were analyzed,interrelationships between apple varieties and polyphenols were investigated by correlation,principal component(PCA)and cluster analysis(CA). Results showed that there were obvious differences between apple varieties and polyphenols,some polyphenols had the significant relationship. The first four components represented 75% of the total variability on the base of the total variance explained and screen plot of principal component analysis. The first principal component was related to hyperoside,procyanidins B2,and the second principal component was related to phloridzin. The sample score plots visually displayed the relationship between apple varieties and polyphenols. The varieties of Qinyang,Gala Ⅰand Gala Ⅱwere located on the first quadrant of the plot for PC1 and PC2,these apple varieties were early-maturing varieties,Brachyplast Huaguan,Huaxing Huacui were located on the second quadrant of the same plot,they were middle-maturing varieties,Golden Delicious,Fuji,Qinguan were located on the fourth quadrant of the same plot. CA classified 35 varieties into five main groups on the basis of the measured parameters,which was consistent with the results of PCA score plots. Comprehensively evaluated of different apple varieties and polyphenols will provide the theoretical support.

apple;polyphenols;principal component analysis(PCA);cluster analysis(CA)

2016-10-11

冉軍艦(1981-)，男，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究，E-mail：ranjunjian@126.com。

*通訊作者:趙瑞香(1966-)，女，博士，教授，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究，E-mail：zhaoruixiang103@126.com。

中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2015-ZFRI)；河南科技學院農(nóng)產(chǎn)品精深加工協(xié)同創(chuàng)新培育專項(2013)；河南科技學院科技創(chuàng)新基金(2015006)；河南科技學院高層次人才科研項目(2015016)。

TS255

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1002-0306(2017)08-0139-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.019