宋春麗,陳佳鵬,任 健

(齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

油料蛋白

殼寡糖糖基化修飾對(duì)酪蛋白分子特性及流變性質(zhì)的影響

宋春麗,陳佳鵬,任 健

(齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

研究利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化酪蛋白與殼寡糖發(fā)生糖基化交聯(lián)反應(yīng)，并控制反應(yīng)時(shí)間 (1、2 h和4 h) 制備3種糖基化交聯(lián)酪蛋白。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、傅里葉紅外光譜和游離氨基含量分析，表明酪蛋白同時(shí)發(fā)生了分子交聯(lián)和糖基導(dǎo)入反應(yīng)；經(jīng)流變學(xué)分析，表明產(chǎn)物的表觀黏度顯著提高(剪切速率為1 s-1時(shí)，反應(yīng)4 h的修飾產(chǎn)物的表觀黏度增加了約10倍)，且表現(xiàn)出剪切稀釋特性；同時(shí)，頻率掃描實(shí)驗(yàn)表明，產(chǎn)物分散液由類固體性質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)轭惲黧w性質(zhì)。

酪蛋白；糖基化；交聯(lián)；殼寡糖；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(E.C. 2.3.2.13，TGase)能夠催化蛋白質(zhì)分子中谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基中的ε-氨基發(fā)生反應(yīng)，在分子內(nèi)和/或分子間形成ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸異肽鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)[1]。其中，賴氨酸殘基能夠被伯胺類物質(zhì)取代[2]，也就是說，TGase能夠催化蛋白質(zhì)分子中的谷氨酰胺殘基與伯胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。殼寡糖是殼聚糖通過水解多聚鏈制得的低相對(duì)分子質(zhì)量糖，它的基本單位是D-氨基葡萄糖，單糖之間以β-(1,4)糖苷鍵連接[3]，而且具有較好的溶解性。利用TGase的催化特性和殼寡糖的伯胺活性，制備糖基化交聯(lián)蛋白質(zhì)，可以改變蛋白質(zhì)的某些功能性質(zhì)[4-6]，是一種新型的蛋白質(zhì)修飾技術(shù)。理論上，殼寡糖分子中親水性羥基能夠增加蛋白質(zhì)的親水性質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)具有顯著的影響。然而，目前對(duì)酪蛋白的殼寡糖的糖基化修飾，尤其是不同催化時(shí)間的產(chǎn)物的分子特性和流變特性的研究未見報(bào)道。

本研究以酪蛋白及親水性的殼寡糖為底物，通過TGase催化酪蛋白(酰基供體)與殼寡糖(?；荏w)反應(yīng)，制備糖基化交聯(lián)酪蛋白，并分析不同反應(yīng)時(shí)間所得產(chǎn)物的分子特性及流變性質(zhì)，為酶法糖基化制備功能性配料提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

酪蛋白：購于Sigma公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶：江蘇一鳴精細(xì)化工有限公司；殼寡糖(平均相對(duì)分子質(zhì)量為1 kDa，脫乙酰度≥90%)：浙江金殼生物化學(xué)有限公司；其他試劑均為分析純。

Spectrum One型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)PE公司；Kinexus pro+型高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀，英國(guó)馬爾文公司；DYY-10C型電泳儀，北京六一儀器廠；UV5100型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖基化交聯(lián)酪蛋白的制備

酪蛋白質(zhì)量濃度為50 g/L，按照?；w與酰基受體摩爾比為1∶3加入殼寡糖，TGase添加量為10 U/g(以酪蛋白質(zhì)量計(jì))，pH為7.5、37℃下恒溫振蕩，反應(yīng)時(shí)間分別為1、2 h和4 h，隨后85℃滅酶5 min，冷卻，酸沉、水洗去除未反應(yīng)的殼寡糖，將沉淀溶解并調(diào)節(jié)pH 至7.0，凍干備用。

1.2.2 糖基化交聯(lián)酪蛋白性質(zhì)的測(cè)定

1.2.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析

參照Laemmli[7]的方法，采用恒壓法電泳分析。濃縮膠、分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%和12%，進(jìn)樣量為每孔10 μL，樣品處于濃縮膠時(shí)電壓為80 V，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后加壓至120 V。電泳結(jié)束后，撥膠，膠片進(jìn)行染色和脫色。

1.2.2.2 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析

參照Sang等[8]的方法，采用溴化鉀壓片法進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，掃描波段為400～4 000 cm-1。

1.2.2.3 游離氨基含量的測(cè)定

采用Church等[9]的方法，即鄰苯二甲醛(OPA)法測(cè)定游離氨基含量。一定體積(3 mL)的樣品稀釋液與同體積的OPA試劑混合，5 min后立即測(cè)定340 nm 處的吸光值。以亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酪蛋白及其修飾產(chǎn)物中的游離氨基含量。其中，OPA試劑的配制方法為：準(zhǔn)確稱取2.00 g 十二烷基磺酸鈉，分別加入30 mL硼酸緩沖液(0.4 moL/L，pH 9.5)，1 mL質(zhì)量濃度為80 g/L的OPA乙醇溶液和200 μLβ-巰基乙醇，最后定容至100 mL，使用前配制。

1.2.2.4 流變學(xué)分析

靜態(tài)流變特性測(cè)定。用馬爾文高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)定蛋白質(zhì)分散液的表觀黏度。酪蛋白及其修飾產(chǎn)物質(zhì)量濃度均為55 g/L(pH 7.0)。測(cè)試夾具為PU60，剪切速率為1～100 s-1。

動(dòng)態(tài)流變特性測(cè)定。上述樣品低振幅振蕩測(cè)試確定樣品分散液的線性黏彈區(qū)的應(yīng)力振幅值(strain)為0.3%。在剪切頻率0.1～10 Hz范圍進(jìn)行頻率掃描實(shí)驗(yàn)，分析樣品分散液的彈性模量(G′)和黏性模量(G″)隨剪切頻率的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE分析

不同反應(yīng)時(shí)間的酪蛋白修飾產(chǎn)物(糖基化交聯(lián)酪蛋白，下同)的SDS-PAGE電泳譜圖如圖1所示。

圖1 酪蛋白修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳譜圖

由圖1可以看出，與酪蛋白相比，酪蛋白修飾產(chǎn)物的α-，β-等亞基譜帶減少；同時(shí)伴隨著形成了高相對(duì)分子質(zhì)量的肽，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)共聚物，該共聚物截留在濃縮膠和分離膠的交界處，無法進(jìn)入分離膠。電泳譜圖的分析結(jié)果顯示，TGase催化酪蛋白分子發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，形成大分子的蛋白質(zhì)共聚物。

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

根據(jù)每種分子的組成和結(jié)構(gòu)決定其獨(dú)有的紅外吸收光譜這一特性，利用紅外光譜分析酪蛋白分子的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)變化。酪蛋白及其修飾產(chǎn)物的紅外光譜圖如圖2所示。由圖2可以看出，與酪蛋白相比，酪蛋白修飾產(chǎn)物在1 050～1 150 cm-1處的伸縮振動(dòng)增強(qiáng)，而此處為C—C、C—O的伸縮振動(dòng)區(qū)和O—H的變形振動(dòng)[10]。這是由于殼寡糖中含有較多的羥基引起的。傅里葉變換紅外光譜結(jié)果表明，TGase催化殼寡糖連接到酪蛋白分子中。

圖2 酪蛋白及其修飾產(chǎn)物的紅外光譜圖

2.3 游離氨基含量的變化

酪蛋白及其修飾產(chǎn)物的游離氨基含量如圖3所示。

圖3 酪蛋白及其修飾產(chǎn)物游離氨基含量的變化

由圖3可以看出，酪蛋白修飾產(chǎn)物的游離氨基含量明顯低于原料酪蛋白。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，游離氨基含量逐漸下降，主要是由于酪蛋白分子中賴氨酸的ε-氨基參與了蛋白質(zhì)的自交聯(lián)。結(jié)果表明，TGase在催化殼寡糖導(dǎo)入酪蛋白的過程中，同時(shí)酪蛋白分子發(fā)生了自交聯(lián)反應(yīng)。同時(shí)表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的自交聯(lián)程度增加。

2.4 流變性質(zhì)分析

2.4.1 表觀黏度

表觀黏度是液態(tài)物質(zhì)的流變性質(zhì)的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，表征液體或流體中分子間的吸引力[11]。酪蛋白及其修飾產(chǎn)物的表觀黏度測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 酪蛋白及其修飾產(chǎn)物分散液的表觀黏度

由圖4可以看出，與酪蛋白相比，酪蛋白修飾產(chǎn)物分散液的表觀黏度增高，而且4 h-修飾產(chǎn)物的表觀黏度最高。此外，糖基化交聯(lián)修飾改變了分散液的流變行為，由接近牛頓流體特性轉(zhuǎn)變?yōu)榉桥ｎD流體特性(黏度隨剪切速率的增加而降低)。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的交聯(lián)會(huì)使蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量增加和體積增加[12]，進(jìn)而蛋白質(zhì)的表觀黏度會(huì)增加。隨著剪切速率逐漸增加，蛋白質(zhì)分子的表觀體積減小，酪蛋白修飾產(chǎn)物表現(xiàn)出剪切稀釋特性。而糖基的水合作用也會(huì)增加蛋白質(zhì)的表觀黏度[13]，因而糖基化交聯(lián)酪蛋白的表觀黏度顯著增加。

2.4.2 黏彈特性

彈性模量(G′)和黏性模量(G″)一定程度上可以分別用來表征樣品的類似固體和類似液體的程度[14]。酪蛋白及其修飾產(chǎn)物分散液的G′和G″隨剪切頻率的變化如圖5所示。

由圖5可以看出，在測(cè)定的振蕩頻率范圍內(nèi)，酪蛋白分散液的彈性模量高于黏性模量，表現(xiàn)出固體的特性。與酪蛋白相比，糖基化交聯(lián)酪蛋白表現(xiàn)出不同的黏彈特性，從圖5b可以看出，糖基化交聯(lián)酪蛋白在測(cè)試頻率范圍內(nèi)(0.1～10 Hz)，黏性模量較彈性模量增加或基本相同，表明糖基化交聯(lián)酪蛋白的類液體性質(zhì)表現(xiàn)得更突出。此外可以看出，不同反應(yīng)時(shí)間所得的糖基化交聯(lián)酪蛋白的黏彈性質(zhì)存在較大的差異；表明TGase在不同條件下的修飾作用會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)酪蛋白產(chǎn)品內(nèi)部結(jié)構(gòu)上的差異。

3 結(jié) 論

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能夠催化酪蛋白與殼寡糖發(fā)生糖基化交聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)顯著地改變了酪蛋白的分子特性和流變性質(zhì)。反應(yīng)過程中，酪蛋白分子發(fā)生了交聯(lián)，形成了酪蛋白聚合物，同時(shí)導(dǎo)入了殼寡糖分子。產(chǎn)物的表觀黏度顯著增加，黏彈性質(zhì)發(fā)生改變。

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Effects of oligochitosan glycation modification on molecular characteristics and rheological properties of casein

SONG Chunli, CHEN Jiapeng, REN Jian

(Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province,Qiqihar University, Qiqihar 161006, Heilongjiang, China)

Transglutaminase was used to catalyze glycation cross-linking reaction of casein and oligochitosan. Three kinds of glycation cross-linked casein were prepared by controlling reaction time of 1, 2, 4 h. The results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, Fourier infrared spectrum and analysis of free amino acid content indicated that the casein was crosslinked and glycosylated. The rheological analysis result indicated that the apparent viscosity of the product increased significantly and exhibited shear thinning behavior. The apparent viscosity of modified product obtained by reacting for 4 h increased by about ten times under the condition of shear rate 1 s-1. The frequency scan experiment showed that the product dispersion transformed from solid-like character into fluid-like character.

casein; glycosylation; cross-linking; oligochitosan; transglutaminase

2016-05-28;

2016-10-27

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(B201421)

宋春麗(1980)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)化學(xué)(E-mail)songchunlilily@sina.com。

TQ931；TS201.2

A

1003-7969(2017)03-0095-04