彭思遠(yuǎn)，曾杰宏，謝博文，劉錚凱，張 豹，呂 品，聶盛丹，蔣 波

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410005）

阻斷ErbB4受體對(duì)人膽管細(xì)胞癌QBC939細(xì)胞系增殖與轉(zhuǎn)移的影響

彭思遠(yuǎn)，曾杰宏，謝博文，劉錚凱，張 豹，呂 品，聶盛丹，蔣 波

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410005）

目的：通過體外培養(yǎng)人膽管癌QBC939細(xì)胞系，阻斷ErbB4受體，檢測(cè)腫瘤生物學(xué)行為的改變，從而探討人類第4表皮生長(zhǎng)因子（ErbB4）受體介導(dǎo)人膽管細(xì)胞癌腫瘤生物學(xué)行為的分子機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)人膽管癌QBC939細(xì)胞系細(xì)胞，分別加入終濃度為0μmol/L，1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L的AG1478阻斷膽管癌細(xì)胞ErbB4受體，使用CCK-8法測(cè)量各組膽管癌細(xì)胞增殖情況，然后利用SPSS軟件計(jì)算AG1478對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50值）；根據(jù)IC50值選擇使用0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L AG1478阻斷膽管癌細(xì)胞ErbB4受體，使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組膽管癌細(xì)胞遷移能力的變化。分別使用0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L濃度AG1478阻斷膽管癌細(xì)胞ErbB4受體，使用Transwell小室法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組膽管癌細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果：AG1478以濃度依賴方式抑制QBC939細(xì)胞增殖，其IC50值為：49.14μmol/L；AG1478抑制ErbB4受體后，膽管癌QBC939細(xì)胞的遷移、侵襲能力減弱。結(jié)論：在體外抑制ErbB4受體能使膽管癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲能力減弱；ErBb4在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，ErbB4可能成為膽管癌分子治療的新靶點(diǎn)。

膽管癌；ErbB4；增殖；侵襲

膽管癌（cholangiocarcinoma，CC）是一類起源于肝內(nèi)外膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤［1］，約占膽道惡性腫瘤的1/3，在所有消化道惡性腫瘤中所占的比例約為3%［2］。膽管癌在歐美地區(qū)較為少見［3］，但是在我國(guó)和東南亞地區(qū)發(fā)病較多。因此，膽管癌的相關(guān)研究對(duì)我國(guó)具有重要意義。根治性切除術(shù)仍是目前膽管癌的主要治療方式。盡管近年來外科技術(shù)進(jìn)步巨大，膽管癌圍手術(shù)期死亡率日益減少［4，5］，但根治切除術(shù)后預(yù)后仍然較差。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積大、肝內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤是膽管癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素［6，7］。可見在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中，其腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移對(duì)于患者的預(yù)后有重要影響。因此，研究膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，由此探討新的靶向治療方法對(duì)改善患者預(yù)后有重要意義。在本課題組的前期研究中［8］發(fā)現(xiàn) ErbB4在膽管癌組織中存在過表達(dá)，ErbB4表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。本研究擬通過體外培養(yǎng)人膽管癌QBC939細(xì)胞系，阻斷ErbB4受體，檢測(cè)腫瘤生物學(xué)行為的改變，從而探討ErbB4受體介導(dǎo)人膽管細(xì)胞癌腫瘤生物學(xué)行為的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人膽管癌細(xì)胞系QBC-939細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，由湖南省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所保存。AG1478購(gòu)自德國(guó)SIGMA公司。CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)唯贊公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)QBC-939細(xì)胞中ErbB4蛋白的表達(dá) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的QBC-939細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入4% 多聚甲醛固定10min。PBS洗滌3次，0.1% Triton X-100-PBS透化10min。PBS洗滌3次，用2% BSA 37℃孵育30min。PBS洗滌3次，ErbB4抗體（1：200稀釋）4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，用熒光標(biāo)記的二抗37℃下孵育60min。PBS洗滌3次，DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)AG1478對(duì)QBC939細(xì)胞增殖影響及IC50值 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QBC939細(xì)胞系細(xì)胞，在96孔板中配置200μL 的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，更換為含不同濃度AG1478培養(yǎng)基，每孔200μL，作為實(shí)驗(yàn)組。將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液，不添加AG1478培養(yǎng)基，作為對(duì)照組。將無細(xì)胞以及AG1478的培養(yǎng)基作為空白組。將三組每孔加入200μL新鮮配制的含CCK-8的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，用酶標(biāo)儀上以檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm測(cè)定吸光度（A）值。相對(duì)細(xì)胞存活率（%）按照下列公式計(jì)算：細(xì)胞存活率（%）=［（A實(shí)驗(yàn)-A空白）/（A對(duì)照-A空白）］×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。然后輸入對(duì)應(yīng)的濃度及細(xì)胞存活率用SPSS軟件計(jì)算IC50值。

1.2.3 劃痕法檢測(cè)QBC939細(xì)胞遷移能力 取人膽管癌QBC-939細(xì)胞系細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h至融合度為80%；然后在培養(yǎng)板中央制造相同寬度的劃痕，更換為含藥物的無血清相應(yīng)條件培養(yǎng)基處理48h至對(duì)照組細(xì)胞接近融合，于0、24、48h拍照劃痕，并計(jì)算在劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)目；設(shè)定未處理QBC-939細(xì)胞系細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為100%計(jì)算相對(duì)遷移細(xì)胞百分率：細(xì)胞遷移率（%）=條件培養(yǎng)基處理組遷移細(xì)胞均數(shù)/未處理組遷移細(xì)胞均數(shù)×100%。

1.2.4 Transwell小室結(jié)合Matrigel檢測(cè)QBC939細(xì)胞侵襲能力 取人膽管癌QBC939細(xì)胞，用含不同濃度AG1478培養(yǎng)基處理24 h；然后，取包被Matrigel基質(zhì)膠膜的Transwell小室。下室加入600 μL含10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，Transwell小室的上室內(nèi)接種含10000個(gè)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基400 μL。24 h后，用棉簽清除未侵襲通過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定膜下室面上的細(xì)胞，并進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色。在光學(xué)顯微鏡下，計(jì)數(shù)每孔通過膜侵入至下室面的細(xì)胞數(shù)目，拍照記錄。

1.2.5 Western Blot分析 取經(jīng)相應(yīng)處理的細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入500 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，刮取、收集并裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解液經(jīng)13200× g、4°C 條件下離心10 min，制備全細(xì)胞蛋白提取物。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白提取物的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。在5%（w/v）脫脂牛奶/PBST中進(jìn)行膜封閉，隨后，用實(shí)驗(yàn)材料部分描述的一抗在4°C條件下孵育過夜。用PBST洗膜3次，用過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗孵育上述PVDF膜1 h。以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS 16.0軟件，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用One Way ANOVA方式行方差分析。首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用LSD法；在方差不齊時(shí)，多組均數(shù)間比較采用Turkey's檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人膽管癌細(xì)胞系 QBC939的培養(yǎng)及ErbB4受體的表達(dá) 為了檢測(cè)ErbB4蛋白在人膽管細(xì)胞癌QBC939細(xì)胞系細(xì)胞中的表達(dá)，采用細(xì)胞免疫熒光間標(biāo)的方法。結(jié)果顯示，ErbB4蛋白在細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，且表達(dá)于細(xì)胞核外（圖1）。

圖1 人膽管癌QBC939細(xì)胞系細(xì)胞ErbB4蛋白表達(dá)的熒光顯微鏡圖像（×200）藍(lán)色圖像為細(xì)胞核，紅色信號(hào)為ErbB4蛋白

2.2 AG1478對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞系細(xì)胞增殖的影響及IC50值 為了確定AG1478對(duì)QBC939細(xì)胞產(chǎn)生作用的最佳時(shí)間和濃度區(qū)間，在藥物處理24h后，CCK-8法檢測(cè)不同濃度AG1478（1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L）對(duì)QBC939細(xì)胞存活率的影響。不同濃度AG1478對(duì)細(xì)胞存活率結(jié)果如表1所示。SPSS軟件計(jì)算IC50值為49.14μmol/L。

表1 不同濃度AG1478對(duì)細(xì)胞存活率（n=3）

2.3 AG1478對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞系細(xì)胞遷移的影響 劃痕法檢測(cè)AG1478（0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞系細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明：與未用藥物處理的QBC939細(xì)胞相比，AG1478處理后，QBC939細(xì)胞的細(xì)胞融合能力明顯減弱。

圖2 AG1478對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

劃痕法試驗(yàn)分別檢測(cè)未處理（對(duì)照）和AG1478 （25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）處理的人膽管癌細(xì)胞系細(xì)胞遷移能力。AG1478（25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）與AG1478（0μmol/L）人膽管癌細(xì)胞系細(xì)胞比較，P＜0.05

圖3 AG1478抑制膽管癌細(xì)胞遷移作用

2.4 AG1478對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞系細(xì)胞侵襲的影響 Transwell小室體外侵襲法檢測(cè)AG1478（25μmol/ L，50μmol/L和75μmol/L）對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞系細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果表明：與未用藥物處理的QBC939細(xì)胞相比，AG1478處理后，侵襲進(jìn)入膜下方的QBC939細(xì)胞明顯減少。

圖4 AG1478對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）

圖5 AG1478抑制膽管癌細(xì)胞侵襲作用Transwell小室體外細(xì)胞侵襲試驗(yàn)分別檢測(cè)未處理（對(duì)照）和AG1478 （25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）處理的人膽管癌細(xì)胞系細(xì)胞侵襲能力。AG1478（25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）與AG1478（0μmol/L）人膽管癌細(xì)胞系細(xì)胞比較，P＜0.05

3 討論

膽管癌是膽道系最常見的惡性腫瘤之一。在臨床上，根據(jù)解剖位置的不同可以分為肝內(nèi)膽管癌、肝門膽管癌以及肝外膽管癌［9］。近年來膽管癌的發(fā)病率及死亡數(shù)正逐年上升［10］，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率約為（1～10）/10萬［11］。但是，膽管癌早期診斷困難，大多數(shù)病人直到晚期出現(xiàn)了無痛性黃疸、體重下降以及膽管炎等癥狀后才被發(fā)現(xiàn)［12，13］。手術(shù)切除仍然是目前膽管癌治療的最佳方式。文獻(xiàn)報(bào)道膽管癌行早期根治性切除術(shù)，術(shù)后的5年生存率低于30%［14］。研究顯示膽管癌細(xì)胞對(duì)放化療不敏感［15］。因此，我們急需尋求新的治療方法以改善膽管癌患者的預(yù)后。分子靶向治療已成為目前膽管癌治療的研究方向。

ErbB4受體為人類第4表皮生長(zhǎng)因子受體，它屬于表皮生長(zhǎng)因子受體家族中的一員，該蛋白在正常的人體組織中有不同的表達(dá)。根據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，ErbB4蛋白在多種腫瘤組織中存在過度表達(dá)［16-18］，提示該蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但是ErbB4在膽管癌中的表達(dá)未見文獻(xiàn)報(bào)道。在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，ErbB4在膽管癌患者組織標(biāo)本中存在過表達(dá)，提示該蛋白在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。綜合上述文獻(xiàn)和前期研究結(jié)果我們得出：ErbB4在膽管癌組織中存在過表達(dá)（圖1），ErbB4表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及不良預(yù)后相關(guān)。

在本研究中CCK-8結(jié)果顯示，根據(jù)不同濃度AG1478組細(xì)胞存活率平均值，計(jì)算出的IC50值為49.14μmol/L。結(jié)果提示，阻斷ErbB4受體能使膽管癌細(xì)胞增值能力減弱。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，膽管癌細(xì)胞的遷移能力隨AG1478濃度升高逐漸減弱，提示阻斷ErbB4受體的表達(dá)能引起膽管癌細(xì)胞遷移能力減弱。為了進(jìn)一步探討阻斷ErbB4對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲能力的影響，我們進(jìn)行了Transwell小室體外細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。結(jié)果顯示，阻斷ErbB4受體的表達(dá)能引起膽管癌細(xì)胞侵襲能力逐漸減弱。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均支持我們提出的假說，即ErbB4受體能通過介導(dǎo)其下游信號(hào)通路，增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力。

綜上所述，本研究通過在體外抑制ErbB4受體，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)膽管癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲的能力明顯減弱，從而證明ErBb4在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，ErbB4可能成為膽管癌分子治療的新靶點(diǎn)。誠(chéng)然，本文僅為對(duì)細(xì)胞學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，抗ErbB4單克隆抗體相關(guān)藥物在體內(nèi)的抑瘤效果如何，這尚有待于進(jìn)一步的研究。

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Effects of blockade of ErbB4 on proliferation, migration, invasiveness in human cholangiocarcinoma QBC939 cell line

Peng Si-yuan, Zeng Jie-hong, Xie Bo-wen, Liu Zheng-kai, Zhang Bao, Lv Pin, Nie Sheng-dan, Jiang Bo
(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410005, China)

Objective Human cholangiocarcinoma QBC939 cells were cultured in vitro, blockade of ErbB4, to investigate the molecular mechanisms that ErbB4 effects on oncobiology. Methods Human cholangiocarcinoma QBC939 cells were cultured in vitro, 0μmol/L, 1μmol/L, 5μmol/L, 10μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L, 100μmol/L AG1478 were blocked ErbB4 receptor, the proliferation of cholangiocarcinoma cells were measured by CCK-8 assay, moreover, median inhibitory concentration (IC50) of AG1478 in cholangiocarcinoma cells were calculate with SPPS software. After treating with 0μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L AG1478, wound-scratch assay was used to detect the ability of migration, Transwell chamber assay was used to detectd the ability of invasiveness of cholangiocarcinoma cells. Results AG1478(0μmol/L, 1μmol/L, 5μmol/L, 10μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L, 100μmol/L) inhibited QBC939 cell proliferation, in a dose-dependent manner, IC50 value is 49.14μmol/L. After inhibiting ErbB4 receptor, the migration and invesiveness of QBC939 cells were attenuated. Conclusion After inhibiting ErbB4 receptor, the proliferation, migration and invasiveness of QBC939 cells were attenuated. The study indirectly indicates that ErbB4 may play a significant role in cholangiocarcinoma and may serve as a molecular target for anticancer therapy.

cholangiocarcinoma; ErbB4; roliferation; invasion

R735.8

A

1673-016X（2017）02-0023-04

2016-12-11

湖南省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生科研計(jì)劃資助項(xiàng)目（B2012-088）；湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（15A114）

蔣波，E-mail:jiangbo@medmail.com.cn