喻 勇，劉 攀，許瀚元，周玉凡，文世錦，彭 遷，王 瓊，申 麗，張 冉

（1.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙410013；2.泰和醫(yī)院，長沙410005）

卡介苗免疫小鼠抗體的檢測及動態(tài)分析

喻 勇1，2，劉 攀1，許瀚元1，周玉凡1，文世錦1，彭 遷1，王 瓊1，申 麗1，張 冉1

（1.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙410013；2.泰和醫(yī)院，長沙410005）

目的：研究卡介苗初次免疫和再次免疫Balb/c小鼠后，抗PPD IgG、IgM抗體的檢測，并探索其動態(tài)變化規(guī)律。方法：健康雌性Balb/c小鼠，隨機分成腹部皮內(nèi)注射BCG組和生理鹽水對照組，先后進行2次免疫。應用間接ELISA法，檢測血清中特異性抗PPD IgG、IgM抗體。 結果：自初次免疫第50天開始，抗PPD IgG抗體的總體OD值均數(shù)，BCG免疫組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。第60天再次免疫，第65天開始，抗PPD IgG抗體的總體OD值均數(shù)，其差異具有統(tǒng)計學意義，而抗PPD IgM抗體的總體OD值均數(shù)與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。結論：BCG初次免疫Balb/c小鼠后，抗PPD IgG抗體整體呈上升趨勢，再次免疫后，可在短時間內(nèi)快速上升，并在長時間內(nèi)維持一個較高水平?？筆PD IgM抗體沒有顯示動態(tài)變化。

卡介苗；抗PPD抗體；效價動態(tài)變化

引發(fā)結核病的結核分枝桿菌是一種世界范圍內(nèi)危害人類健康的主要病原菌。2016年4月份國家衛(wèi)生計生委疾病預防控制局公布的全國法定報告?zhèn)魅静“l(fā)病、死亡統(tǒng)計表顯示，肺結核的發(fā)病數(shù)是103397例，死亡數(shù)是148例，均居第二位［1］。由于結核病的早期臨床癥狀不明顯，一般的診斷方法難以在較短時間內(nèi)做出明確的診斷?，F(xiàn)在常用的結核桿菌檢測技術，無法滿足臨床診斷需求。當結核分枝桿菌感染機體后，菌體蛋白和毒素等物質(zhì)進入血液，刺激機體產(chǎn)生抗體，比如IgG、IgM等。本實驗通過檢測接種卡介苗（減毒活疫苗）后，小鼠血清抗體的動態(tài)變化，為結核病的早期臨床診斷提供實驗數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料 實驗動物為Balb/c小鼠，購自湖南斯萊克景達技術有限公司，雌鼠15只，質(zhì)量12～15g，21日齡，分籠飼養(yǎng)?？ń槊绾涂ń槊缂兊鞍籽苌铮≒PD）均購自成都生物制品研究所，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgM均購自SouthernBiotech，吸附板和明膠緩沖液均購自于Sangon Biotech。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與免疫 將實驗動物隨機分組為注射BCG 組（n = 10）和生理鹽水對照組（n =5），實驗組每只小鼠均腹部皮內(nèi)注射含有1×105CFU的卡介苗50ul，對照組注射生理鹽水50ul。以第一次免疫日期為起始時間，在第60天，進行第二次免疫。全程每隔5天采集一次血樣，共采集23次。血清分裝后置-35℃以下低溫保存。

1.2.2 用棋盤法確定最佳PPD抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù) 將PPD按照1.0ug/ul、0.6ug/ul、0.2ug/ul、0.1ug/ ul、0.05ug/ul五個稀釋濃度包板。將陽性血清按照1：100、1：400、1：800、1：1600、1：3200五個稀釋倍數(shù)加樣。酶標二抗稀釋比例為1：5000，用酶標儀在450 nm波長下檢測OD值，當陽性標本OD值/陰性對照OD值≥2.1時，并陽性對照的OD值最接近于1.0時，即為最佳PPD包板濃度和樣本的稀釋倍數(shù)。

1.2. 3 間接ELISA法檢測各次血樣中抗PPDIgM、IgG抗體 以棋盤滴定法的最佳抗原濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)包板和加樣，酶標二抗稀釋倍數(shù)為1：5000，在450 nm波長下檢測OD值。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)用One-way ANOVA進行方差分析，SNK檢驗進行顯著性分析。

2 結果

2.1 棋盤法確定最佳PPD抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù) 根據(jù)所得結果，確定最佳PPD抗原包被濃度為1ug/ml，血清最佳稀釋度1：400。

2.2 初次免疫，再次免疫后不同時間點抗PPD抗體IgG的檢測結果 在BCG初次免疫小鼠后，小鼠血清中抗PPD抗體IgG的效價整體呈緩慢上升趨勢，再次免疫后，呈快速上升趨勢。由圖1可見，在第1天到第110天，F(xiàn)=4.349， P＜0.05，按α=0.05水準，認為第1天到第110天的各個時間點，BCG免疫組與對照組之間的總體OD值均數(shù)間差異具有統(tǒng)計學意義，經(jīng)多重比較結果顯示，按α=0.05水準，從第1天到第50天的各個時間點，BCG免疫組與對照組之間的總體OD值均數(shù)差異沒有統(tǒng)計學意義，在第55天，BCG免疫組與對照組之間的總體OD值均數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義。再次免疫后，在第65天，BCG免疫組與對照組之間的總體OD值均數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義（圖1）。2.3 初次免疫，再次免疫后不同時間點抗PPD抗體IgM的檢測結果

圖1.初次免疫，再次免疫后各時間點小鼠血清中抗PPD抗體IgG的效價

小鼠血清中抗PPD IgM抗體的效價從第1天到第110天，F(xiàn)=0.386， P=0.996，按α=0.05水準，BCG免疫組與對照組之間的總體OD值均數(shù)差異沒有統(tǒng)計學意義（圖2）。

圖2 初次免疫，再次免疫后各時間點小鼠血清中抗PPD抗體IgM的效價

3 討論

我國是世界上22個結核病（tuberculosis，TB）高負擔國家之一，TB患者數(shù)量占全球 10%［2］。準確檢測和診斷是結核病的防控難點之一，當前我國常用的TB診斷方法主要分為以下5類：細菌學檢測、病理學檢測、影像學檢測、分子生物學檢測以及血清學檢測［3］。其中血清學診斷具有簡單、快速、靈敏、特異、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點，目前在臨床已廣泛應用［4］。

當抗原刺激機體免疫系統(tǒng)后，B淋巴細胞可分化增殖為漿細胞，生成各類抗體并產(chǎn)生特異性免疫應答。抗體的有無、種類、效價、以及親和力，對疾病的診斷具有診斷意義，IgG是血清和胞外液中含量最高的免疫球蛋白，是再次免疫應答的主要抗體，并且在體內(nèi)分布廣泛。IgM是當機體感染后最早出現(xiàn)的抗體，可用于疾病的早期臨床診斷。

結核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，主要誘導細胞免疫應答，但也會誘導機體產(chǎn)生抗體。在S. de Vallie `re等人的研究中，初次免疫卡介苗后，志愿者血清中特異性抗脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗體IgG會逐漸升高，間隔六個月后再次加強免疫，可誘導特異性抗脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗體IgG顯著增加［5］。國內(nèi)也有文獻報導，卡介苗免疫Balb/c小鼠和昆明鼠后，抗PPDIgG抗體水平會隨著時間的延續(xù)，呈現(xiàn)出一種緩慢上升－明顯上升－緩慢上升－明顯上升的趨勢［6］。但是，卡介苗免疫后，抗PPDIgM抗體動態(tài)變化未見相關報導。

為了探索卡介苗初次免疫和再次免疫Balb/c小鼠后，血清中抗PPDIgG、IgM抗體的動態(tài)效價變化，本實驗分別在間隔等長時間的不同時間點采集血樣，經(jīng)ELISA檢測及統(tǒng)計學分析，結果表明，與對照組相比，抗PPDIgG抗體具有動態(tài)效價變化，BCG初次免疫Balb/c小鼠后，抗PPDIgG抗體在前期上升緩慢，后期逐漸升高，整體呈上升趨勢，再次免疫后，可在短時間內(nèi)快速上升，并在長時間內(nèi)維持一個較高的效價水平。而在本實驗中，抗PPDIgM抗體在初次免疫與再次免疫的過程中，與對照組相比，均沒有顯示有意義的動態(tài)變化。

從我們了解到的臨床數(shù)據(jù)，在100例最后確診是活動性肺結核患者的血清樣本中，檢測到結核抗體IgG陽性標本31例，IgM陽性標本0例（本數(shù)據(jù)分析另文發(fā)表），此結果與本研究的實驗數(shù)據(jù)相吻合：結核分枝桿菌感染機體后，能誘導抗PPD IgG抗體的產(chǎn)生，而是否能誘導抗PPD IgM抗體的產(chǎn)生，以及IgM抗體的動態(tài)變化，其機理尚未查明，還有待于進一步探討。

綜上所述，抗PPD IgG、IgM抗體的動態(tài)變化能為臨床診斷提供相關實驗數(shù)據(jù)，無論是卡介苗的初次免疫還是再次免疫，都能引起抗PPD IgG抗體的增高，并且在再次免疫后，其效價會迅速增高，而抗PPD IgM抗體沒有顯著的效價變化。

［1］ 2016年4月全國法定傳染病疫情概況［EB/OL］. http: // www. nhfpc. gov. cn / jkj /s 3578 /201605/d6acea93dcac451e91c4b913e36f3553. shtml

［2］ WHO. Global tuberculosis report 2015 ［EB/OL］. http: //www. who. int/ tb/publications/global_report/en/. Geneva: World HealthOrganization: 2016

［3］ 李亮, 許紹發(fā). 中國結核病診療現(xiàn)狀及展望［J］. 中國實用內(nèi)科雜志, 2015, 8(35): 643-646.

［4］ 譚笑. 結核病實驗室快速診斷方法的研究［J］. 湖南師范大學學報(醫(yī)學版), 2007, 4(2): 58-59.

［5］ de Vallière S, Abate G, Blazevic A, et al. Enhancement of innate and cell-mediated immunity by antimycobacterial antibodies［J］. Infect Immun, 2005, 73(10): 6711-6720.

［6］ 武月章, 安瀟瀟, 張文慧, 等. BCG 免疫對小鼠血清特異性抗體與脾臟免疫相關細胞因子表達的影響［J］ . 吉林農(nóng)業(yè)大學學報, 2015, 37(6): 726～730.

Detection and Dynamic Analysis of Antibodies in Mice Immunized with BCG

Yu Yong1, 2, Liu Pan1, Xu Han-yuan1, Zhou Yu-fan1, Wen Shi-jin1, Peng Qian1, Wang Qiong1, Shen Li1, Zhang Ran1
(1. Hunan Normal University, Changsha 410013, China; 2. Tai He Hospital, Changsha 410005, China)

Objective To detect the PPD-specific IgG levels and IgM levels induced by BCG in mice, and explore the dynamic changes. Methods Healthy female Balb/c mice were randomly divided into groups within the abdomen intradermal injection of BCG and saline control group, and were immunized twice successively. Specific anti-PPDIgG、IgM antibodies in serum were detected by indirect ELISA. Results After the first immunization, compared with the control group, the differenceof anti-PPD IgG antibodies overall mean OD value from the 50th day was statistically significant in BCG immunized group. Reimmunization was performed onthe 60th day. The difference of anti-PPD IgG antibodies overall mean OD value in the 65th daywas statistically significant. But in the whole process of immunization, the anti-PPDIgM OD values overall mean difference was not statisticallysignificant. Conclusion After the first immunization, the titer of anti-PPD IgG antibodies was detected in a significantincrease trend. After the second immunization, the titer of anti-PPD IgG antibodies had a rapid rise in a short time, and maintained a high level for a long time. The titer of anti-PPDIgM had no dynamic changes.

BCG; anti-PPD antibody; titer dynamic changes

R446.6

A

1673-016X（2017）02-0020-03

2016-12-30

湖南省基礎醫(yī)學重點學科，國家自然科學基金青年項目

（No:81100054）；2012年湖南省普通高校教學改革研究項目

（121-0257）；湖南師范大學大學生創(chuàng)新基金（043-0094）通訊作者：張冉，E-mail:zhangran00889@aliyun.com