蘇美玲， 肖紅波， 葛雅婷， 王 艷， 黃莉敏， 熊祖應

北京大學深圳醫(yī)院腎內科，深圳 518036

血清miR-4762-5p在鑒別Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型狼瘡性腎炎中的臨床意義*

蘇美玲， 肖紅波△， 葛雅婷， 王 艷， 黃莉敏， 熊祖應

北京大學深圳醫(yī)院腎內科，深圳 518036

目的 探討血清miRNA是否能夠作為鑒別Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)病理類型的指標及其臨床意義。方法 選取60例血清標本，其中Ⅳ型LN組、Ⅳ+Ⅴ型LN組、對照組各20例。利用既往miRNA array芯片結果篩選出7個在Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN組間有差異表達的血清miRNA，采用qRT-PCR技術初步驗證芯片結果，并分析血清miRNA與LN病理類型的關系及其與臨床參數(shù)的相關性。結果 血清miR-4762-5p和miR-151a-3p在不同組間表達量存在差異性。與Ⅳ型LN組、對照組比較，Ⅳ+Ⅴ型LN組血清miR-4762-5p表達量升高(均P<0.05)；與對照組比較，Ⅳ型LN組和Ⅳ+Ⅴ型LN組血清miR-151a-3p表達量均下降(均P<0.05)。Ⅳ型LN組血清miR-4762-5p表達量與24 h尿蛋白量、腎小球濾過率呈負相關。結論 血清miR-4762-5p將有可能作為鑒別Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型LN病理類型的生物學標記。

狼瘡性腎炎； 微小RNA； 病理類型； 血清； 生物學標記

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)最常見的臟器損害，約10%～30%的LN會發(fā)展為終末期腎衰竭[1]，防治LN對改善SLE預后具有重要意義。腎組織病理類型是LN患者制定治療方案的重要依據(jù)，LN腎臟病理類型分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型(包括單純Ⅴ型、Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ+Ⅴ型)、Ⅵ型。臨床上Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型發(fā)病率高，病情相對較重，單純Ⅴ型較少見，準確診斷Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型對指導治療和發(fā)病機制研究具有重要意義。腎臟穿刺活檢病理檢查是診斷LN病理分型的金標準，然而腎活檢是有創(chuàng)性操作，有一定風險性，不易被患者接受且不適合多次重復，尋找可替代LN腎活檢的生物標志物是臨床工作的迫切要求。

miRNA是一類非編碼的RNA，能夠與靶mRNA的3′-UTR及5′-UTR區(qū)堿基互補配對，使其降解或抑制其翻譯，從而參與各種生理和病理過程[2]，被認為是理想的生物標志物[3-4]。為此，我們研究血清miRNA是否可鑒別LN病理類型。前期我們利用miRNA芯片技術初步發(fā)現(xiàn)Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN血清miRNA表達譜存在差異[5]。本研究在前期研究基礎上通過對芯片發(fā)現(xiàn)的差異性miRNA進行驗證，探討血清miRNA是否具有鑒別Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型LN病理類型的潛能。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及標本收集

共收集60份血清，包括40例LN患者血清標本和20例健康人血清標本。其中LN血清標本取自2010年1月至2015年8月在北京大學深圳醫(yī)院經(jīng)腎活檢確診為Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型的LN患者。LN組血液用無肝素真空管采集，2 500 r/min離心15 min分離血清，-80℃冰箱保存，健康對照組血清標本來源于體檢中心，其性別、年齡與LN組相匹配。健康對照組和LN組入組標準：①排除慢性疾病，如乙型病毒性肝炎、腫瘤、糖尿病等；②排除其它自身免疫疾病以及妊娠、哺乳期女性；③取標本前近1月無活動性細菌、病毒等感染；④LN患者留取樣本前3個月內未經(jīng)過免疫抑制劑及大劑量激素沖擊治療。LN分型依據(jù)2003年國際腎臟病學會/腎臟病理學會(ISN/RPS)LN分類標準。研究對象一般臨床資料見表1。其中Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN每組包括男性2例，女性18例，年齡17～54歲；健康對照組男性2例，女性18例，年齡22～46歲。3組性別、年齡兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意，所有入組者均簽訂知情同意書。

表1 研究對象一般臨床資料±s)

與Ⅳ+Ⅴ型LN組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05；“-”代表無數(shù)據(jù)；SLEDAI：系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動性評分；eGFR：腎小球濾過率

1.2 LN腎組織活動性評分標準

參考Austin評分系統(tǒng)[6]，對腎組織形態(tài)學進行半定量計分。腎臟急性活動指數(shù)(active index，AI)包括毛細血管內皮增生、白細胞浸潤、細胞性新月體、纖維素樣壞死和(或)細胞核碎裂、白金耳和(或)透明血栓、間質炎性細胞浸潤；慢性活動指數(shù)(chronic index，CI)包括腎小球硬化、纖維性新月體、間質纖維化、腎小管萎縮。評分標準：按照無病變、病變小于25%、病變在25%～50%、病變大于50%，分別記0、1、2、3分。AI中細胞性新月體、纖維素樣壞死和(或)細胞核碎裂對預后影響大，雙倍計分。AI最高24分，CI最高12分。

1.3 miRNA芯片確定差異表達miRNA

根據(jù)我們既往miRNA芯片[5]結果顯示Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型LN存在差異性表達的miRNA。在差異倍數(shù)>3(或<1/3)、P<0.05，同時miRNA芯片原始值>100基礎上，從Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型LN差異性表達的miRNA中優(yōu)先選取差異倍數(shù)大，同時miRNA芯片的原始值大者。本研究最終確定以下7種miRNA，分別是miR-664a-5p，miR-4762-5p，miR-151a-3p，miR-146a-5p，miR-21-5p，miR-130b-5p和miR-3165。

1.4 實驗方法

采用Real-time PCR技術對miRNA芯片譜結果進行驗證，具體方法如下。

1.4.1 總RNA提取 采用miR-Neasy Serum/Plasma Kit(購自美國Qiagen公司)從200 μL血清中提取總RNA，加入5倍體積的QIAzol Lysis Reagent，混勻，室溫靜置5 min。再加入3.5 μL miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control(cel-miR-39)，作為外源性內參[7-8]，余步驟嚴格按照說明書進行。最終獲得12 μL總RNA，利用紫外分光光度計測定各樣本RNA濃度。

1.4.2 反轉錄和熒光定量PCR 根據(jù)美國Qiagen公司miScript Ⅱ RT Kit操作說明進行加尾及反轉錄，反應條件：37℃ 60 min，95℃ 5 min。熒光定量PCR反應體系如下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，通用引物和上游引物各2 μL，cDNA 2 μL，不足用水補齊20 μL。7條上游引物序列由美國Qiagen公司設計合成。反應條件：95℃預變性15 min，以94℃ 15 s、55℃ 30 s和70℃ 30 s條件擴增45個循環(huán)。miRNA序列在如下網(wǎng)址查詢http：//www.mirbase.org。反應在Light Cycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀(Roche公司)上進行。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 血清miRNA的驗證結果及診斷價值

對LN組和對照組血清7個miRNA表達量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，2個miRNA(miR-4762-5p、miR-151a-3p)有差異性，其余5個miRNA無差異性。

Ⅳ+Ⅴ型LN組血清miR-4762-5p表達量顯著高于對照組(P<0.01)；Ⅳ+Ⅴ型LN組miR-4762-5p表達量顯著高于Ⅳ型LN組(P=0.005)；雖然Ⅳ型LN組表達量比對照組高，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.414)，見圖1A。Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型LN組miR-4762-5p的ROC曲線結果示，以相對定量值為1.909，其最優(yōu)敏感度及特異度分別為75%和70%，AUC=0.755(95%CI：0.604～0.906，P=0.006)，對照組、Ⅳ+Ⅴ型LN的ROC曲線AUC為0.822，見圖1B。

Ⅳ型LN組和Ⅳ+Ⅴ型LN組血清miR-151a-3p表達量均顯著低于對照組(均P<0.01)；Ⅳ型LN組表達量與Ⅳ+Ⅴ型LN組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2A)。miR-151a-3p不能用于鑒別Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN(P=0.245)，但其可用于鑒別LN組與對照組。Ⅳ型LN組和Ⅳ+Ⅴ型LN組分別與對照組比較，ROC曲線下面積分別是0.888和0.868，且均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2B。

A：血清miR-4762-5p在各組中表達散點圖，*P<0.01；B：受試者工作特征曲線和曲線下面積圖，a與b分別表示血清miR-4762-5p鑒別Ⅳ+Ⅴ型和Ⅳ型LN患者以及Ⅳ+Ⅴ型LN患者和對照組的能力圖1 血清miR-4762-5p在Ⅳ+Ⅴ型LN組、Ⅳ型LN組和對照組的表達比較Fig.1 Comparison of the expression levels of serum miR-4762-5p among groups of class Ⅳ LN，class Ⅳ+Ⅴ LN and control

A：血清miR-151a-3p在各組中表達散點圖，*P<0.01；B：受試者工作特征曲線和曲線下面積圖，a與b曲線分別表示血清miR-151a-3p鑒別Ⅳ型LN患者和對照組以及Ⅳ+Ⅴ型LN患者與對照組的能力圖2 血清miR-151a-3p在Ⅳ+Ⅴ型LN組、Ⅳ型LN組和對照組的表達比較Fig.2 Comparison of the expression levels of serum miR-151a-3p among groups of class Ⅳ LN，class Ⅳ+Ⅴ LN and control

2.2 血清miR-4762-5p表達量與臨床指標的關系

Ⅳ型LN組血清miR-4762-5p表達量與24 h尿蛋白量(r=-0.556，P=0.011)、腎小球濾過率(r=-0.466，P=0.038)呈負相關；與總膽紅素(r=0.469，P=0.037)呈正相關。Ⅳ+Ⅴ型LN組血清miR-4762-5p表達量與平均動脈壓(r=-0.511，P=0.021)、血白細胞(r=-0.515，P=0.020)、血尿素氮(r=-0.510，P=0.022)呈負相關，與血清總蛋白(r=0.455，P=0.044)呈正相關。Ⅳ型LN組和Ⅳ+Ⅴ型LN組血清miR-4762-5p表達量與疾病活動性指標，如腎臟急性活動指數(shù)、腎臟慢性活動指數(shù)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動性評分(SLEDAI)及C3、C4、抗雙鏈-DNA等均不相關(均P>0.05)；亦與C反應蛋白、紅細胞沉降率、丙氨酸氨基轉移酶、尿酸、血肌酐、血小板、血紅蛋白等不相關(均P>0.05)，見表2。

表2 血清miR-4762-5p與Ⅳ型和

SLEDAI：系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動性評分；AI：腎臟急性活動指數(shù)；CI：腎臟慢性活動指數(shù)

2.3 血清miR-151a-3p表達量與臨床指標間的關系

血清miR-151a-3p表達量在Ⅳ型LN組中僅與腎組織急性活動指數(shù)(r=-0.526，P=0.017)呈負相關；在Ⅳ+Ⅴ型LN組中與C反應蛋白(r=-0.486，P=0.030)、空腹血糖(r=-0.499，P=0.025)呈負相關，與血紅蛋白(r=0.481，P=0.032)呈正相關。余均無相關性(均P>0.05)。

3 討論

LN病理類型相關生物標志物的探索始終是臨床診斷和發(fā)病機制研究中的重要方向。有研究采用血清抗C1q抗體來評價LN病理類型[10]，但其敏感度和特異度不高，難以滿足臨床要求，目前仍無理想的診斷LN病理類型的生物標記物。miRNA在血清中的穩(wěn)定性以及在疾病狀態(tài)下表達量會發(fā)生顯著改變的特性，使得miRNA可能作為多種疾病的新型生物標記物[3-4]。也有研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與LN發(fā)病[11-12]。本研究探討了血清miRNA成為鑒別LN病理類型生物標記物的可能性及其臨床意義。

本研究結果顯示，血清miR-4762-5p表達量在Ⅳ+Ⅴ型LN組升高且與Ⅳ型LN組有差異。為進一步探索miR-4762-5p是否具備鑒別Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN的潛能，通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)AUC為0.755，且當臨界值為1.909時，其最優(yōu)敏感度及特異度分別為75%和70%，提示miR-4762-5p能較好區(qū)分Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型LN。Ⅳ型LN組血清miR-4762-5p表達量與24 h尿蛋白量、腎小球濾過率呈負相關，初步提示尿蛋白量、腎功能受損程度影響miR-4762-5p表達量。

本研究還發(fā)現(xiàn)，LN組患者血清miR-151a-3p表達量均較對照組下調，且根據(jù)LN組與對照組ROC曲線下面積(AUC>0.8，P<0.01)提示其有可能具有診斷LN潛能。已有關于miR-151a-3p的研究主要集中在腫瘤領域，研究發(fā)現(xiàn)它可促進腫瘤生長與進展[13-14]。如miR-151a-3p在肝癌中高表達增加了肝癌細胞遷移、侵襲能力[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-151a-3p在腎臟病患者腎組織和血清中也有表達。如miR-151a-3p在腎病綜合征患兒腎組織中呈現(xiàn)低表達[15]，但在血清中呈現(xiàn)高表達，血清miR-151a-3p表達水平與血清膽固醇和24 h尿蛋白量呈正相關，且在臨床緩解期間表達量下降[16]。本研究中miR-151a-3p表達水平與上述結果不一致，可能與入組疾病種類不同有關；且其在LN組中與腎組織急性活動指數(shù)、C反應蛋白相關，提示miR-151a-3p可能參與LN活動，但miR-151a-3p在LN中確切意義仍需進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型LN病理類型之間及與健康人之間均存在顯著差異的血清miRNA，血清miR-4762-5p可能具有鑒別Ⅳ和Ⅳ+Ⅴ型LN病理類型的潛能，血清miR-151a-3p可能具有鑒別診斷LN和健康人的潛能。但本研究仍存在諸多不足，如樣本量較小、病理類型不全，用于驗證實驗的miRNA較少等，未來將在本研究基礎上進一步探索。

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(2016-10-09 收稿)

本刊聲明

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Clinical Significance of Serum miR-4762-5p in Differentiating betweenClass Ⅳ and Class Ⅳ+Ⅴ Lupus Nephritis

Su Meiling，Xiao Hongbo△，Ge Yatingetal

DepartmentofNephrology，PekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036，China

Objective To explore the clinical value of serum miRNA in differentiating between class Ⅳ and class Ⅳ+Ⅴ lupus nephritis(LN).Methods The serum samples were harvested from 20 class Ⅳ LN patients，20 class Ⅳ+Ⅴ LN patients and 20 healthy individuals.According to the previous miRNA array results obtained by our team，7 serum miRNAs(miR-664a-5p，miR-4762-5p，miR-151a-3p，miR-146a-5p，miR-21-5p，miR-130b-5p，miR-3165)which were significantly different between class Ⅳ and Ⅳ+Ⅴ LN were screened out.By real-time quantitative PCR，the results of 7 miRNAs were verified.The relationship between serum miRNAs and LN pathological types or clinical indicators was analyzed.Results There were significant differences in serum miR-4762-5p and miR-151a-3p between different groups.miR-4762-5p was significantly up-regulated in class Ⅳ+Ⅴ LN group compared with the class Ⅳ LN group and the control group(P<0.05).miR-151a-3p was significantly down-regulated in both the class Ⅳ LN group and class Ⅳ+Ⅴ LN group compared with the control group(P<0.05).The expression of miR-4762-5p was negatively related to the 24-h proteinuria and glomerular filtration rate in class Ⅳ LN group.Conclusion Serum miR-4762-5p may become one of the biomarkers that can differentiate between class Ⅳ and class Ⅳ+Ⅴ LN.

lupus nephritis； microRNA； pathological type； serum； biomarker

*廣東省自然科學基金博士啟動項目(No.S2013040015040)

R593.242

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.018

蘇美玲，女，1989年生，在讀碩士，E-mail：Suml2014@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：luckyxiaohb@163.com