汪海天 張 勇 吳 寧 周 琎 杭化蓮 馬 永# 卞建民#

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院普外科1(210006) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科2

·論 著·

肝細(xì)胞核因子4α抑制人肝癌細(xì)胞株血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞小管形成*

汪海天1張 勇1吳 寧1周 琎1杭化蓮2馬 永1#卞建民1#

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院普外科1(210006) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科2

背景：肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)在肝臟的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)HNF4α與肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生相關(guān)。然而HNF4α對(duì)人肝癌細(xì)胞株血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)小管形成的調(diào)控作用尚不明確。目的：探討HNF4α對(duì)人肝癌細(xì)胞株VEGF表達(dá)和HUVEC小管形成的影響。方法：構(gòu)建過(guò)表達(dá)HNF4α的慢病毒，并轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721(實(shí)驗(yàn)組)，以轉(zhuǎn)染慢病毒空載體和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別作為陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。分別以qRT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HNF4α、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)。將HUVEC與HepG2和SMMC-7721細(xì)胞不含血清的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)，檢測(cè)小管形成數(shù)量。結(jié)果：成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)HNF4α的HepG2和SMMC-7721穩(wěn)轉(zhuǎn)株。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，HUVEC小管形成數(shù)量明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：HNF4α能明顯抑制人肝癌細(xì)胞株中VEGF表達(dá)以及HUVEC小管的形成。

肝細(xì)胞核因子4α； 癌，肝細(xì)胞； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一。目前治療方法主要包括肝切除、肝移植、腫瘤消融、化療，但總體療效不太理想。近年大量癌基因和抑癌基因功能的研究促進(jìn)了對(duì)HCC發(fā)病機(jī)制的了解，為HCC的治療提供了新思路[1]。肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)在肝臟的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)HNF4α與HCC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2-4]。血管新生是HCC發(fā)生的重要條件，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是HCC相關(guān)的血管生成因子，在HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的作用尤為突出[5-7]。本研究通過(guò)將過(guò)表達(dá)HNF4α的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721，旨在探討HNF4α對(duì)VEGF表達(dá)以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外小管形成的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，HUVEC由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS和胰酶(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，HNF4α過(guò)表達(dá)慢病毒由吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建；TRIzol試劑(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Takara公司)；GAPDH、HNF4α單克隆抗體(Abcam公司)，VEGF單克隆抗體(武漢博士徳生物工程有限公司)；Matrigel MatrixTM(BD Biosciences公司)。

二、研究方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721和HUVEC培養(yǎng)于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，HepG2和SMMC-7721細(xì)胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HUVEC使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2. 構(gòu)建人HNF4α慢病毒載體：設(shè)計(jì)合成HNF4α引物，引物上游為5’-GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACA TGC GAC TCT CCA AAA CCC TC-3’，下游為5’-TCC TTG TAG TCC ATA CCG ATA ACT TCC TGC TTG GTG ATG-3’。提取人原代肝細(xì)胞總RNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化目的基因片段。將純化的目的基因片段送吉?jiǎng)P基因公司測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒載體，包括HNF4α過(guò)表達(dá)載體和不含HNF4α的慢病毒空載體。

3. 細(xì)胞分組和處理：將HepG2和SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約30%。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染20 μL 1×108TU/mL慢病毒(MOI=10)，以轉(zhuǎn)染不含HNF4α的慢病毒空載體和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別作為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。培養(yǎng)8～12 h后棄上清，更換為2 mL新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，3～4 d后使用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。

4. qRT-PCR法檢測(cè)HNF4α和VEGF mRNA表達(dá)：取各組細(xì)胞，TRIzol試劑抽提，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)33次；72 ℃ 10 min。HNF4α、VEGF和內(nèi)參β-actin的引物序列見表1。以2-△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)。

表1 引物序列和片段長(zhǎng)度

5. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HNF4α和VEGF蛋白表達(dá)：取各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000×g離心15 min。取20 μg蛋白行8% SDS-PAGE電泳，分離，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h。分別加入GAPDH(工作濃度1∶1 000)、HNF4α(工作濃度1∶2 000)、VEGF(工作濃度 1∶200)單克隆抗體，4 ℃ 孵育過(guò)夜。加入二抗室溫孵育1 h，掃膜成像。

6. 條件培養(yǎng)基的收集：將各組細(xì)胞接種于100 mm 培養(yǎng)皿中，保證貼壁融合度為70%左右。過(guò)夜后更換為3 mL無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞上清，4 °C 800×g離心10 min，-80 ℃ 保存待用。

7. HUVEC小管形成實(shí)驗(yàn)：在預(yù)冷的96孔板中每孔加入50 μL Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min。在每孔固化的Matrigel基質(zhì)膠上加入4×104HUVEC以及100 μL條件培養(yǎng)基，然后于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 h和8 h后倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3個(gè)視野，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、過(guò)表達(dá)HNF4α的慢病毒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染情況

轉(zhuǎn)染72 h后，實(shí)驗(yàn)組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中HNF4α mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。

免疫熒光染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組中約90%的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞GFP表達(dá)陽(yáng)性(圖2)。提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功。

二、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

圖2 各組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞免疫熒光染色(×100)

三、HUVEC小管形成情況

培養(yǎng)3 h后，實(shí)驗(yàn)組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的小管數(shù)量均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)(圖4A)。培養(yǎng)8 h后，實(shí)驗(yàn)組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的小管數(shù)量均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)(圖4B)。

討 論

HNF4α在調(diào)控肝臟基因表達(dá)以及肝細(xì)胞分化方面發(fā)揮重要作用[8]。近年關(guān)于HNF4α與HCC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)關(guān)系的研究不斷增多。多項(xiàng)研究[9-10]發(fā)現(xiàn)在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型以及人肝癌組織中HNF4α表達(dá)明顯降低。HNF4α可能通過(guò)β-catenin信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細(xì)胞形成，最終抑制HCC的發(fā)生。Yao等[4]發(fā)現(xiàn)HNF4α可能通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在HCC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本課題組的前期研究[3]將過(guò)表達(dá)HNF4α的慢病毒轉(zhuǎn)染至人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)發(fā)現(xiàn)，HNF4α-MSC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移明顯受到抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)注射HNF4α-MSC的裸鼠腫瘤體積明顯小于注射MSC以及0.9% NaCl溶液的裸鼠。說(shuō)明HNF4α可明顯抑制HCC的發(fā)生。

A：mRNA表達(dá)(qRT-PCR法)；B：蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

A：培養(yǎng)3 h；B：培養(yǎng)8 h

HCC是一種血供豐富的腫瘤，其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移明顯依賴血管新生。VEGF是作用最強(qiáng)的血管生成因子之一，在HCC中明顯高表達(dá)，與手術(shù)切除后HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[7]。多項(xiàng)研究[11-13]表明HCC中VEGF表達(dá)和循環(huán)具有一定的臨床意義，血清或血漿VEGF升高可作為評(píng)估HCC的預(yù)后指標(biāo)之一。隨著分子生物學(xué)研究的深入，針對(duì)HCC的新生血管，多個(gè)具有抑制腫瘤血管生成作用的藥物正處于臨床研究中。多激酶抑制劑Sorafenib通過(guò)抑制Raf/MEK/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的激酶信號(hào)通路、VEGFR-2、VEGFR-3以及PDGFR-β來(lái)抑制細(xì)胞增殖和腫瘤血管的形成。目前該藥物已投入臨床使用，并作為進(jìn)展期HCC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[14]。抑制腫瘤血管新生已成為控制HCC的主要目標(biāo)之一。本課題的前期研究[15]證實(shí)HNF4α可抑制大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919新生血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)以HNF4α慢病毒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721，分別利用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示HNF4α過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)明顯受到抑制。以HNF4α-HepG2和HNF4α-SMMC-7721條件培養(yǎng)基處理HUVEC后，小管形成能力明顯降低。綜上所述，過(guò)表達(dá)HNF4α具有抑制HCC血管新生的作用，但具體機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究，為探索抑制HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制以及HCC的治療提供重要線索。

1 Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet, 2012, 379 (9822): 1245-1255.

2 Ning BF, Ding J, Liu J, et al. Hepatocyte nuclear factor 4α-nuclear factor-κB feedback circuit modulates liver cancer progression[J]. Hepatology, 2014, 60 (5): 1607-1619.

3 Wu N, Zhang YL, Wang HT, et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor 4α in human mesenchymal stem cells suppresses hepatocellular carcinoma development through Wnt/β-catenin signaling pathway downregulation[J]. Cancer Biol Ther, 2016, 17 (5): 558-565.

4 Yao D, Peng S, Dai C. The role of hepatocyte nuclear factor 4alpha in metastatic tumor formation of hepatocellular carcinoma and its close relationship with the mesenchymal-epithelial transition markers[J]. BMC Cancer, 2013, 13: 432.

5 Semela D, Dufour JF. Angiogenesis and hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2004, 41 (5): 864-880.

6 Fernández M, Semela D, Bruix J, et al. Angiogenesis in liver disease[J]. J Hepatol, 2009, 50 (3): 604-620.

7 Muto J, Shirabe K, Sugimachi K, et al. Review of angiogenesis in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatol Res, 2015, 45 (1): 1-9.

8 Odom DT, Zizlsperger N, Gordon DB, et al. Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors[J]. Science, 2004, 303 (5662): 1378-1381.

9 Ning BF, Ding J, Yin C, et al. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha suppresses the development of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Res, 2010, 70 (19): 7640-7651.

10 Walesky C, Edwards G, Borude P, et al. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha deletion promotes diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in rodents[J]. Hepatology, 2013, 57 (6): 2480-2490.

11 Llovet JM, Pea CE, Lathia CD, et al; SHARP Investigators Study Group. Plasma biomarkers as predictors of outcome in patients with advanced hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18 (8): 2290-2300.

12 Kaseb AO, Morris JS, Hassan MM, et al. Clinical and prognostic implications of plasma insulin-like growth factor-1 and vascular endothelial growth factor in patients with hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Oncol, 2011, 29 (29): 3892-3899.

13 Zhang W, Zhao CG, Sun HY, et al. Expression characteristics of KAI1 and vascular endothelial growth factor and their diagnostic value for hepatocellular carcinoma[J]. Gut Liver, 2014, 8 (5): 536-542.

14 Zhu AX. Systemic treatment of hepatocellular carcinoma: dawn of a new era? [J]. Ann Surg Oncol, 2010, 17 (5): 1247-1256.

15 張勇, 吳寧, 馬永, 等. 肝細(xì)胞核因子4α抑制大鼠肝癌細(xì)胞增殖、侵襲能力和新生血管生成相關(guān)基因表達(dá)[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 36 (4): 430-434.

(2016-10-21收稿；2016-11-20修回)

Hepatocyte Nuclear Factor 4α Inhibits Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Human Hepatocellular Carcinoma Cell Lines and Tube Formation of Human Umbilical Vein Endothelial Cell

WANGHaitian1,ZHANGYong1,WUNing1,ZHOUJin1,HANGHualian2,MAYong1,BIANJianmin1.

1DepartmentofGeneralSurgery,NanjingHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing(210006);2DepartmentofLiverSurgery,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai

Co-correspondence to: MA Yong, Email: yma0917@163.com; BIAN Jianmin, Email: jianminbian@163.com

Background: Hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) plays an important role in the development of liver, and studies demonstrate that it is correlated with the pathogenesis of hepatocellular carcinoma (HCC). However, the regulatory effect of HNF4α on expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human HCC cell lines and tube formation of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) is not yet clear. Aims: To investigate the effect of HNF4α on expression of VEGF in human HCC cell lines and tube formation of HUVEC. Methods: Lentiviral vector overexpressed HNF4α was constructed, and then transfected into HepG2 and SMMC-7721 cells (experimental group), cells transfected with lentiviral blank vector and cells without transfection were served as negative control group and blank control group, respectively. The mRNA and protein expressions of HNF4α, VEGF were detected by qRT-PCR and Western blotting, respectively. The conditioned media of HepG2 and SMMC-7721 cells were co-cultured with HUVEC, and number of HUVEC tube formation was measured. Results: HepG2 and SMMC-7721 cells with stable overexpression of HNF4α were successfully established. Compared with negative control group and blank control group, mRNA and protein expressions of VEGF in experimental group were significantly decreased (P<0.05), and number of HUVEC tube formation was significantly decreased (P<0.05). Conclusions: HNF4α can significantly inhibit the expression of VEGF in HepG2 and SMMC-7721 cells and tube formation of HUVEC.

Hepatocyte Nuclear Factor 4-alpha; Carcinoma, Hepatocellular; Vascular Endothelial Growth Factors; Human Umbilical Vein Endothelial Cells

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.04.003

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目(201308014)

#本文共同通信作者，馬永，Email: yma0917@163.com; 卞建民，Email: jianminbian@163.com